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| Q. pET-32a 구합니다. |
| trxA를 이용해 recombinant를 만들기 위해 pET-32a vector가 필요합니다.
혹시, 가지고 계신분 중에서 stock을 streaking해서 주실 수 있는 분 계신가요?
연락 부탁드립니다.
(whitejy04@nate.com) |
| A. 밑에 질문 올린 bwv988님 글을 한번 읽어보세요... |
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답변 1 | 2009.05.19 |
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| Q. pET vector 수율이 원래 이렇게 낮은건가요??? 도와주세요!!! |
| 무턱대고 저번처럼 gel purify 하기도 무섭구요.
원래 pET vector 가 수율이 이렇게 낮나요???
보통 mini kit 써서 150~200 정도 나오는데 이건 40~80 정도 밖에 안나와요; ... |
| A. 9이나 pBluescript 등은 copy 수가 500-700/cell 정도 됩니다.'
pET는 pBR322 origin으로 copy가 20/cell정도밖에 안됩니다.
당연히 정제를 하면 양이 좀 적습니다.
하지만 아무리 그래도 1.5-3ml 배양을 miniprep하면 ... |
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답변 4 | 2013.02.26 |
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| Q. pET21a vector 문의드려요~ |
| pET21a vector에 subcloning을 진행하려고 하는데요..
vector map을 보면 pET21a His-tag 부분이 Pro으로 translation되고,
pET21b가 His로 translation되잖아요..
그럼 pET21a vector의 EcoRⅠ에 insert를 ligation 시키면 his-Tag은 ... |
| A. pET21a,b,c 등으로 표현되는 것은 reading frame을 맞추도록 디자인되어 있어서 그렇습니다.
EcoRI에 클로닝할때 termination codon을 없애고 base를 하나, 둘, 또는 셋을 넣느냐에 따라서 HIS tag 부분이 Pro로 ... |
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답변 3 | 2010.07.30 |
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| Q. pET vector 발현 문의 |
| pET22 vector를 이용하여 발현하고 있습니다.
유전자는 E.coli B-stranin에 있는 단백질입니다.
(toxic 하다고 알려져 있습니다.)
1,2,3차 까지 발현 테스를 진행 했습니다.(계대를 넘겨가며..)
1,2,차까진 발현이 ... |
| A. -80도에 보관합니다. 그리고 필요시 마다 꺼내 쓰세요..
pET22b에 pelB를 넣었다면, 님의 protein이 periplasmic에 들어갔을수 있으니, 이런 경우 발현량은 일반적인 cytosol 발현량에 비해 떨어집니다. 더 나아가 ... |
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답변 2 | 2012.08.24 |
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| Q. pET vector를 사용해서 cloning시의 수율이 안좋은 경우 |
| copy number를 가진 경우에는 이런 고민을 하지않아도 되지만
pET으로만 진행해야하는 이유가 있기때문에 별 수가 없습니다.
위의 2가지 방법 중 어느것이 결과에 괜찮을지 조언을 얻고싶습니다.
또 pET-2 ... |
| A. pET 벡터는 pBR322 ori입니다.
copy #는 약 20입니다.
그래도 한번 미니프랩해서 한두번 클로닝할 만큼은 나옵니다.
miniprep에 신경써보세요.
계속해서 사용해야하는 벡터라면 large prep을 해서 많이 준비해 ... |
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답변 2 | 2011.03.07 |
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Q. pET32a로 cloning 시 단백질 크기 |  첨부파일 |
| 크기가 750bp인 DNA를 pET32a로 sucloning 하였습니다. (enzyme site - BamH/Not)
pET32a의 경우 앞쪽에 Trx Tag이 있어 발현되는 단백질의 크기가 Target 32kDa+ 12kDa으로 총 48kDa이 되나 실제로 발현 시켰을 때는 32kDa에서 ... |
| A. pET32a의 크기가 32kDa라는 것은 어디에서 봤나요???????
Trx와 나머지 서열 전체를 합해도 20kDa보다 작습니다 (19.64kDa).
M S D K I I H L T D D S F D T D V L K A D G A I L V D F W A E W C G P C K M I A P I L D E I A D E Y Q G K L T V A K ... |
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답변 4 | 2013.08.21 |
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| Q. pET32 vector를 이용한 재조합 단백질에서 Trx 제거 방법이..? |
| 만든 재조합 단백질이 계속 inclusion body로 가서 vector를 pET32로 바꿔 발현하니 soluble protein으로 발현되었습니다. 근데 이전(pET21사용)에는 항원반응이 잘 나왔는데 pET32로 바꾼 항원에서는 Trx 때문인지 ... |
| A. GST나 Trx가 타겟 단백질에 직접적으로 관여를 하지 않는다면 잘라낸 다음에 분리를 하지 않아도 assay는 가능합니다만... 충분한 control sample이 있어야 신뢰가 가는 데이터가 되겠지요.
답은 영향을 줄수 ... |
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답변 5 | 2010.12.09 |
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| Q. pET 벡터 사용 - tag필요하지 않을 경우 | 첨부파일 |
| 부분 까지 붙어버릴것 같은데
이러한 문제점이 없는 pET vector나 혹은 다른 발현 vector시리즈가 있는지 궁금합니다.
제가 사용하는 제한효소는 BamH1과 Ecorl1입니다 ... |
| A. 현재 ORF에 종결코돈이 있으면 c-term은 문제가 없으며 n-term은 생각을
해봐야겠네요.
단백질 발현용 ORF는 제한효소를 정해놓고 vector를 선정하려면 힘듭니다.
vector를 선정해 놓고 제한효소 말단을 정하 ... |
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답변 2 | 2020.08.06 |
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| Q. pET30a cloning..ㅜ.ㅜ |
| pET30a에 인설트DNA(987bp)을 클로닝하는실험을하고있습니다.
다름이아니라 cloning을하고나서 transformation을하고 결과를 보게되면
흰색의 콜로니를 확인할 수있습니다. pUC19같은경우는 X-gal을 이용해서 ... |
| A. 잘 기억은 안나는데요,..
pET30 시리즈에 항생제 마커가 있었던 듯 합니다.
종류는 잘 기억이;;;
한번 확인해 보세요
그리고 2cut하실때 벡터에서만 ( MCS부분내의 제한효소로 ) 하신거라면 확인하기 ... |
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답변 2 | 2007.05.03 |
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| Q. pET28a(+) vector에 대해 질문드려요ㅠㅠ | 첨부파일 |
| 우선 pET28a(+) vector와 pET28a-C(+) vector와 같은 백터인가요?
pET28a-C(+) vector에 lac operon을 가지고 있는건가요?
promoter와 lac operator와 laci는 써져 있는데 다른건 없어서...
expression vector이기 때문에 가지고있을꺼 ... |
| A. IPTG에 의해 T7 RNA polymerase를 발현하고 이 T7 RNA polymerase가 pET의 T7 promoter를 turn-on하는 시스템입니다.
Lac operon은 가지고 있지 않습니다.
vector를 표기할 때 a, b, c의 꼬리표는 vector의 reading frame을 표시하는 ... |
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답변 1 | 2014.07.30 |
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