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[실전 실험 프로토콜 101] #11. 5’ RACE (Rapid amplification of cDNA ends)-PCR
생명과학 세오 (2022-05-12)

RACE의 필요성

cDNA (complementary DNA)는 세포에서 단백질의 기능 연구 혹은 단백질을 다량 생산하는 데 필요합니다. 또한 5’ 비번역 영역 (untranslated region)이 mRNA 안정성, 세포 내에서의 위치 혹은 번역 (translation) 효율과 관련된 구조적 정보를 가지고 있습니다. 따라서 전체 cDNA의 정보를 아는 것은 중요합니다. 하지만, mRNA를 이용하여 cDNA를 합성하는 경우 5’ 말단이 모자란 불완전한 cDNA가 많이 생성되어서 5’ 말단의 정보를 얻을 수 없는 경우가 많습니다. cDNA 에서 5’ 말단의 정보를 알게 되면 cDNA의 전체 길이도 알 수 있고, 전사 개시 부위 (transcription start site)에 대한 정보를 얻을 수 있습니다 (그림 1).

추출한 mRNA에서 역전사효소 (reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성하는 경우 많은 경우 역전사효소가 mRNA의 끝까지 합성하지 못하고 중도에 mRNA에서 떨어져 나가 cDNA의 5’ 말단과 3’ 말단이 완전하게 합성되지 않습니다. 그러므로 완전한 cDNA를 얻기 위해 5’ 말단과 3’ 말단을 결정하는 것은 매우 중요합니다. cDNA 말단의 급속증폭법 (Rapid amplification of cDNA ends, RACE)은 5’ 말단과 3’ 말단을 포함한 완전한 cDNA 전체 길이의 염기서열을 아는 방법의 하나입니다. cDNA의 5’ 말단 (5’ RACE-PCR)과 3’ 말단 (3’ RACE-PCR)의 정확한 염기서열을 얻는 방법의 원리는 같지만, 실험 방법은 조금 다릅니다. 이번 연재에서는 5’ RACE-PCR를 소개하겠습니다.
 

A. 게놈 염기서열에서 프로모터, 전사 개시 부위

그림 1. A. 게놈 염기서열에서 프로모터, 전사 개시 부위 (TSS), Coding sequence (start codon and stop codon), Transcription stop site [출처 1]. B. Polyadenylation signal, site, and tail [출처 2].


RACE의 실험 방법

추출한 total RNA에 DNase를 처리합니다. 배경 (background)을 줄이기 위해서 mRNA enrichment를 합니다. 1 µg의 poly(A) + RNA를 이용해서 5’ RACE를 합니다. 5’ 말단 부분 cDNA를 파악하기 위해서 타깃 cDNA의 이미 알고 있는 염기서열을 이용하여 GSP (gene-specific primer)-RT를 디자인합니다 (노트 1). GSP-RT를 이용하여 역전사해서 1st strand cDNA를 만듭니다 (그림 2A). RNase H를 넣어서 RNA 템플레이트 (template)를 제거합니다. Poly(A) tail을 Tdt (Terminal deoxynucleotidyl transferase)와 dATP를 이용해서 해서 1st strand cDNA의 5’ 말단에 링커를 붙입니다 (그림 2, 노트 2). 그리고서 5’ 말단에 링커를 붙인 cDNA를 템프레이트로 하여 QT 프라이머 (primer), Q0 프라이머, 그리고 GSP1 프라이머를 이용해서 증폭합니다 (그림 2, 노트 1). 증폭한 PCR 샘플을 1:20으로 희석을 한 것을 템플레이트로 하여 두 번째 PCR 증폭을 합니다. 이때 특이적인 PCR 결과물을 높이기 위해 QI와 GSP2 프라이머를 이용하여 증폭 (nested PCR)을 합니다 (그림 2, 노트 1). PCR 한 샘플을 아가로즈 젤 (agarose gel)에다 로딩합니다. 타깃 밴드에서 추출한 DNA를 T-vector로 옮긴 다음, 콜로니 PCR과 엔자임 (restriction enzyme) 컷 과정을 거쳐 시퀀싱을 합니다 (그림 2B-C). PCR에서 타깃 샘플의 시퀀싱 과정은 연재 3 (누구보다 빠르게…)에서 다루었습니다 [출처 3].
 

