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[후배에게 주고 싶은 면역학 연구 노트] #6_EAE 연구 활용법
생명과학 박은총 (2020-10-14)

이전 연재글을 통해 자가면역질활 중 다발성 경화증(Multiple sclerosis)의 마우스 질병 모델인 EAE(Experimental autoimmune encephalomyelitis)에 대한 개념을 소개하였습니다. 이번 글에서는 해당 모델을 통해 얻을 수 있는 데이터들은 어떤 것들이 있으며 이를 통해 어떤 연구들이 가능한지 소개하도록 하겠습니다.

 

1. EAE clinical scoring

EAE를 유도하면 중추신경계에서 염증이 발생하고 이로 인해 신경세포의 Demyelination이 일어나게 됩니다. 이러한 염증 및 조직의 손상을 측정하는 것도 중요한 데이터이지만, 이러한 현상을 보기에 앞서 밖으로 드러나는 병리학적 증상들을 우선적으로 관찰하는 것이 일반적입니다. 물론 설명한대로 염증으로 인한 Demyelination이 원인이지만, 이로 인해 결과적으로 운동능력의 상실 및 마비가 일어나게 되는데 이런 병리학적 증상들은 단계적으로 발생하며, 이러한 단계별 증상에 점수를 부여함으로써 질병의 정도를 수치화할 수 있습니다 (그림 1). 특정 유전자가 결손되었거나 특정 치료약물을 처리한 실험그룹과 대조그룹 간의 질병이 나타난 시기를 비교하거나 점수를 비교함으로써 해당 유전자 혹은 해당 약물이 EAE 발병 및 악화에 미치는 영향을 알 수 있습니다. 추가적으로 질병이 악화됨에 따라 몸무게의 감소도 동반되기 때문에 체중의 변화도 하나의 데이터로 사용될 수 있습니다. 보통 증상이 가시적으로 나타나기에 앞서 체중의 감소가 먼저 나타가기 때문에 체중 감소를 질병의 전조증상으로도 볼 수 있습니다.

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EAE를 유도한 후 10~14일정도 지나면 마우스의 꼬리부터 마비가 나타납니다. 시간이 경과함에 따라 꼬리뿐만 아니라 뒷다리의 움직임도 둔해지고 결과적으로는 뒷다리를 전혀 움직이지 못하고 앞다리 힘도 줄어드는 상태까지 증상이 심해지게됩니다. 증상에 따라 단계별로 부여하는 점수는 실험실마다 조금씩 차이는 있습니다. 제가 속한 실험실에서는 다음 기준에 따라 점수를 차등 부여하고 있습니다. 유의할 점은 점수에 따라 기재된 증상은 이전 증상에 추가적으로 나타나는 증상이지 이전 증상이 사라지고 새로운 증상이 나타나는 것이 아니라는 점입니다.

0: 무증상
0.5: 꼬리 끝 부분이 마비된다.
1.0: 꼬리 전체가 마비된다.
1.5: 케이지(cage)를 덮는 스테인레스 탑 (stainless top)에 마우스를 놓고 걷게 했을 때 간헐적으로 한쪽 뒷다리가 아래로 떨어진다.
2.0: 꼬리를 잡고 마우스를 거꾸로 들었을 때 뒷다리가 바깥으로 쭉 펼쳐지지 않는다.
2.5: 스테인레스 탑을 걷게 했을 때 마우스의 뒷다리가 아래로 계속 떨어지지만 다리를 겨우 끌어올릴 수 있다.
3.0: 스테인레스 탑을 걷게 했을 때 떨어진 뒷다리를 끌어올리지 못하고 발이 떨리기만 한다.
3.5: 뒷다리가 완전히 마비되어 전혀 움직이지 않는다.
4.0: 앞다리의 힘이 빠져서 스테인레스 탑을 붙잡지 못한다.
4.5: 죽거나 극심한 체중 감소(30% 감소)로 인한 안락사가 불가피하다.

증상이 처음 나타난 후 보통 4일정도 지나면 3.5 ~ 4.0점 정도의 심한 증상을 관찰할 수 있습니다. 며칠 더 지나면 염증을 억제하는 기능을 하는 Treg cell로 인해서 1.0 ~ 2.0점 정도로 증상이 일부 호전되기도 하지만, 완벽한 회복은 일어나지 않고 다시 증상이 나빠지게 되는 경우도 생깁니다.

