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실험Q&A    15건 정확도순 날짜순
Q. gRNA 벡터
프로토콜에는 벡터의 V도 안보이네요. 그리고 gRNA디자인할 때 primer-target-grna scaffold에서 primer 부분 없어도 되나요 ...
A.  pRS42h의이름에 p가 붙어 있기 때문에 pRS42h가 vector 또는 plasmid입니다.
답변 1  |  2019.10.10
Q. CRISPR/Cas9 gRNA design (px260 or 334)
CRISPR gRNA design 관련 문의드리려고 합니다. gRNA를 px260 or 334 에 넣어 사용하고 싶은데요. px330 의 경우에는 23nt(PAM포함)를 넣으면 되서 http://crispr.mit.edu/ 사이트에서 확인했는데 px260는 30nt(PAM포함)를 ...
A.  저는 px260 or 334을 사용하지는 않아서 두경우의 실험결과 차이가 궁금하지만,,, 제 생각엔 px260 라면, target site gene 23nt 앞의 7nt 을 연장해서 넣으면될것 같네요.
답변 1  |  2015.06.10
Q. CRISPR plasmid vector를 제한효소로 절단 후 gRNA를 ligation할 때 ligase는 주로 무엇을 사용하시나요?
CRISPR plasmid vector를 제한효소로 절단 후 gRNA를 ligation할 때 ligase는 주로 무엇을 사용하시나요?
A.  gRNA 제작 과정에서 vector를 제한효소로 자른 후 target sequence를 삽입하는 클로닝을 말씀하시는건가요? 저는 NEB T4 DNA ligase사용했습니다.
답변 1  |  2019.03.07
Q. guide RNA annealing이나 PCR 어떻게 돌리시나요? 도와주세요!
있도록 만들어놨는데. 웃긴건 stuffer가 멀쩡히 들어간 gRNA는 PCR하면 3.2kb에서 잘 뜹니다. 근데 자르고 만든놈들은 뭘 해도 안뜹니다... 뭐가 문제인지 모르겠습니다 primer를 다시 짜야할지.. 아니면 oligo 3 ...
A.  저도 CRISPR는 약간의 경험밖에는 없습니다만.. 일반적으로 vector에 oligo를 껴 넣는 것은 아주 쉬워서 실패하기가 어려울 정도인 실험입니다. 1. Oligo를 vector에 집어 넣을 때, PNK는 필요 없는 경우가 많습 ...
답변 4  |  2016.04.24
Q. bacteria에서 CRISPR-Cas9 준비과정이 궁금합니다.
하면 되는것인지요? 3. gRNA 부위를 합성할 때 PAM (NGG) 을 gRNA 의 3'end에 포함시켜야 하는지요? 그리고 20nt 이면 충분한지 혹은 좀 더 길어도 (약 40nt) 이어도 되는지요? 4. 박테리아에서 PAM은 혹시 NGG가 아닌 ...
A.  인터넷에서 디자인 툴을 이용하는것이 좋습니다. 인터넷에 gRNA design이라고 치면 몇 사이트가 나옵니다. 이들 중에는 target off도 줄이기위한 계산까지 들어가있는것도 있을것입니다. 하지만 이것을 ...
답변 2  |  2018.03.09
Q. CRISPR/Cas9 system을 도입하려고 합니다.
gRNA를 찾아서 올리고 합성하고 Cas9 plasmid를 구입하여 gRNA를 넣으면 되는건가요??^^;;; 혹시 관련된 실험 하시는 분들 계시면 답변 부탁드립니다.. ...
A.  크리스퍼 셉업단계 랩입니다. PX335같은 vector에 짠 sgRNA를 ligation 하는데요. knock out 을 만드실거면 nickase로 하실건지 one-cut으로 하실건지요. CRISPR tool 구글에 치면 나와요 one-cut으로 하실거면 툴에 첫번째 ...
답변 3  |  2014.06.17
Q. 특정 유전자를 CRISPR/CAS9 knockout 시 에도 protein (단백질) 이 발현 하는 원인은 무었인가요?
무엇이 있을까요?? alternative splicing으로 인해 타겟한 gRNA가 잘못 된걸까요? 짧은 지식으로 원인을 찾기 어려워 답변부탁드립니다 ...
A.  단백질이 나오고 있다면 유전자가 제대로 발현되고 있는 거겠죠. 그 단백질 확인을 어떻게 했는지에 따라 다른 가설을 세울 수 있을 겁니다. antibody를 사용했다면 붙는 부위가 어딘가에 따라서 결론 ...
답변 3  |  2019.05.02
Q. CRISPR에서 Cas9의 역할 질문입니다.
우선 gRNA에 의하여 target gene에 binding 한후에 Cas9이 PAM(NGG)를 인식한후에 어떤 방식으로 DNA를 자르는지 궁금합니다. 3-5bp의 염기를 자른다는데 그렇게 되면 KNOCK OUT보다는 Mutation인 것이 아닌지 ...
A.  원하는 유전자의 20 bp정도의 sequence를 이어서 cas9 과 sgRNA complex가 디자인한 위치를 인식하여 자르게 됩니다. 이후에 세포는 HR 또는 NHEJ 를 이용하여 잘린 부위의 dna를 교정하는데 이 과정에서 몇개의 ...
답변 1  |  2015.02.10
Q. LB 액체배지에 콜로니 배양이 안되요.
플라스미드를 뽑으려합니다. 1차적으로 제가 삽입한 gRNA가 들어갔는지 보기위해 콜로니 pcr진행하여 밴드까지 확인하고 콜로니를 선별했습니다. 문제는 이후에 콜로니를 따서 액체배지에 ...
A.  선별에 사용했던 agar plate에서는 자라나요? 그렇다면 액체배지 문제일것 같습니다
답변 3  |  2017.07.30
Q. lentiCRISPRv2를 이용해 Transfection을 하려고 합니다
아니지만요,, 또한가지의 질문은 HDR을 위해 lentiCRISPRv2에 sgRNA를 디자인하여 제대로된 vector를 만들고, HEK293T에 transfection 시킬때 ssODN를 함께 트펙시킬껀데 그냥 농도만 조절하고, transfection reagent만 ...
A.  됩니다. 그러나 293T의 유전자를 타겟팅 할 뿐입니다. Lenti를 쓰는것은 293T로부터 바이러스를 얻어서 다른 세포에 높은 효율로 transduction 함이 목적인데 이것은 안되겠지요. 293T 교정이 목적인가요? Lenti ...
답변 2  |  2018.11.20
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