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실험Q&A    978건 정확도순 날짜순
Q. pET-32a 구합니다.
trxA를 이용해 recombinant를 만들기 위해 pET-32a vector가 필요합니다. 혹시, 가지고 계신분 중에서 stock을 streaking해서 주실 수 있는 분 계신가요? 연락 부탁드립니다. (whitejy04@nate.com)
A.  밑에 질문 올린 bwv988님 글을 한번 읽어보세요...
답변 1  |  2009.05.19
Q. pET vector 수율이 원래 이렇게 낮은건가요??? 도와주세요!!!
무턱대고 저번처럼 gel purify 하기도 무섭구요. 원래 pET vector 가 수율이 이렇게 낮나요??? 보통 mini kit 써서 150~200 정도 나오는데 이건 40~80 정도 밖에 안나와요; ...
A.  9이나 pBluescript 등은 copy 수가 500-700/cell 정도 됩니다.' pET는 pBR322 origin으로 copy가 20/cell정도밖에 안됩니다. 당연히 정제를 하면 양이 좀 적습니다. 하지만 아무리 그래도 1.5-3ml 배양을 miniprep하면 ...
답변 4  |  2013.02.26
Q. pET21a vector 문의드려요~
pET21a vector에 subcloning을 진행하려고 하는데요.. vector map을 보면 pET21a His-tag 부분이 Pro으로 translation되고, pET21b가 His로 translation되잖아요.. 그럼 pET21a vector의 EcoRⅠ에 insert를 ligation 시키면 his-Tag은 ...
A.  pET21a,b,c 등으로 표현되는 것은 reading frame을 맞추도록 디자인되어 있어서 그렇습니다. EcoRI에 클로닝할때 termination codon을 없애고 base를 하나, 둘, 또는 셋을 넣느냐에 따라서 HIS tag 부분이 Pro로 ...
답변 3  |  2010.07.30
Q. pET vector 발현 문의
pET22 vector를 이용하여 발현하고 있습니다. 유전자는 E.coli B-stranin에 있는 단백질입니다. (toxic 하다고 알려져 있습니다.) 1,2,3차 까지 발현 테스를 진행 했습니다.(계대를 넘겨가며..) 1,2,차까진 발현이 ...
A.  -80도에 보관합니다. 그리고 필요시 마다 꺼내 쓰세요.. pET22b에 pelB를 넣었다면, 님의 protein이 periplasmic에 들어갔을수 있으니, 이런 경우 발현량은 일반적인 cytosol 발현량에 비해 떨어집니다. 더 나아가 ...
답변 2  |  2012.08.24
Q. pET vector를 사용해서 cloning시의 수율이 안좋은 경우
copy number를 가진 경우에는 이런 고민을 하지않아도 되지만 pET으로만 진행해야하는 이유가 있기때문에 별 수가 없습니다. 위의 2가지 방법 중 어느것이 결과에 괜찮을지 조언을 얻고싶습니다. 또 pET-2 ...
A.  pET 벡터는 pBR322 ori입니다. copy #는 약 20입니다. 그래도 한번 미니프랩해서 한두번 클로닝할 만큼은 나옵니다. miniprep에 신경써보세요. 계속해서 사용해야하는 벡터라면 large prep을 해서 많이 준비해 ...
답변 2  |  2011.03.07
Q. pET32a로 cloning 시 단백질 크기  |  첨부파일 첨부파일
크기가 750bp인 DNA를 pET32a로 sucloning 하였습니다. (enzyme site - BamH/Not) pET32a의 경우 앞쪽에 Trx Tag이 있어 발현되는 단백질의 크기가 Target 32kDa+ 12kDa으로 총 48kDa이 되나 실제로 발현 시켰을 때는 32kDa에서 ...
A.  pET32a의 크기가 32kDa라는 것은 어디에서 봤나요??????? Trx와 나머지 서열 전체를 합해도 20kDa보다 작습니다 (19.64kDa). M S D K I I H L T D D S F D T D V L K A D G A I L V D F W A E W C G P C K M I A P I L D E I A D E Y Q G K L T V A K ...
답변 4  |  2013.08.21
Q. pET32 vector를 이용한 재조합 단백질에서 Trx 제거 방법이..?
만든 재조합 단백질이 계속 inclusion body로 가서 vector를 pET32로 바꿔 발현하니 soluble protein으로 발현되었습니다. 근데 이전(pET21사용)에는 항원반응이 잘 나왔는데 pET32로 바꾼 항원에서는 Trx 때문인지 ...
A.  GST나 Trx가 타겟 단백질에 직접적으로 관여를 하지 않는다면 잘라낸 다음에 분리를 하지 않아도 assay는 가능합니다만... 충분한 control sample이 있어야 신뢰가 가는 데이터가 되겠지요. 답은 영향을 줄수 ...
답변 5  |  2010.12.09
Q. pET 벡터 사용 - tag필요하지 않을 경우  |  첨부파일 첨부파일
부분 까지 붙어버릴것 같은데 이러한 문제점이 없는 pET vector나 혹은 다른 발현 vector시리즈가 있는지 궁금합니다. 제가 사용하는 제한효소는 BamH1과 Ecorl1입니다 ...
A.  현재 ORF에 종결코돈이 있으면 c-term은 문제가 없으며 n-term은 생각을 해봐야겠네요. 단백질 발현용 ORF는 제한효소를 정해놓고 vector를 선정하려면 힘듭니다. vector를 선정해 놓고 제한효소 말단을 정하 ...
답변 2  |  2020.08.06
Q. pET30a cloning..ㅜ.ㅜ
pET30a에 인설트DNA(987bp)을 클로닝하는실험을하고있습니다. 다름이아니라 cloning을하고나서 transformation을하고 결과를 보게되면 흰색의 콜로니를 확인할 수있습니다. pUC19같은경우는 X-gal을 이용해서 ...
A.  잘 기억은 안나는데요,.. pET30 시리즈에 항생제 마커가 있었던 듯 합니다. 종류는 잘 기억이;;; 한번 확인해 보세요 그리고 2cut하실때 벡터에서만 ( MCS부분내의 제한효소로 ) 하신거라면 확인하기 ...
답변 2  |  2007.05.03
Q. pET28a(+) vector에 대해 질문드려요ㅠㅠ  |  첨부파일 첨부파일
우선 pET28a(+) vector와 pET28a-C(+) vector와 같은 백터인가요? pET28a-C(+) vector에 lac operon을 가지고 있는건가요? promoter와 lac operator와 laci는 써져 있는데 다른건 없어서... expression vector이기 때문에 가지고있을꺼 ...
A.  IPTG에 의해 T7 RNA polymerase를 발현하고 이 T7 RNA polymerase가 pET의 T7 promoter를 turn-on하는 시스템입니다. Lac operon은 가지고 있지 않습니다. vector를 표기할 때 a, b, c의 꼬리표는 vector의 reading frame을 표시하는 ...
답변 1  |  2014.07.30
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