 

2. Passive EAE Scoring

앞서 설명한 EAE의 증상들은 MOG peptide를 이용한 Active EAE의 경우 나타나는 증상들입니다. 하지만 Rag KO mouse나 Tcra KO mouse 등 T cell이 없는 마우스를 Recipient mouse로 이용하여 in vitro 배양한 2D2 Th1 cell 혹은 2D2 pathogenic Th17 (pTh17) cell을 Adoptive transfer하여 유도한 Passive EAE의 경우 조금 다른 증상들을 보입니다.

1) 증상이 최고점에 다다른 후에 회복이 일어나지 않습니다. Active EAE의 경우 시간이 지나면 증상이 일부 나아지는 경향을 관찰할 수 있지만, T cell이 결필된 Recipient mouse를 이용한 Passive EAE의 경우 Treg cell이 없기 때문에 강한 염증이 지속적으로 발생하고, 이로인해서 증상이 호전되지 않습니다.

2) pTh17 cell로 유도된 Passive EAE의 경우 절반정도의 마우스에서 Active EAE에서 보이지 않는 증상들을 관찰할 수 있는데, 이를 연구한 논문에서는 이를 Non-classical EAE 또는 Atypical EAE로 명명합니다 (Domingues et al., 2010). 보통 EAE에서 처음 발견되는 증상은 꼬리의 마비인 것과는 달리 Atypical EAE에서는 보행능력의 상실이 먼저 관찰됩니다. 이와 관련하여 해당 논문에서는 다음과 같이 점수를 부여합니다.

0: 무증상
1: 머리가 살짝 돌아간다 (꼬리 마비 없음).
2: 머리가 확연하게 돌아간다.
3: 똑바로 직진하지 못한다.
4: 옆으로 눕는다.
4.5: 앞으로 나아가지 못하고 제자리에서 빙글빙글 돈다.
5: 죽거나 안락사 해야할 시점이다.

이를 근거로 하여 제가 속한 랩에서는 다음과 같이 조금 더 구체화하여 점수를 부여하고 있습니다.

0: 무증상
1: 머리가 살짝 돌아간다 (꼬리 마비 없음). 또는 마우스를 꼬리를 잡고 거꾸로 들었을 때 한 쪽 다리를 바깥쪽으로 펴지 못한다.
2: 머리가 확연하게 돌아간다. 또는 케이지(cage)를 덮는 스테인레스 탑 (stainless top)에 마우스를 놓고 걷게 했을 때 간헐적으로 한쪽 뒷다리가 아래로 떨어진다.
2.5: 마우스를 꼬리를 잡고 거꾸로 들었을 때 양쪽 뒷다리를 바깥쪽으로 펴지 못한다.
3.0: 똑바로 직진하지 못한다. 또는 한 쪽 뒷다리가 마비되어 움직이지 못한다.
3.5: 옆으로 눞는다. 또는 뒷다리가 모두 완전히 마비되어 움직이지 못한다.
4.0: 옆으로 누워서 앞으로 나아가지 못하고 제자리에서 빙글빙글 돈다.
4.5: 죽거나 안락사 해야할 시점이다.

 

3. 조직 및 면역세포 분석

앞서 본 Clinical scoring은 염증으로 인해 발생한 병리학적 증상들을 데이터화한 것입니다. 두 그룹간 점수 혹은 발병시기에 차이가 있다면, 그 원인은 궁극적으로 마우스 내부에서 일어난 면역학적 현상 및 염증으로 인한 조직 손상의 차이에서 찾을 수 있을 것입니다.
면역반응이 시작되는 곳은 Lymph node이며 염증이 발생하는 곳은 Spinal cord이기 때문에 일반적으로 이 두 곳에서 얻는 면역세포들을 주로 분석합니다. 참고로 Injection site에 근접한 draining lymph node는 Inguinal lymph node입니다. 물론 원하는 목적에 따라 혈액, 장, 폐 등 다른 기관들에 있는 면역세포들을 분석 할 수 있습니다. 어떤 연구기법들을 통해 EAE의 발병 기전을 연구할 수 있는지 소개하도록 하겠습니다.

