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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
질문 cytosol, nuclear extraction 프로토콜 만들어봤습니다. 조언부탁드립니다.
개구리상후니(대학원생)  |  2017.05.23
 

저는 rat skeletal muscle로 실험하는데, 거의다 Cell 실험에 특화된 프로토콜밖에 찾을수 없어서, 이것저것 뒤져서 종합해서 만들어봤습니다..

혹시 보시고 지적해주실것 있으시면 조언 부탁드립니다.


버퍼조성:
- Cytoplasmic Extract (CE) buffer: (HEPES [10 mM] pH 7.9, KCl [10 mM], EDTA [0.1 mM], NP-40 0.3% (add just before use), protease inhibitors 1x (add just before use))

- Nuclear Extract (NE) buffer: (HEPES [20 mM] pH 7.9, NaCl [0.4 M], EDTA [1 mM], Glycerol 25%, protease Inhibitors 1x (add just before use)) 

1. 얼음에서 조직에 차가운 PBS 1 mL넣고 500 x g, 5분 후 PBS를 파이펫으로 최대한 제거해준다.

2. CE버퍼+inhibitor cocktail (조직 1 : 버퍼 9)를 넣고 조직을 최대한 잘게 자른다.

3. 10초간 homogenize 하여 덩어리 없이 최대한 갈아준다.

4. 4°C, 1,200 x g, 10 centrifuge 하고, Sup 새 튜브로 옮긴다. (pellet 버림)

5. 4°C, 10,000 x g, 10. (nuclear pellet 약하니 주의) Sup 모아서 -70°C 보관
  (Cytosolic protein)

6. NP-40가 없는 CE 버퍼 200 μLresuspend 한다.

7. 4°C, 3,000rpm, 5centrifuge 한다. - Sup 제거

(nuclear pellet을 더 잘 씻으려면 5, 6번 반복한다.)

8. pelletNE 버퍼(tissue 100mg -> 200ul) 넣고 pellet 조심히 풀어준 후

4°C, 10분간 incubate 시키고, 중간중간 vortex해준다.

9. 4°C, 10,000 x g, 5

10. Sup 모은다. (Nuclear protein), 분석 또는 -70°C 보관.

#extraction
#프로토콜
#웨스턴
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