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실험Q&A    20건 정확도순 날짜순
Q. 핵 내 단백질 coIP
lysis 할수있는 buffer를 찾기 쉽지않네요... 아래 조성이 coIP가 가능할지, 핵을 lysis할 수 있을지.. 선배님들 코멘트 부탁드립니다. hypotonic buffer 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM Tris nuclear extract 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ...
답변 0  |  2012.01.12
Q. 핵까지 완벽히 깨면서 coIP되는 버퍼
그것도 complex의 유지에 영향을 미칠것 같고... CoIP에 대한 고수님들의 조언을 듣고자 합니다. 핵을 효과적으로 깨면서 complex에는 최소한의 영향을 주는 최적의 버퍼 조성이나 lysis 방법은 뭐가 있을까요....
A.  이 buffer 조성으로는 shear가 가지 않는한 핵은 깨지지 않습니다. 여기에 salt concentration을 좀 높여서 사용해 보십시오. 450mM정도이면 nuclear가 거의 lysis되겠지만 co-IP를 위해서는 250mM 정도에서부터 check해 ...
답변 2  |  2006.10.14
Q. coIP 실험 관련해서 질문이 있습니다.
저는 coIP 실험은 처음이며, 온라인에 있는 protocol들과, roche에서 제공하는 protocol을 참고하여 실험을 하였습니다.(proteinA-agarose를 roche에서 구입) 저는 mutant cystein protease의 한 종류를 이용한 실험중인데, ...
A.  간단한 데에도 불구하고 어려운 실험이 co-IP네요;; 대략 경험적으로 순똘님 질문에 답 드립니다. 1. protease inhibitor를 처리를 안해서 degradation 되었을까요? 4도 혹은 ice에서 항상 실험하였고, 하루정도 걸 ...
답변 1  |  2013.08.17
Q. coIP에서 band가 나오지 않는 경우
coIP를 하고 있는데 언젠가부터 이상하게 eluate에서 band가 나오질 않고 signal이 번져서 나옵니다. flow through를 확인해보면 target protein이 거의 없어진걸 확인할 수 있는데 이상하게 eluate를 걸어보면 band가 ...
답변 0  |  2015.09.25
Q. cross-linking후 coIP실험
안녕하세요 coIP할때 cross-linking을 시켜버리고 coIP실험을 한다는 얘기를 들은적이 있는데요 IP실시 후에 단백질을 보려면 reverse cross-linking을 시켜야 할텐데 어떤 방법으로 하는지 궁금합니다
답변 0  |  2010.12.01
Q. 단백질정량
안녕하세요. 오늘 CO-IP를 배우는데 단백질을 추출해서 단백질정량을. 하려고 Spectrophotometer를 이용하는데. 1X Protein assay sol 1ml에 샘플 2ul를 섞어서 Bradford 메뉴로 측정할때 희석배수는 몇으로 하나요? 시 ...
A.  측정치가 2ul에 있는 양이므로 나온 값을 2로 나누어야 1ul에 존재하는 양이 됩니다. 희석배수라는 것은 몇배를 희석했냐이므로 기준이 1ul이면 1/2배 입니다.
답변 1  |  2013.03.05
Q. low ph glycine 으로 ip,coip bead elution시 어떠한 buffer에 elutionsample을중화시키나요?
ph glycine 으로 ip,coip bead elution시 어떠한 buffer에 elutionsample을중화시키나요? 100% 다 일루션이 되었다 가정할경우 30 ul 일루션 버퍼로 일루션할경우 이 샘플안에 프로틴이 온전하다는 보장이있는지..? 0.1M ...
A.  감사합니당
답변 2  |  2014.02.10
Q. PAGE gel EMSA (Protein-Protein interaction, data 있음)
coIP를 해보라고 하지 않을까 싶기도 합니다. 저는 coIP 보다 제가 한 방법이 훨씬 간편하다고 생각이 들고, 문제가 안된다면 앞으로도 이와 같은 방법으로 실험하고 싶은데, 혹시 제가 캐치하지 못하고 ...
A.  이것은 제대로 된 EMSA가 아닐 뿐더러 별로 좋은 데이터 같아 보이지도 않습니다. EMSA는 말 그대로 mobility shift를 보는 것인데, 이 데이터에서는 어떠한 shift가 생겼나요? EMSA는 A가 사라지는 것을 보는 것 ...
답변 1  |  2016.07.27
Q. 핵에 있는 단백질을 coimmunoprecipitation 할 때 salt 농도
확인하려합니다. 이것저것 찾아본 참고문헌들을 토대로 CoIP시 사용할 lysis buffer로써 [50mM Tris(pH7.4), 150mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP-40, protease inhibitor cocktail] 의 조성을 가진 buffer를 이용하기로 했습니다. 그런데 1 ...
A.  단백질 일이 워낙 case by case라서 정답이 없겠습니다만, 제 경험에서는.. 1. 같은 non-ionic detergent지만 NP-40보다는 TritonX-100이 세포가 더 잘 깨지는 것 같더군요(debris양을 비교해봤을때.). 물론 detergent를 바 ...
답변 1  |  2008.07.31
Q. transcription factor의 interaction
수 있으니 그냥 전체적으로 lysis를 해서 해야 할까요... 또 coip를 하는데 syringe 26gauge로 10회 , 10sec x 2 sonication으로 protein의 interaction이 깨지지 않을까 궁금하네요... 물론 fixation 시키지 않은 상태로요.. ...
A.  처음 실험이라면 total lysate가 아무래도 낫겠죠.. 님의 말씀처럼.. cytosol에서 결합하는 factor들도 상당수 있으니까요.. 그런후 cytosol과 nuclear 따로 분리해서 보면.. cytosol에서 결합을 하는지 알 수 있겠 ...
답변 1  |  2008.02.26
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