1) Flow cytometry

면역학 연구에서 빠질 수 없는 Flow cytometry 분석을 이용하여 면역세포의 조성을 비교할 수 있습니다. 예를 들어 EAE의 원인이 되는 CD4 T cell의 분화정도 및 CD4 T cell이 만들어내는 Cytokine의 종류를 Flow cytometry를 통해 비교분석 할 수 있습니다. 또한 Flow cytometry를 이용하여 특정 면역세포의 비율을 구함으로써 Spinal cord에 존재하는 Neutrophil, Inflammatory monocytes, γδ T cells 등 다양한 면역세포의 수를 비교할 수도 있습니다.

Spinal cord로 부터 면역세포를 얻기 위해서는 보통 Collagenase D를 사용하여 조직의 Extracelluar matrix를 분해하는 과정이 필요합니다. Collagenase D는 세포막단백질에 영향을 거의 주지 않는 것으로 알려져있으나, 연구자 본인이 연구하는 세포막단백질이 혹시라도 Collagenase D에 의해 영향을 받는다면 이 부분을 고려해야할 것입니다. 또한 Spinal cord는 상당히 많은 양의 지질을 갖고 있기 때문에 Percoll gradient를 이용한 원심분리를 통해 지질층을 제거하는 과정이 필요합니다.

2) Immunohistochemistry

Flow cytometry를 이용해 Lymph node에서 면역 세포의 분화 및 Spinal cord로의 면역세포의 이동을 비교분석하는 것 뿐만 아니라 Spinal cord의 조직 단면 자체를 관찰하는 것을 통해 Demyelination 정도나 특정 면역세포의 조직내로의 침윤 정도 및 위치 등을 비교할 수 있습니다 (그림 2). 면역세포들이 Spinal cord로 이동할 때 Lumbar 5 쪽에서부터 침투가 시작되기 때문에(Arima et al., 2012) Lumbar 5 부분으로부터 얻은 Section을 주로 활용합니다.

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3) Two-photon microscopy
Two-photon microscopy는 생체 내에서 면역세포의 이동을 실시간으로 측정할 수 있는 기법이기 때문에 면역세포의 이동을 연구하거나 다른 면역세포들과의 상호작용을 실시간으로 분석하는 등의 목적에 따라 EAE 연구에 사용될 수 있습니다 (Bartholomaus et al., 2009) (그림 3). 하지만 실험의 특성상 해당 기법을 셋업하고 익히기까지 드는 시간적/경제적 비용이 상대적으로 크다는 단점이 있습니다. Two-photon microscopy를 이용해 살아있는 생체 내에서 뿐 아니라 분리해낸 Spinal cord 전체를 스캔하여 Spinal cord내 특정 면역세포의 분포를 확인할 수도 있습니다 (Othy et al., 2020) (그림 4).

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4) Single-cell analysis: Immune cell heterogeneity 연구

면역세포는 사실 우리가 분류하는 기준 이상으로 다양성(Heterogeneity)을 가집니다. 예를 들어 IL-17A를 발현하는 CD4 T cell을 통상적으로 Th17 cell이라고 부르지만, 그 안을 더 자세히 들여다보면 IFN-γ, GM-CSF, TNF-α 등등 다른 Cytokine을 동시에 발현하는 Th17 cell이 존재합니다. Th17 cell을 예로 들었지만, 면역세포의 Heterogeneity는 T cell 뿐만 아니라 Myeloid lineage cell에서도 상당히 많이 관찰되고 연구되고 있습니다. 이러한 Immune cell heterogeneity는 면역세포의 초기 발생과정에서도 결정되지만, 염증상황이 만들어내는 환경에 의해 발생하기도 합니다. 따라서 자가면역질환 환자에게서 유독 특정 면역세포가 많이 발견되기도 있습니다. 이러한 Immune cell heterogeneity를 연구하는데 있어서 Single-cell RNAseq이 널리 이용됩니다. 이런 부분에 착안하여 EAE를 유도한 마우스에서 얻은 면역세포를 Single-cell RNAseq 기법으로 분석하여 EAE, 더 나아가 Multiple sclerosis 발병과정에서 면역세포가 어떻게 다양하게 구성되고 어떤 유전자가 특정 면역세포의 발달에 기여하는지를 연구할 수 있습니다 (Gaublomme et al., 2015; Wheeler et al., 2020)

 

4. EAE 연구 Tip

EAE를 이용한 연구를 함에 있어서 실질적으로 도움이 될만한 내용들을 소개합니다.

