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실험Q&A    35건 정확도순 날짜순
Q. histag 정제.. 단백질이 증발했어요
histag 정제를 하는데요.. 특정 단백질을 refolding해서 histag purification하면 sample flow throw, washing fraction, elution fraction, 어떤 곳에도 단백질이 없습니다. ㅎㄷㄷ (정제 전 sample에는 명확히 one band로 있음) ...
A.  정제전 샘플이라면 refolding후 정제전 샘플이 맞는지요? 정제 전 샘플에서 문제가 없다면 Ni-NT bead를 샘플버퍼 넣고 끓여서 로딩해 보세요. 그리고, 확인은 Western blot (His Ab)으로 하시기를 권합니다. 양 ...
답변 2  |  2017.08.02
Q. N-termial histagged protein의 Histag를 떼고 싶은데 protocol 좀 알려주세요 ^^
할 거 같은데 방법 아시는 분 답변 부탁드립 니다. 아예 histag이 제거 된 alpha-synuclein을 구입할 수 있으면 더 좋은데 아직 제가 알아본 바로 는 없네요 ;; 혹시 판매하는 회사를 아시거나 제가 이쪽 ...
A.  답변 감사드립니다. ^^
답변 2  |  2010.04.14
Q. Western에서 his-tag protein을 볼 수 없는 이유들
단백질량이 detection limit보다 낮아서 일까요? 아니면 histag이 사라졌을까요? 또 다른 가능성은 뭐가 있을까요? 실험 고수님들의 조언 부탁합니다 ...
A.  저 같으면 우선 20ug로 loading 해 보겠습니다. his의 경우에 낮은 농도에서 잘 안잡히는 경우가 있습니다. 물론 antibody 차이마다 크겠지만요..
답변 3  |  2013.06.07
Q. histag 붙은 단백질 발현 벡터 분양좀 부탁합니다 (pet제외)
제가 단백질을 만들고 있는데요 pet 28a벡터에는 잘 들어가 있는데 이상하게 발현이 안되네요 OD도 다 조절 해보고 시간도 조절해 보았는데 계속 헤메네요 ㅜ.ㅜ 조언좀 부탁드립니다 아무래도 벡터를 ...
답변 0  |  2009.12.21
Q. 6Xhistag 단백질 binding 관련 질문입니다.
x histag 단백질을 purification 하려고합니다. qiagen Ni-NTA column을 이용해서 진행 하고 있습니다. 기존에는 중력을 이용해서 진행했었습니다. 그리고 최근에는 FPLC를 이용해서 진행하는데 이상하게 column에 his ...
A.  단백질의 native strucutre, folding 등으로 인해 6x His 부위가 완전히 노출되어 있지 않을 경우, 칼럼에 약하게 붙을 수 있습니다. 따라서 flow rate이 빨라지면 결합 정도가 더 약하게 되겠지요. 1. 단백질을 ...
답변 1  |  2012.10.07
Q. phage display (g8p-Histag)-western 문제
먼저 M13 phage G8에 His-tag을 달아서 phage의 display가 어느정도 되는지 실험하고 있습니다. 그런데 G8-his tag display한 phage를 titer 10에 12승까지만들기 위해 PEG로 침전시켜 PBS로 현탁하여 SDS & western을 하였습 ...
답변 0  |  2009.12.28
Q. recombinant protein가 soluble하게 발현되지만 activity가 나오질 않아요.
가서 저온에서 soluble하게 발현시키고 있구요, column을 통해 histag purification을 하고 있습니다. Test set에서는 동일한 protocol을 통해서 activity가 어느정도는 나왔는데, 새로 키워서 추출하여 다시 해보니 ...
A.  발현한 단배질 활성을 잃는 경우는 원인이 너무 다양해서 뭐라고 딱 찝어드릴 수는 없을 것 같습니다. 발현자체는 잘 됬으니 E.coli 문제일 가능성은 낮다고 봅니다. 활성이 안나온 실험이 발현 온도를 ...
답변 1  |  2017.02.10
Q. 단백질이 ultracentrifugation하면 pellet으로 가라앉습니다
(eYFP-T7RNAP, size : ~127 kDa). 랩에서 몇몇 soluble한 단백질을 histag으로 뽑아 봤기 때문에 protocol이 있고 그대로 했습니다. cell을 sonication을 하면 두 층으로 나뉘고 전체적으로 탁합니다. 그리고 13만g로 ...
A.  Soluble fraction을 얻기 위해서 13만g의 원심분리를 하신 건가요? 1만g정도로도 충분합니다만... Protein complex (ribosome)이라 할지라도 다른 매개물없이 침전시킬려면 30만g 이상은 되어야 하는 것으로 알고 있 ...
답변 2  |  2012.11.08
Q. inclusion body 형성 단백질 분리 질문입니다.
논물을 계속해서 찾아본 결과 그그룹은 c-terminal histag은 했는데 N-terminal은 못했다고 합니다. 그러면서 논문에서 n-terminal은 folding에 중요한 영향을 미쳐서 안된다고 결론을 내린거 같습니다. 저는 8mM ...
A.  Inclusion body를 먼저 isolation 하셨는지요? 아니면 bacteria를 urea가 포함된 lysis buffer에 넣고 바로 lysis시키셨는지요? 먼저 inclusion body를 isolation 시키는 것이 좋습니다. 그 다음 urea를 이용해 denature시켜보세 ...
답변 1  |  2012.10.12
Q. 급질문!!!
합니다... 벡터맵은 대략 아래와 같고... T7 Promoter-Nde I - histag----------HInd III - Not I-Xho I - histag-TAG-------------T7 Terminator---- 제한 효소가 Nde I (CATATG) 과 HInd III 사용하고, 뒤의 his tag을 이용하여 단백질을 ...
A.  종결코돈을 안다는게 맞아요. 서열들은 그 머지 프레임을 잘맞추시면 될꺼 같아요. 근데 protein이 folding 될때... 다른 effect가 생길수도 있어요-
답변 1  |  2011.09.29
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