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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 연골세포 3D 배양에서 western blot 수행 하는 방법 아시는 고수님들 도와주세요~
올챙이vtml(대학생)  |  03.06 11:28

안녕하세요.

제가 연골세포를 3차원적으로 배양하여 웨스턴블랏을 수행하려고 합니다.

기본적으로 베타액틴이나 제가 보고자 하는 단백질들은 검출이 되는데 유독 aggrecan만 검출이 되지 않고 있습니다. 혹시 aggrecan 단백질을 검출 해 보신 고수님들 도와주실수 있을까요?

아래는 제가 수행하는 western blot 방법입니다.

1. 연골세포를 3D culture을 통해 배양한 세포 획득

2. homogenizer로 세포 으깨기

3. centrifuge 13000rpm 5min RT

4. 상층액만 걷어 BCA로 정량 (50ug)

이렇게 샘플을 걷고 running 은 100V 115min, transfer는 90V 100min 진행 하였습니다. blocking은 5% skinmilk에 1h 수행하였고요. 항체는 1:1000 비율로 해서 3% sinmilk에 녹인 후 1차 2차 전부 붙였습니다. 제가 구입한 aggrecan 항체는 santacruz 제품이고, 밴드 사이즈는 200kDa입니다.

고수님들 도와주세요~

#western blot
 
#200kDa
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

연골세포 3D 배양 이런게 문제가 아니고

가지고 있는 항체가 문제일수도 있습니다. 아시다시피 웨스턴 블랏이 항원이 충분하면 쉽게 검출되고 항원이 많지 않다면 항체가 똘똘해야 그나마 쉽게 결과를 볼수 있습니다.

기존에 문제없이 사용하시던 항체이신가요?

항체가 문제가 없다면 그때 샘플링방법 transfer 방법을 고민하시는게 맞을것입니다.

금개구리안재진  |  03.06 11:31  

항체는 이번에 새로 구입한 항체입니다.

올챙이vtml  |  03.07 12:07  

선생님 안녕하세요. 저는 인천쪽에서 공부하고있는 대학원생입니다.

답변을 드리려고 클릭한건 아닌구요..

연골세포 cell line을 유지하다 컨탐이 되서 좀 급하게 세포가 필요한 상황인데..

혹시 실례가 안된다면 Chondrocyte 분양좀 받을 수 있을까요??

괜찮으시다면 hwj915@hanmail.net 메일 하나 부탁드립니다.

 

 

 

권빵훈  |  04.01 14:16   
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