1) Gut microbiota에 대한 이해

다른 많은 In vivo 실험들이 그렇듯이, EAE 역시 실험 간에 존재하는 다양한 변수들로 인해 실험을 할 때마다 결과가 조금씩 다르게 나옵니다. 어떤 때는 발병이 빠르고, 또 어떤 때는 발병이 더디기도 합니다. 물론 여러가지 변수들이 있습니다. 가장 먼저는 실험을 할 때마다 생기는 시약들(MOG peptide, CFA, Pertussis toxin)의 양 및 안정성(Stability)의 차이가 생깁니다. 하지만 이것 말고도 존재하는 변수가 있는데 마우스의 장내 세균총(Gut microbiota)의 차이입니다.

장에 서식하는 다양한 세균들은 면역반응은 직간접적으로 상당부분 기여합니다. 예를 들어 Germ-free 마우스의 경우 EAE가 잘 유도되지 않고 유도되더라도 Clinical score가 낮습니다. SFB라는 박테리아는 마우스의 장에서 Th17 cell의 분화를 유도하는 것으로 알려져있는데, 이 박테리아는 EAE발병에 관여합니다(Lee et al., 2011). 또한 박테리아가 만드는 Short chain fatty acid는 Treg cell 분화에 관여합니다(Smith et al., 2013). 흥미롭게도 최근 Nature에 발표된 연구에 따르면 Lactobacillus reuteri라는 세균은 MOG와 유사한 단백질을 만들고 이로인해 MOG-specific Th17 cell 분화에 기여하기도 합니다(Miyauchi et al., 2020). 이처럼 다양한 장내세균이 EAE 유도에 영향을 줍니다. 따라서 비교할 그룹의 마우스들을 같은 케이지에서 키움으로써 장내세균총을 유사하게하는 것이 EAE에 영향을 주는 변수를 줄이는 하나의 방법이 될 수 있습니다. 같은 이유로 동물실에 따라 EAE의 발병정도에 차이가 생길 수 있기 때문에 만약 EAE가 유도되지 않는다면 동물실을 옮겨보는 것도 하나의 해결방법이 됩니다. 제가 속한 연구실의 경우 마우스를 관리하는 동물실을 변경했더니 갑자기 EAE가 유도되지 않아 애를 먹었고, 다시 다른 동물실로 동물을 옮기니 EAE가 다시 유도되는 미스테리한 일을 경험했습니다.

2) Spinal cord harvest : meninge가 섞이는 것 주의

Spinal cord를 분리하는 방법은 크게 두 가지 입니다. 한 가지는 척추뼈의 양 말단을 자른 후 한 쪽에 PBS를 주사기로 강하게 밀어넣어 척수가 반대편에서 밀려 나오도록 하는 방법입니다. 다른 방법은 척추뼈를 뜯어내고 그 안에 있는 척수를 집어내어 분리하는 방법입니다. 그런데 이러한 방법의 차이가 분석될 샘플의 차이를 만들어냅니다.

주사기를 이용해 Spinal cord를 분리한 후 척추뼈를 뜯어보면, 뼈 내부에 Spinal cord meninge가 붙어 남아있는 것을 확인할 수 있습니다. 즉, 주사기를 이용해서 Spinal cord를 분리할 때는 Spinal cord meninge를 제외한 Parenchyma 부분이 분리되는 것입니다. 물론 Meninge와 Parenchyma가 완벽히 분리된다고 보기에는 어려울 것이고 Meninge의 일부도 딸려 나올 것이라고 여겨지지만, 주사기로 밀어내 분리한 Spinal cord parenchyma와 뼈 내부에 붙어있는 Meninge를 비교분석해보면 안에 존재하는 면역세포의 조성이 다르다는 것을 알 수 있습니다 (그림. 5). 그리고 그림. 5에 해당하는 CD4 T cell을 더 분석해보면 그 안에 존재하는 Subset의 비율도 다릅니다. 게다가 Meninge에 있는 면역세포의 숫자도 결코 무시할 수준이 아니고, 이 정도는 EAE의 발병 단계에 따라서도 많이 차이가 납니다. 이런 이유로 Meninge가 섞이도록 Spinal cord를 분리할 경우 분석에 오류가 발생할 수 있습니다. 따라서 척추뼈를 뜯어서 Spinal cord를 분리하는 방법은 샘플에 Meninge라는 변수를 추가하게 될 가능성이 높기 때문에 추천하지 않는 방법입니다. 보통 주사기를 이용해 밀어내는 방법이 아직 익숙하지 않을 때 몇번 시도했으나 Spinal cord가 나오지 않아서 차선책으로 뼈를 뜯어내는 경우가 생깁니다. 이러한 경우 Meninge가 샘플에 딸려오지 않도록 주의하는 것이 실험의 정확도를 높이는 방법입니다. 이를 위해서 척추 뼈 내에 어떤 부분이 Meninge인지 미리 알아두는 것이 도움이 됩니다.

