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 전체 > Bioethics
질문 real time pcr시 ct값 문제
올챙이초보석사생  |  2015.05.21
최근 real time PCR을 처음 실험하고 있습니다.
real time PCR을 하면서 문제가 되고 있는 것이 target primer의 ct값이 안나온다는 것입니다.
easy-RNA prep kit로 cell에서 RNA를 추출하고 나노드랍으로 RNA 농도를 측정해서
cDNA 합성 키트로 cDNA를 합성합니다.
그리고 primer와 SYBR mixture를 만들고, cDNA와 depc-water를 섞어 mixture를 만듭니다.
PCR plate에 primer mixture를 먼저 넣고 DNA mixture를 넣은 후에 필름을 sealing한 후 real time PCR을 돌리는데요.
결과를 보면 GAPDH의 ct값은 나오는데 target primer의 ct값은 안나옵니다.
(모든 sample에서 GAPDH의 값은 22~23 정도 나옵니다)
전체적으로 안나오는것이 아니고 control에서만 안나옵니다.
약물을 친 sample에서는 ct값이 나오는데 control에서 안나오니 상대정량을 할 수가 없어져버립니다.
cDNA 합성이 잘못 됐나 싶어 RNA prep을 다시 cDNA로 합성하여 해봤는데도 똑같이 GAPDH값만 나오고 target primer에서는 안나옵니다.
mixture의 오염이라기엔 다른 sample에서 값이 나오기 때문에 아닌것 같고
cDNA 오염이기엔 또 GAPDH에서 ct값이 나오니 아닌것 같고 문제점을 모르겠어요ㅠㅠ
하나 걸리는 것은 RNA 농도를 잴 때 농도와 purity가 낮았던 것인데 GAPDH 값이 나오는 것 보면
RNA prep 문제도 아니라고 생각하고 있습니다. (전체적으로 sample의 RNA 농도가 낮았습니다)
PCR 조건과 primer는 전에 썼던 것과 동일한 것으로 전에는 실험 결과가 잘 나왔던 것들입니다.
제가 생각지 않은 문제점이 무엇인지 고수님들이 알려주세요ㅠㅠㅠ
#real time PCR
#CT
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