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실험Q&A    13건 정확도순 날짜순
Q. PNK 추천좀 부탁드립니다. ^^
T4 polynucleotide kinase를 이용해서 isotope labeling을 하려고 하는데요 처음하는 실험이라 어떤 회사 제품을 사용해야하는지 잘 모르겠습니다. 혹시 많이 사용하는 게 있으면 고수님들께 추천 부탁드립니다.
A.  NEB 많이 사용했어요.
답변 1  |  2006.02.23
Q. TA cloning 관련
3`end의 T와 PCR Product의 3`end의 A가 붙게 하는건가요? 그리고 꼭 pnk처리(T4 Polynucleotide kinase)를 해줘야하는지 알고 싶습니다, 해주어야 된다면 왜 그런지도 알려주세요 ...
A.  원리는 맞습니다. 일반적인 Taq을 쓰면 PCR product는 A tail을 가지고 있습니다. 그것은 벡터와 연결하는 작업입니다. kinase 처리는 필요 없습니다. Taq 을 이용한 합성에서는 phosphodiester bond가 가능한 PCR ...
답변 3  |  2015.12.22
Q. guide RNA annealing이나 PCR 어떻게 돌리시나요? 도와주세요!
얘네들이 PNK 됬는지 안됬는지 어떻게 알죠..ㅠㅠ? 그리고 PNK 처리안해도 잘 들어간단 얘기도 있긴하던데..모르겠습니다..ㅠㅠ 3. ligation 해볼려구.... gel 내려서 확인하면 gRNA vector 1ul 넣은게 20ng 수준의 ...
A.   이것도 T4 PNK를 사용하는게 좋다고는 되어 있으나, PNK 안 쓰고도 매번 colony 수백개씩 뜹니다. 2. Oligo 농도를 줄여보세요. Vector-insert ligation시 optimal한 비율은 mole 수 기준으로 1:2 ~ 1:10 정도입니다. 위와 ...
답변 4  |  2016.04.24
Q. CIP 처리 후 purification
+ TE buffer 46ul) 하고 gel 확인 2. PNK 처리 (T4 ligase buffer 2ul + T4 PNK 1ul + oligo 17ul, 37도에서 30분, 65도에서 20분 inactivation) 3. PCR purification 하고나서 ligation 진행했구요 (16도, O/N) CIP가 안먹은건지 Vector만 ligation한 ...
A.  Vector DNA 양이 너무 많네요. 20 ug이면 굉장한 양입니다. 한 1-5 ug으로 줄이세요. CIP가 안먹은게 아니라 아예 restriction digestion이 안된 것 같습니다.
답변 4  |  2016.12.02
Q. sgRNA annealing 관련
.. ligase는 covalent bond 를 만들어준다고 알고 있는데... PNK 는 끝부분에 phospho lable 을 해주는 역할인것 같고.. T4 buffer 의 ATP가 37도에서 hydrogen bonding 을 boosting 해주는건가요?? 답변 부탁드리겠습니다. 미리 ...
답변 0  |  2019.09.03
Q. ligation이 안됩니다
template로하여 template :10람다 PNK BUFFER(10X) : 2 100mM ATP :1 PNK :1 dw :6 vf 20람다 --> 37도씨 인큐베이팅 30분 이것을 insert 로 해서 insert 1 / 13<-- 양을 달리해봄 t4 dna buffer 1 / 2 ligase 1 / 1 dw 6 / 2 vf 9 / 18 --> 1 ...
A.  솔직히 질문을 이해할 수 없네요. > annealing : dw 10 > F'' 5pmol > R'' 5pmol > 이렇게 20람다를 95도씨 중탕 5분해서 2시간정도 식혔구요 > 이후 여기서 10람다를 template로하여 => 두 primer의 길이가 알마나 되나 ...
답변 1  |  2009.03.13
Q. kination 문제 좀 해결 부탁드립니다.
28 ul 10Xkinase buffer 6 ul probe 6 ul (600pM) γ-32P-ATP 6 ul(≒0.9mCi) T4 PNK(10unit/ul) 4 ul (40unit) → vortex 한 후 spin down ② 37℃, 30min incubation :223호 incub.사용 막간을 이용하여 column 충진하세요!!! ③ 70℃, 10min incubation ...
A.  kination이라는 말은 처음 들어 봅니다. kinase로 phosphorylation시키는 걸 말씀하시나 보군요. probe를 kinase로 labeling하는 경우에는 아무래도 강력한 probe를 만들기가 힘듭니다. 저 같으면 randon primer방법으로 ...
답변 1  |  2006.09.25
Q. 한쪽 primer로 PCR 결과에 대해...
번 marker 구여 2번은 enzyme cut 3번은 enzyme cut +PNK 처리입니다. 사이즈는 550bp쯤 됩니다. 한쪽 primer로 PCR 돌렸기 때문에 single strand가 생성될것으로 생각했습니디만.. 밴드위치상으로 double strand가 뜬것으로 ...
A.  질문이 이해가지 않는군요. PCR한 후에 XhoI 처리를 한건가요? 세 gel의 맨 위쪽에 같은 크기의 두꺼운 밴드 보이시죠? 2번 3번 말고 마커에도 같은 밴드가 있습니다. 뭔가 심하게 오염된 상태로 보입니다. ...
답변 2  |  2011.03.10
Q. 정말 간곡히 부탁드립니다ㅠㅠ
. sgRNA top - 1ul sgRNA bottom - 1ul T4 ligation buffer 10× - 1ul T4 PNK -1ul (total = 10ul ) 2. 37℃ 30분 95℃ 5분 3. 10ul를 1/100로 희석 4. spcas9(벡터) -1ul Diluted oligo duplex fron step 5B - 2ul tango buffer 10x - 2ul NEbuffer - 1ul T4 ligase ...
답변 0  |  2018.01.15
Q. protein expression 이 되질 않아요 ㅠㅠ
PRIMER 를 제작해서 1번부터 100 번 으로 만들기 위해 PCR 한후 pnk reaction 을 거쳐 self ligation 을 하여 dh5 알파에 transformation 하여 sequncing 이 일치 하는것을 확인 하였습니다. 이걸다시 bl21 (de3) 에 transformation ...
A.  간혹 보이는 현상입니다. 유전자가 발현이 안되는 이유는 12,529가지 이유가 알려져 있습니다. 발현이 잘되던 유전자도 코돈 하나-두개를 없애거나 치환하면 발현이 안되는 경우가 있습니다. 정확히 말 ...
답변 1  |  2011.12.11
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