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실험Q&A    348건 정확도순 날짜순
Q. sonication, Ni-NTA  |  첨부파일 첨부파일
붙이는 과정에서 잘못된거 아니냐고 하셨는데 '20mL lysate와 Ni-NTA (equilibrated matrix) shaking (on ice, 60min, shaker)' 반응을 더 늘려야 할까요? 3) 약간 바보같은 질문일 수 있는데 혹시 protein genE size가 855bp인데 ...
A.  - 우선 발현 확인 용 IPTG + / - 전기영동은 없나요? - 855bp는 약 31kda정도 됩니다.
답변 8  |  2022.09.22
Q. Ni/NTA 전문가들게 여쭙습니다.
His-tag이 있는 단백질을 Ni/NTA로 정제하여 Elution한 뒤, cleavage 과정을 거쳐 His-tag을 제거하고 buffer exchange 후 2차 Ni/NTA를 처리하였습니다. 문제는 His-tag이 잘렸다면 resin에 붙지 않고, flow-through로 용출할 ...
A.  질문의 내용은 잘 알고있습니다. WB에 안나오면 His가 없어진겁니다. 그리고 his를 잘랐는데 레진에 붙는다면 SDS-PAGE로 his자른 후 레진에 안붙은 fraction, his 자른 후 레진에 붙어서 elution한 fraction을 정확 ...
답변 14  |  2019.08.30
Q. protein refolding시 aggregation? Ni-NTA?
않았습니다. refolding이 제대로 안된건지.. 또 다른회사 Ni-NTA 컬럼을 사용해보고 싶은데 아는게 너무 없네요. 고수님들의 답변 부탁드립니다. 고맙습니다 ...
A.  IB로 나온 단백질을 denature 한다음 refolding 해서 Ni-NTA column에 걸어 정제 하시려는 건가요? (제가 제대로 이해하고 있 ... ) 지아짱님 경우에는 그냥 무난히 Tris 버퍼에서 Ni-NTA 걸으시면 될 듯합니다 ...
답변 4  |  2008.07.01
Q. Ni-NTA 원리
Ni-NTA column 을 이용하여 protein purification 을 진행하고 있는데 원리가 이해가 잘 가지 않아서 여기저기 자료를 찾아보아도 이해를 잘 못해서 질문드립니다. histag된 것과 Ni2+가 ligand 결합을 하여 붙어 ...
A.  affinity resin을 포함한 binding-elution을 하는 resin은 resin g당 binding capa.가 있습니다. 보통 binding capa.의 100%의 단백질을 loading하여 컬럼을 사용하는 것이 아니기 때문에 1회 사용 후 남아 있는 binding site가 남 ...
답변 4  |  2018.11.29
Q. His-tag / Ni-nta에서 EDTA 사용
약화시켜 lysis를 돕는다고 알고 있습니다. 그런데 EDTA가 Ni-nta 에서 ni 이온을 chelating하여 elution 시킨다고 하는데, 그렇게 되면 His-tag가 못붙을 것 같은데... 2mM의 EDTA가 정제에 큰 영향을 미칠수 있는건지 ...
A.  - EDTA 20mM 까지 사용가능한 Ni-NTA resin이 있기는 하지만 일반 resin의 경우 binding capa.가 줄어듭니다. - lysate를 UF로 buffer change를 한 후 정제를 하면 될것 같습니다.
답변 1  |  2022.07.26
Q. Ni-NTA agarose에 binding 시킨 단백질을 끓여서 떼어낼 수 있나요?
.. 아니면 Imidazol elution을 해야만 합니까? 정제된 단백질을 Ni-NTA agarose에 binding 시킨 다음 cell lysate를 가지고 binding 하는 단백질을 찾으려고 하고 있습니다. 물론 많은 background로 인해 쉽지 않을 것 ...
A.  SDS buffer로 당연히 떨어집니다. 하지만 해보시면 그냥 bead에 붙는 단백질이 생각보다 훠얼씬 많다는걸 아시게 될 겁니다.. -_-
답변 5  |  2008.03.11
Q. Ni-NTA와 histidine 결합력에 pH의 영향
안 보입니다. Ni-NTA resin에 바인딩 후에 낮은 pH로 elution을 하는데 Ni-NTA와 his-taq의 바인딩이 pH에 의해 조절되는 원리를 알고 싶습니다. 아시는분 설명종 부탁드립니다^ ...
A.  Ni-NTA, Ni ion, his protein의 결합은 배위결합이며 그 결합력은 수소이온에 의해 달라집니다.
답변 2  |  2013.05.20
Q. Ni-NTA agarose
또 하나의 질문은 column에 충진 된 기존에 사용했던 resin, 즉 Ni-NTA agarose를 제거하고 싶습니다. 어떻게 제거하는 것이 좋을까요? 선배님들의 답변을 기다리겠습니다^- ...
A.  qiagen의 QIAexpressionist라는 핸드북이 있습니다. PDF파일도 인터넷 뒤지면 금방찾으실수 있을것입니다. 자세하게 나와있으니 참고 하시고 혹시라고 모르시겠으면 답글달아 주세요..제가 찾아보고 알려드 ...
답변 2  |  2007.11.27
Q. Anaerobic상태에서의 Ni-NTA를 이용한 효소 정제 질문입니다
것입니다. 균주는 BL21을 이용하였고요 정제는 큐아젠의 Ni-NTA Fast start kit을 이용하였으며, anaerobic상태라는 것만 제외하고는 메뉴얼대로 진행하였습니다 큐아젠 한국지사에 연락해보니 anaerobic한 ...
A.  purification이 안 된다는 건가요, 아니면 concentration이 안 된다는 건가요?
답변 4  |  2010.06.10
Q. Ni-NTA column 추천 부탁드립니다.
정제하고 있습니다. 큰 column쓰면 안되냐고 물으니까 Ni-NTA보다 작은 사이즈의 필터가 실험실에 없다고 찾아보라고 하더라구요 혹시 추천해주실만한 필터나 칼럼 있나요 ...
A.  FPLC가 있으시면 유리로 된 컬럼에 Ni-NTA RESIN을 충진하여 사용하시면 되고요. FPLC가 없으시면 주사기를 이용하여 최대 30ml resin까지 사용이 가능한 컬럼도 있습니다. 아래 메일로 연락주시면 알려 ...
답변 2  |  2017.02.06
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