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정확도순 ㅣ 날짜순
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| Q. histag 정제.. 단백질이 증발했어요 |
| histag 정제를 하는데요..
특정 단백질을 refolding해서 histag purification하면
sample flow throw, washing fraction, elution fraction, 어떤 곳에도 단백질이 없습니다. ㅎㄷㄷ
(정제 전 sample에는 명확히 one band로 있음) ... |
| A. 정제전 샘플이라면 refolding후 정제전 샘플이 맞는지요?
정제 전 샘플에서 문제가 없다면 Ni-NT bead를 샘플버퍼 넣고 끓여서 로딩해 보세요.
그리고, 확인은 Western blot (His Ab)으로 하시기를 권합니다.
양 ... |
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답변 2 | 2017.08.02 |
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| Q. Ni-NTA regeneration 이해가 안 가네요.. |
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그게 가능한가요? Imidazole과 competition하는 내 histagged 단백질은, PBS washing에 끄떡없는데 말이죠?
혹시 소중한 지식 있으시면 나눔 부탁드립니다.
*참고) resin capacity는 거의 60 mg 이었고, 그거 다 잡고 PBS ... |
| A. 약하게 붙기 때문에 PBS나 물로 washing만 해도 떨어지는 거죠.
Kd: ~His tag: ~uM, imidazole: ~mM |
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답변 8 | 2022.09.21 |
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| Q. tag 위치에 따른 발현양의 차이? |
| 되지 않는다고 생각이 들었습니다.
그래서 2차로 n terminal에 histag를 붙이는 쪽으로 해서 개시코돈 위치도 바꾸어 주었습니다.
그랬더니 발현이 되었는데 이 차이가 궁금해서 2개 tag을 다 붙여서 발현을 ... |
| A. - ATGCAGAGCCACGCCGACTCCGGTCGG
: GCC, CGG 사용빈도가 낮은것 같습니다.
이 코돈이 문제인지는 usage가 높은 codon으로 변경해 봐야지 정확히 알수
있습니다.
- C-term은 발현이 안되고 N-term을 살리면 발현이 되는 것 ... |
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답변 10 | 2022.01.05 |
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| Q. Western에서 his-tag protein을 볼 수 없는 이유들 |
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단백질량이 detection limit보다 낮아서 일까요?
아니면 histag이 사라졌을까요?
또 다른 가능성은 뭐가 있을까요?
실험 고수님들의 조언 부탁합니다 ... |
| A. 저 같으면 우선 20ug로 loading 해 보겠습니다. his의 경우에 낮은 농도에서
잘 안잡히는 경우가 있습니다. 물론 antibody 차이마다 크겠지만요.. |
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답변 3 | 2013.06.07 |
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| Q. 6Xhistag 단백질 binding 관련 질문입니다. |
| x histag 단백질을 purification 하려고합니다.
qiagen Ni-NTA column을 이용해서 진행 하고 있습니다.
기존에는 중력을 이용해서 진행했었습니다.
그리고 최근에는 FPLC를 이용해서 진행하는데 이상하게 column에 his ... |
| A. 단백질의 native strucutre, folding 등으로 인해 6x His 부위가 완전히 노출되어 있지 않을 경우, 칼럼에 약하게 붙을 수 있습니다. 따라서 flow rate이 빨라지면 결합 정도가 더 약하게 되겠지요.
1. 단백질을 ... |
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답변 1 | 2012.10.07 |
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| Q. phage display (g8p-Histag)-western 문제 |
| 먼저 M13 phage G8에 His-tag을 달아서 phage의 display가 어느정도 되는지 실험하고 있습니다.
그런데 G8-his tag display한 phage를 titer 10에 12승까지만들기 위해
PEG로 침전시켜 PBS로 현탁하여 SDS & western을 하였습 ... |
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답변 0 | 2009.12.28 |
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| Q. recombinant protein가 soluble하게 발현되지만 activity가 나오질 않아요. |
| 가서 저온에서 soluble하게 발현시키고 있구요, column을 통해 histag purification을 하고 있습니다.
Test set에서는 동일한 protocol을 통해서 activity가 어느정도는 나왔는데, 새로 키워서 추출하여 다시 해보니 ... |
| A. 발현한 단배질 활성을 잃는 경우는 원인이 너무 다양해서 뭐라고 딱 찝어드릴 수는 없을 것 같습니다.
발현자체는 잘 됬으니 E.coli 문제일 가능성은 낮다고 봅니다. 활성이 안나온 실험이 발현 온도를 ... |
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답변 1 | 2017.02.10 |
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| Q. linker 삽입 Vector pcr |
| 달아 primer를 주문하려고 합니다!
FWD) G10S1-Gene (일부)
(plasmid) Histag-------Gene
1) Vector- Histag)REV
2) Vector- histag-G10S1)REV
[질문]
1. 그렇다면 이때 REV primer는 1번과 2번 중 무엇을 사용해야하나요..?
1번 REV primer는 ... |
| A. 1. GS 를 BamHI으로 사용이 가능합니다. primer design 후 PCR해서 restriction enzyme cut 후에 ligation 해도 됩니다. primer dimer가 50도 이상에서 형성될 확률은 굉장히 낮습니다. 따라서 trouble shooting이 아니라면 고려 ... |
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답변 1 | 2022.02.28 |
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