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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
질문 Western 연이은 대실패 제발 한번만 도와주세요 ㅜㅜ 조언부탁드립니다
알SoS2(과기인)  |  11.07 11:20

안녕하세요 열심히 실험을 배우고 있는 신입 연구원 입니다.  본 실험을 맡게 되어 Western 실험을 진행 중에 있는데 3가지 항체를 보려고 하고 있습니다. 2주일 째 실험이 결과가 안나오고 망하고 있고 원인을 너무 못찾겠어서 결국 글을 올리게 되었습니다 ㅜㅜ 최대한 자세히 작성하고 사진도 첨부할 것인데 조언을 부탁드려요 .. 감사합니다

1. sample : brain : 30ug/10ul 로 로딩할 때 10ul 씩 로딩 합니다

2. 실험에 사용되는 Buffer 제작

- TBSt wash : dw950ml + 20x TBS 50ml + tween20 50ml

- Running : dw900ml + 10xSDS 100ml

- Transfer : dw700ml + 10xTrans 100ml + metanol 200ml

- Bloking : 5% Skim Milk

 

3. Gel 은 10%(60~80KDa, 43KDa), 15% (23~37KDa) 두개를 사용합니다.

 

4. Loading 은

Gel 두판으로 한번에 진행할 땐 40mA 110min 밴드 내려온거 확인하면서 내리고요, 한판 진행 시 30mA 100min 이내로 진행하였습니다   

5. Transfer는

100Volt 에서 70min 하였습니다. transfer가 끝나면 TBSt 로 5min씩 3회 반복한 뒤 blocking 진행합니다.

6. Blocking은

5% skim milk 를 그 날  만들어 1시간 RT 합니다.( 볼텍싱을 워낙 오래하고 만들자마자 바로 붓는게 아닌 삼십분 전 쯤 만들기 때문에 괜찮습니다. ) TBSt 로 5min씩 3회 wash 한 다음 1차 antibody 를 붙입니다.

7. 1차 항체를 각각 알맞게 붓고 4도에서 Overnight 으로 진행하고 다음 날 아침에 1차 항체들을 비우고 TBSt 로 5min 3회 wash 하고 2차 항체를 붙입니다.

8. 2차 항체는 mouse - anti (HRP) 사용합니다.   1 : 3000 으로 희석해서 사용하고 1시간 동안 RT로 붙입니다. 그 다음 TBSt 5min 3회 wash 한 뒤 Detection 합니다.

 

이상입니다..

제 실험의 문제들은 아래와 같습니다..  

1. Background 가 검은 얼룩이 져있다.

2. Band 자체가 안나온다.

3. non spectific band가 아주 많이 나온다.

4. 마지막 western 결과 중 23~37KDa 봐야하는 membrane을 보면

다들 25에 ------------- 이렇게 떠 있는 것이 아니고 -------_------ 하나만 다른 위치에 밴드가 나타난 것이 있는데 이것은 어떻게 설명해야 할지 모르겠습니다.

입니다.. ㅜㅜ 실험을 5번을 진행하면서 다 똑같은 조건으로 똑같은 실험자가 진행한 실험이 모두 동일하지가 않게 결과가 나오는데 교수님께 어떻게 설명을하고 트러블 슈팅을 해야할지 막막합니다 ㅜㅜ

일단 2차항체 제품 자체를 바꿔보았는데 한시간 뒤쯤 결과를 확인해서 어떻게 변할지는 아직 확인이 되지 않습니다

1차항체는 여태동안 실험한 약 5번 정도를 재활용 하였는데 맨 처음 했던것만 밴드들이 나오고 그 이후로는 안나오는것이 1차항체 문제가 클까요?  

글이 올라가지 않는줄 알고 확인버튼을 연타한것이 연타한만큼 도배가 되어서ㅜㅜㅜㅜㅜㅜ 죄송합니다 고의성 도배가 아닙니다...

 

이번에 2차항체를 바꾼 것을 확인해본 결과 정말 말끔히 밴드가 아무것도 뜨지 않았습니다 actin 만 나오더라구요 .. 항체를 6번째 재활용한것이 문제일까요?

 

#Westernblotting
#band
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