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 전체 > Molecular Biology-RNA > etc.
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질문 RNA의 손상 여부 확인 부탁드릴게요...
알우리가 정의(대학원생)  |  03.06 19:46

기존에 저희 실험실에서 발현이 확인된 실험인데, 제 손에서 재현이 안됩니다...

제가 다시 실험을 진행하고 있는데 기존 결과처럼 재현이 안되어서 (기존 결과가 잘못되었을 가능성은 적습니다. 동료의 PCR 결과 및 과거 WB결과에서 동일한 결과를 보여주었습니다),

PCR 발현--> cDNA--> RNA 순으로 거슬러 올라가서 원인을 파악하고 있습니다.

 

PCR 발현과 관련된 trouble shooting도 여러개 진행하였으나 원인을 찾지 못하였고, cDNA 문제인가 싶어서 같은 RNA 샘플에서 새로 cDNA 합성하여서 실험 진행했는데도 계속 동일하게 잘못된 결과를 얻었습니다. 

 

그래서 마지막으로 RNA의 문제인가 싶어서 RNA 전기영동을 해봤는데, 결과가 애매? 이상한거 같아서 문의드리려고 합니다.

 

전기영동 조건을 말씀드리면, band만 확인할 거라 1% Agarose gel (1g agarose+ 1X TAE buffer 100ml+ DNA gel staining dye 10ul) 사용하였으며 100V에서 20분 내렸습니다.

 

현재 문제있는 sample 3개와 기존 다른실험에서 사용하였던 RNA sample 2개를 positive control로 하여 총 5개 군으로 확인해보았는데,

 

band가 영 이상하게 나온거 같아서 확인부탁드리겠습니다.

 

전기영동을 내리기 위한 sample 조성은 RNA 2ul+ 6X gel loading dye 1ul+ DW 3ul= 총 6ul로 만들어서 각 well에 6ul 모두 걸어주었습니다.

 

ladder는 1kb DNA ladder 사용했습니다.

(인터넷을 찾아보니 28S는 5kb에서, 18S는 1.9kb에서 확인가능하다고 합니다)

 

결과는 A,B에서 band가 뜨지 않았고, C에서는 28S band는 희미하게 발현?,

18S band2kb 언저리에 발현, 1kb 위치에서도 band가 발현되었는데

 

결과해석을 어떻게 해야할까요? 지금 저 결과로는 해석하기가 부족한가요??

혹시 과정중에 잘못된 점이 있는지에 대해서도 고견 부탁드리겠습니다.

upload_image

#RNA
 
#PCR
 
#cDNA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
RNA가 다 깨져있어요.
크기가 큰 RNA분자가 더 많이 분해됩니다. 그리고 로딩한 웰 부근에 미처 내려오지 않은 오염물질의 흔적으로 보아 이 샘플은 RNA 추출 과정에서부터 문제가 있다고 생각됩니다. 샘플량이 적당한 범위에 있는지와 클로로포름 추출에서 상등액을 깨끗이 분취했는지 되짚어 보세요.
개구리느림보  |  03.06 19:57  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cDNA 합성에 사용하는 mRNA는 양도적고 band로 확인하기 힘들어서

rRNA를 가지고 mRNA 추출이 잘되었을거라 판단합니다.

A~C는 RNA 추출이 사용하지 못할 정도로 좋지 않습니다.

RNA는 RNA marker를 사용하는게 확인하기 좋습니다.

18S는 2kb, 28S는 5kb 부근에 나옵니다.

그리고 positive control의 28S도 좋은 상태는 아닙니다.

prep이 잘되면 18S, 28S 모두 진한 band모양으로 잘 나옵니다.

대왕개구리SPEED  |  03.06 19:58  
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