upload_image

그림 2. 5’ RACE-PCR 수행 방법과 결과. A. 5’ 말단 부분의 cDNA [출처: 4]. Q0, QT, QI (노트 1). GSP: Gene-specific primer. B. 두 번째 (nested) PCR [출처: 본인]. 표시된 지역이 타깃 밴드. RT: reverse transcriptase. C. 콜로니 PCR 후 엔자임 컷 [출처: 본인]. 콜로니 PCR 결과에서 타깃 밴드가 나온 것만 미니프렙 (minipreo)을 한 후 추가로 엔자임 컷을 해서 인서트 (insert)가 들어있는지 확인을 합니다 [출처 3]. 


노트

  1. 5’ RACE-PCR  프라이머 [출처 4]

QT

5’- CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

The 52 nucleotide QT primer (5’ QO-QI-TTTT 3’) contains a 17-nucleotide oligo-(dT) sequence at the 3’ end followed by a 35-nucleotide sequence encoding Hind III, Sst I, and Xho I recognition sites.

QO

5’- CCAGTGAGCAGAGTGACG-3’

The QI and QO primers overlap by a single nucleotide

QI

5’-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3’

The QI primer contains all three of the restriction enzyme recognition sites.

GSP1

Gene-specific primer 1

GSP2

Gene-specific primer 2

GSP-RT

Gene-specific primer, used for reverse transcription

  1. 5’ 말단의 1st strand cDNA에 링커를 붙일 때 poly(C) 테일 보다는 poly(A) 테일로 하는 것이 좋습니다. Poly(A) 테일로 하는 경우 3’ RACE-PCR를 할 때 같은 3’ 말단에 자연적으로 poly(A) 테일이기 때문에 adapter 프라이머를 사용할 수 있습니다 (그림 1B, 2A). 또한 A:T 결합이 G:C 결합보다 약하기 때문에 비특이적인 결합을 줄일 수 있습니다.

 

출처

  1. https://www.chegg.com/learn/biology/introduction-to-biology/promoter-analysis-in-genome-sequences
  2. https://www.imgt.org/IMGTeducation/Aide-memoire/_UK/poly/
  3. https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=332851&Page=1
  4. https://www.nature.com/articles/nprot.2006.480
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세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)

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  댓글 3 댓글작성: 회원 + SNS 연동  
구글회원 작성글 Ch**********  (2022-05-18 01:51)
1
5'UTR 시퀀스만 확인하고 싶은데, 단순히 첫번째 cDNA 합성후 RNaseH 처리한뒤 gel extraction 해서 시퀀싱 하면 안될까요?
ssDNA라서 unstable 할까요?

Stability 와 DNA양을 고려해서, 두번째 cDNA 합성한뒤 TA vector cloning 스킵하고 시퀀싱해도 결과가 나오지 않을까요? 어떻게 생각하세요?
회원작성글 세오  (2022-05-18 04:41)
2
출처 4의 페이퍼에 두번째 PCR를 통해 비특이적인 밴드 (non-specifically amplified products)를 제거해야 한다고 되어 있습니다. 두 번째 PCR 과정이 꼭 필요한 단계라고 설명되어 있습니다.

예상되는 PCR 샘플을 정확하게 알고 있을 때는 바로 시퀀싱을 통해 결과를 확인할 수 있습니다. 저의 경우에는 transcription start site를 알기 위해서 TA vector cloning으로 시퀀싱을 했습니다. 논문을 검색해 보면 5'RACE 한 샘플을 high-throughput sequencing (5'RACE-Seq)을 하는 경우도 있습니다.
구글회원 작성글 Ch**********  (2022-05-18 05:33)
3
알겠습니다!! 감사합니다!! :)
 
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