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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
질문 RNA extraction 시 문제...
뒷다리cell40(과기인)  |  2017.12.08
안녕하세요? 
qPCR을 하기 위해 RNA extraction을 하는데 문제가 있어서 질문 드립니다.

우선 지난번에도 trizol을 이용하여 RNA extraction을 하였는데 특별한 문제는 없었습니다.
그런데 오늘 다시 RNA extraction을 하는데
몇몇 sample에서는 phase separation이 거의 전혀 되지 않았습니다.
Phase separation이 된 sample에서도 이전보다는 상층액에 clear 하지 않았습니다.

이전과 차이점이라면 
plate에서 media를 suction 하고 나서 PBS washing을 하지 않았습니다
(RNA만 extraction 할 때에는 꼭 필요치 않다고 들어서요).
그리고 cell confluency가 이전보다는 높았습니다만 그래도 80-90% 정도라고 생각됩니다.

즉 cell confluency가 높은 plate에서
PBS washing 없이 trizol 만으로 lysis 시켜 centrifuge를 했더니
phase separation이 전혀 되지 않았고
centrifuge를 더 해도 차이가 없길래
상층액만 딴다는 기분 (?)으로 일단은 끝까지 RNA를 뽑아 보았는데요.
A260/280은 1.4-1.8 (제일 잘 나온 것이 1.8)
A260/230은 훨씬 낫게 1 초반까지도 나왔습니다.
RNA 농도 자체는 1000 ng/ul 이상으로 전부 고농도였습니다.
Cell은 plasmid, shRNA 등이 transfection 되어 있는 mammalian cell로서
이전에도 이 cell로 RNA extraction을 하였습니다.
시약은 모두 새것 (실험실용), 마스크 장갑 등 오염에 주의하면서 실험했습니다.

샘플 퀄리티가 qPCR을 할 수는 없을 것으로 생각돼서 
PBS washing을 하고 다시 뽑아볼 예정이기는 한데
왜 몇몇 샘플에서 phase separation이 안 되었는지 궁금합니다.
Phase separation이 안 되었기에 상층액을 딴다고 땄지만 phenol이 섞여 있었고
그래서 A260/280, A260/230이 낮게 나온 것이 아닌가 생각되어서요.

읽어주셔서 감사합니다.

#RNA
#trizol
#A260/280
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