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3) Scoring의 일관성 유지

EAE를 유도한 후 관찰되는 증상들에 대한 Scoring의 경우 비교적 직관전인 가이드라인이 존재하지만, 어찌되었든 사람에 따라 주관적으로 판단하게 될 소지가 충분히 있습니다. 따라서 Scoring의 경우 한 명의 연구자가 일관성있게 지속적으로 하는 것이 필요합니다. 물론 주말을 포함해 매일 동물실에 가서 Scoring을 하기가 쉽지는 않지만 좋은 데이터를 얻기위해서 필요한 하나의 과정입니다.

Scoring을 하는 시간대도 중요합니다. EAE로 인한 증상이 이제 막 시작되는 경우에는 짧은 시간 안에 증상이 급격하게 나빠지는 경우들이 있습니다. 예를 들어 오전에는 증상이 없었는데 오후가 되어서 증상이 보이거나 오전에는 Score가 낮았는데 오후가 되니 더 높은 Score에 해당하는 증상들을 보이는 경우입니다. 이러한 이유로 매일 같은 시간대에 마우스를 관찰하는 것이 변수를 줄이고 일관성을 유지하는 방법입니다.

4) Emulsification의 일관성 유지

EAE 유도는 MOG peptide와 CFA를 섞어주는 Emulsification에서 시작됩니다. 보통 MOG peptide가 섞인 PBS와 CFA를 1:1 비율로 섞어주는데, 문제는 CFA가 점성이 높아서 파이펫을 이용해 정량할 때 오차가 발생하기 쉽다는 점입니다. 또한 두 개의 Glass syringe를 연결하는 과정에서 CFA를 흘리는 실수가 발생해서 CFA의 부피가 줄기도 합니다. 이러한 정량과정에서의 오차는 결국 EAE로 인한 면역반응의 강도에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 늘 일관성있게 부피를 정량하는 것이 실험간의 변수를 줄이는 방법입니다.

추가적으로 양 손에 Glass syringe를 쥐고 Emulsification을 하다보면 손바닥으로 Syringe를 움켜쥐기도합니다. 그런데 이렇게 Syringe를 움켜잡을 경우 체온에 의해 Emulsion의 온도가 올라갑니다. 이렇게 상승된 온도는 MOG peptide의 안정성에 영향을 줄 수도 있습니다. 물론 이정도 온도상승과 짧은 노출 시간이 엄청나게 큰 영향을 주지는 않겠지만, Emulsification 과정과 시간을 일관성 있게 유지하는 것도 일관성 있는 데이터를 얻는데 도움이 될 것입니다.

 

5. 마치는 글

이번 연재를 통해서는 EAE를 통해 얻을 수 있는 데이터의 종류와 EAE를 이용한 연구에 실질적으로 도움이 될만한 정보들을 소개했습니다. EAE를 이용한 연구를 하지 않는 분들께는 다소 생소한 내용일 수 있으나, 실제적으로 EAE를 이용한 연구를 하고있는 연구자분들께 조금이나마 도움이 되었기를 바라며 이번 글을 마무리 짓겠습니다.

 

References

Arima, Y., Harada, M., Kamimura, D., Park, J.H., Kawano, F., Yull, F.E., Kawamoto, T., Iwakura, Y., Betz, U.A., Marquez, G., et al. (2012). Regional neural activation defines a gateway for autoreactive T cells to cross the blood-brain barrier. Cell 148, 447-457.

