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Q. RT-PCR 시에 no RT control에서 band가..  |  첨부파일 첨부파일
PRIMER B 에서는 정상적인 결과가 나오나 PRIMER A 만 계속 NO rt control 에도 밴드가 뜹니다.. 제 생각엔 contamination이 된거 같은데 계속 같은 결과만 나오고 있습니다. 어떻게 해결해야 할지 감이안잡혀서 글 ...
A.  step이 늘어나 RNA만 더 깨지는것 같네요. 제 경험상... RT는 무엇보다도 제 생각이지만 RNA를 잘 뽑는게 최고인 것 같습니다. phase 분리시 RNA층 중 윗부분만 따서 쓰시는게 DNA 오염을 줄여주는 것 같습니다. ...
답변 3  |  2009.02.10
Q. oligo dt primer로 RT-PCR
이용한 RT는 보통 몇도에서 진행하나요? 저희 실험실에 RT 온도는 37도에서 1시간, 95도에서 5분, 4도씨입니다. 세팅되어 있는 상태로 진행해도 될까요? 아니면 primer TM 값에 맞춰서 해야 할까요 ...
A.  보통 kit을 사용하는데 primer 합성까지 하시는군요. enzyme data sheet를 보시고 명시된 대로 하세요. 아마도 37~50도 사이가 될듯 싶네요. anealing은 필요없습니다.
답변 2  |  2013.02.26
Q. competitive RT-PCR에 대해서?
competitive RT-PCR을 하려고 하는데, semi-quantitive RT_PCR에서는 cycle과 농도에 따른 pleature를 구해야하잖아여? 그런데, competitive RT-PCR도 그런 pleatuer를 구하여야 하나요? 저는 Takara kit를 사용하려가거든요
A.  competetive PCR은 원리상 pleatue현상과 무관하게 정량적인 실험이 가능한 것으로 알고 있습니다. 자세한 원리적인 내용은 Takara 카다로그를 참고하세요. 잘 나와 있습니다.
답변 1  |  2003.10.15
Q. RT-PCR을 할때요...saturation??
할때 남들보다 많은양을... (남들은 1ug한다더라구요) 또, RT후 2ul를 PCR하면,,,혹시 프라이머나 premix솎의 dNTP가 충분치 않아서 밴드에 변화가 보이지 않을 수도 있는거 아닌가여?? 특히 쫌 평상시에도 ...
A.  제가 즐겨보는 CSI를 보면 이런 대사가 많이 나옵니다. 에비든스를 봐라. evidence ㅋㅋ 즉 나온 사실만을 봐야지 스스로 추측해서 데이터를 만들어서는 안된다는 것이죠. 제가 전에 있던 렙에서 교수님 ...
답변 2  |  2007.08.02
Q. rt-pcrt시에 standard를 rRNA로 사용가능한가요?
박테리아로부터 rt-pcr로 특정유전자의 발현량을 알아보려고 합니다 eukaryote에서는 rt-pcr할 때는internal standard로 b-actin이나 GAPDH를 사용한다고 하네요 저는 박테리아의 16S rRNA를 standard로 사용하려는데 ...
A.  많은 양이기 때문에 비교 control로는 적합하지 않습니다. RT-PCR은 PCR과정에 RNA로 부터 reverse-transcription한 cDNA를 template로 사용한다는 것외에는 다른게 없습니다. 실험을 시작하시기에 앞서 관련책자를 ...
답변 1  |  2007.08.30
Q. RT mixture 어떻게 섞어 주시나요?
. 뭔가 그제서야 섞이는 느낌? 이더라고요.. 다른 분들은 RT할 때에 votaxing이나 pippeting으로 혼합하시나요? 아니면 저처럼 spin down만 가지고도 혼합이 잘 되나요? 어제 처음으로 RT-PCR 했는데.. band가 아.예. ...
A.  분주하는 형식으로 실험했습니다. 넣은 다음에 spin down --> vortex 살짝 --> 다시 spin down 하시는 게 좋습니다. 물론 incubation 중에 섞이긴 하겠지만, 효율의 차이가 생길 수 있습니다. 핸들링만 잘 하셨다면 ...
답변 1  |  2016.11.11
Q. RT-PCR의 template 적정량(추가질문!)
안녕하세요, RT-PCR을 하는 학생입니다. 실험실에 물어본 사람이 아무도 없고, 교수님도 결과를 내놓으라고만 하시지 방법을 알려주시지는 않네요. 1. template 적정량은? 1ug의 total RNA를 가지고 cDNA (20ul)를 ...
A.  부정확하다는 건 사실이니까요. 그래도 저 같은 경우, Northern blot으로 test를 해본 다음 같은 total RNA로 RT-PCR을 진행시켜 거의 같은 패턴으로 나오길래 RT-PCR을 사용했었습니다. 아무쪼록 도움이 되길 ...
답변 2  |  2008.04.23
Q. RT-PCR할때 anealing temp??
RT-PCR 하려고 하는데요, 보려고 하는 cytokine에 대한 anealing temp를 다른 사람들이 쓴 논문을 저널에서 찾아봤는데, 동일한 cytokine에도 온도가 각각 다 다르더군요 적정 온도는 어떻게 결정해야하는 것인지 ...
A.  대부분의 PCR조건은 50-65C 사이의 annealing temperature를 만족하도록 세팅되어 있습니다. PCR enzyme이나 PCR buffer의 조성이 그러하며, 미세한 온도의 차이, 즉 최적의 결과를 내는 온도 profile은 실험자가 결정 ...
답변 1  |  2008.08.08
Q. E-selectin(human) RT-PCR 하신분있나요 ?
혹시 E-selectin(human) RT-PCR 하시는분이거나 해보신분있나요? 해보신분있으면 조건이나.. 프라이머 (revers,forward), anneling 조건이라던가..알려주실수있나요? 논문토대로했는데 안나와서요..ㅜ
답변 0  |  2009.10.23
Q. Rare gene 을 target으로 하는 RT-PCR
잡히는데 또 어떤 셀라인은 안 잡히고하니 primer 나 RT 과정 문제가 아니고 아마 셀라인에 따른 expression level 차이로 생각되는데요 (실제로 논문에서도 많이 발현되는 CELL과 적게 발현되는 CELL의 발현정도 ...
A.  mRNA의 발현은 말씀하신대로 조직특이적이며 세포특이적입니다. PCR이라는 것이 이론상으로 one copy도 잡을 수 있습니다. Single cell PCR을 하는 경우에, PCR cycle을 60 cycle까지도 하는 경우를 본적이 있으며, ...
답변 3  |  2009.07.14
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