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실험Q&A    75건 정확도순 날짜순
Q. cas9 vector 에 대한 질문입니다
cas9 을 처음 시도하려고 합니다. pluripotent stem cell 에 cas9 vector를 transfection 하려고 하는데 addgene에 보니 너무나 많은 vector가 있어서 어떤 vector 를 골라야 할지 조금 막막합니다. cmv promotor 가 있는 vector ...
답변 0  |  2015.06.11
Q. Cas9Cas9 D10A의 차이가 궁금합니다.
Single strand break를 하는 걸로 알고 있는데요. Cas9 D10A는 Cas9보다 off-target effect가 낮다고 알고 있는데, 혹시 그 이유가 뭔가요?? 정말 궁금합니다! ...
A.  이 분야에 전문가는 아니지만... 캐스9의 열번째 아미노산이 디인데 에이로 바꿔 실험해보니 오프타겟이펙트가 더 낮게 나왔나보네요.. 오프타겟이펙트가 더 낮은 경우가 실험할 때 좋은 걸로 알고있 ...
답변 2  |  2016.02.03
Q. Cas9 D10A에 대해서 궁금한 점이 있습니다.
여기서 도저히 D10A가 무엇인가요?? 지금까지 찾은 자료로는 Cas9의 한 부분이라고 밖에 모르겠는데, 아시는 분들 계시면 자세히 알려주시면 대단히 감사하겠습니다 ...
A.  Cas9의 열번째 아미노산인 D를 A로 치환한 catalytic mutant입니다.
답변 1  |  2016.02.03
Q. Vector 사이즈만큼의 Cas9을 Cloning 할때..
받아온 Cas9-Guide system에서 NLS 앞까지만 잘라서 쓰려고 그 Cas9 5'과 NLS앞까지를 3'으로 잡고 Restrict enzyme을 다른걸로 치환하기 위해 PCR을 돌립니다. 그리고 size가 커서 가열시킨 D.W도 사용하고, gel ...
A.  ligation/cloning 분제는 control을 안하면 어느 단계가 잘못되었는지 알 수가 없습니다. 반드시 control을 같이 해 보세요.
답변 1  |  2016.11.16
Q. 박테리아에서 cas9을 발현하고자 하는데 문제가 있습니다.
그래서 제 생각은 promoter가 working을 안했다던가 혹은 cas9 mRNA의 stability가 매우 떨어지는게 아닌가 생각하고 있는데요. 여기서 질문은 제가 사용하는 박테리아에서 이용가능한 promoter가 제한적이라 다른 ...
A.  여러가지를 확인해야 합니다. 프로모터는 sequencing으로 확인 되었는지, 코작 sequence는 잘 들어갔는지, 혹시 보통때 억제되는 promoter는 아닌지 확인이 되야 mRNA level의 문제를 알 수 있습니다. 혹시 codon ...
답변 1  |  2017.05.23
Q. gene editing 관련하여 질문 드립니다 (Cas9 system)
하고 있는 학생입니다. 다름이 아니라 현재 제가 Cell에 Cas9 system 을 이용하여 gene에 reporter(fluorescene protein) 를 knock in 실험을 진행 중에 있습니다. 제가 알기로는 Cas9, gRNA, donor vector를 co-transfection하면 ...
A.  reporter혹은 cell stage에 따른 유전자 발현 관찰)에 따라 wt Cas9을 사용할지 dCas을 사용하는 것이 좋을지 생각해 봐야 할 것 같습니다. 그리고 어떤 셀라인을 사용하시는지 어떤 방식으로 전달하는지 ...
답변 1  |  2016.06.01
Q. crispr cas9 plasmid 관련 문의
crispr cas9 knock out plasmid를 사용할 것이구요 2개 vector sgRNA와 Cas9 plasmid를 co transfection 하여 cell안에 넣어서 knock out을 시킨 cell로 실험을 진행하면 되는게 맞나요...? 혹시 co transfection시 cell 양에 따른 plasmid ...
A.  encoding 하는 vector를 넣어주면 될 것입니다. gRNA vector와 Cas9 vector를 따로 transfection 해도 되지만 mammalian에서 한번에 작동시키는 all-in one vector를 사용하는 경우도 많습니다. (예 : Thermo사 GeneArt CRISPR Nuclease ...
답변 1  |  2020.01.20
Q. CRISPR-Cas9에서 Cas9 역할에 대한 질문입니다.
모양만 조금 달라지는 것이 아닌지 궁금합니다. 또 CRISPR-Cas9에 의해서 target gene이 제대로 knock out이 된 세포만 어떻게 구별을 하는지 궁금합니다. 일부 회사에서는 CD4나 GFR을 이용한다고 하는데 이것은 ...
답변 0  |  2015.02.09
Q. crispr cas9 도와주세요~
K/O여부를 쉽게 확인하기 위해 GFP 및 flag taaging 된 Cripr cas9 vector를 업체통해 제작한 뒤 실험에 사용했습니다. 일단 cancer cell에 사용하기 전에 vector working 부터 확인 하기 위해 293TN에 transfection 한 뒤 GFP가 ...
A.  들어가서 Cas9이 발현을 했다는 것을 보여주려는 것이구요 Cas9 vector가 genome에 integration이 되지 않으면 GFP/FLAG도 사라지겠죠.. 정확한 것은 INDEL을 NGS (next generation sequencing)을 돌려서 확인하시면 됩니다. ...
답변 2  |  2020.02.17
Q. CRISPR Cas9 실험에 관해 질문이 있습니다.
CRISPR Cas9 실험을 하는 연구생입니다. 선배도 없어서 인터넷과 논문을 근거로 공부중에 있습니다만.... 도무지 이해가 안가는 부분이 있어서 질문올립니다. 염기서열? NNNNNNNNNNNNNNNNNN PAM 가이드 ...
A.  가능합니다. 이 경우는 template를 함께 집어 넣어 HDR로 correction해주어야 합니다. target sequence에 맞는 PAM을 찾아야 하구요. 요즘은 gRNA와 Cas를 RNP로 주로 넣어줍니다. 그런데 질문 내용으로 보아서 실험 ...
답변 1  |  2019.10.25
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