Bartholomaus, I., Kawakami, N., Odoardi, F., Schlager, C., Miljkovic, D., Ellwart, J.W., Klinkert, W.E., Flugel-Koch, C., Issekutz, T.B., Wekerle, H., et al. (2009). Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature 462, 94-98.

Domingues, H.S., Mues, M., Lassmann, H., Wekerle, H., and Krishnamoorthy, G. (2010). Functional and pathogenic differences of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. PLoS One 5, e15531.

Gaublomme, J.T., Yosef, N., Lee, Y., Gertner, R.S., Yang, L.V., Wu, C., Pandolfi, P.P., Mak, T., Satija, R., Shalek, A.K., et al. (2015). Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell 163, 1400-1412.

Lee, Y.K., Menezes, J.S., Umesaki, Y., and Mazmanian, S.K. (2011). Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A 108 Suppl 1, 4615-4622.

Miyauchi, E., Kim, S.W., Suda, W., Kawasumi, M., Onawa, S., Taguchi-Atarashi, N., Morita, H., Taylor, T.D., Hattori, M., and Ohno, H. (2020). Gut microorganisms act together to exacerbate inflammation in spinal cords. Nature 585, 102-106.

Othy, S., Jairaman, A., Dynes, J.L., Dong, T.X., Tune, C., Yeromin, A.V., Zavala, A., Akunwafo, C., Chen, F., Parker, I., et al. (2020). Regulatory T cells suppress Th17 cell Ca(2+) signaling in the spinal cord during murine autoimmune neuroinflammation. Proc Natl Acad Sci U S A 117, 20088-20099.

Smith, P.M., Howitt, M.R., Panikov, N., Michaud, M., Gallini, C.A., Bohlooly, Y.M., Glickman, J.N., and Garrett, W.S. (2013). The microbial metabolites, short-chain fatty acids, regulate colonic Treg cell homeostasis. Science 341, 569-573.

Wheeler, M.A., Clark, I.C., Tjon, E.C., Li, Z., Zandee, S.E.J., Couturier, C.P., Watson, B.R., Scalisi, G., Alkwai, S., Rothhammer, V., et al. (2020). MAFG-driven astrocytes promote CNS inflammation. Nature 578, 593-599.

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박은총 (Duke University)

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  댓글 2 댓글작성: 회원 + SNS 연동  
회원작성글 맛동산v  (2020-10-16 14:46)
1
항상 좋은 내용 감사합니다. 저는 spinal cord 를 분해할때 척추뼈를 뜯어내고 spinal cord 를 수득하는 방법을 사용합니다. 그 경우 크기가 작으나 의미가 있는 L-spine 쪽의 조직을 얻기가 힘들었습니다. 주사기를 통해서 척수를 분리하는 방법을 몇번 시도했었는데 (당시 JOVE에 있는 동영상을 보고 시행을 하였으나) 익숙치 않아서 그런지 spinal cord 를 얻기가 어려웠습니다. 이 부분에 대해 조금더 자세히 설명을 해주실수 있는지 질문드립니다.
회원작성글 박은총  (2020-10-17 01:07)
2
맛동산v님, 질문주신 내용에 답변 드립니다. 구체적으로 설명하자니 내용이 다소 자극적일 수 있으니 양해부탁드립니다.

Perfussion하신 후에 머리를 제거해서 척추 말단이 노출되도록합니다.

마우스의 등이 위를 향하도록 Dissection station에 올려둡니다 (저는 50 ml 튜브 꽂는 스티로폼 랙을 이용합니다).

등 부분의 가죽을 제거해주고 뒷발을 핀으로 고정해서 척추가 일자가 되도록 둡니다. 어깨가 있는 부분이 접혀서 경추 부분이 덮이기도 하기 때문에 그 부분의 근육 등을 제거해주시면 좋습니다, 필요하다면 앞다리를 제거할 수도 있습니다. 등부분의 가죽을 다 제거하시는 것이 좋습니다. 칼집을 내고 손으로 잡아당기면 손쉽게 가죽을 벗길 수 있습니다. 이 때 피하에 있던 MOG+CFA emulsion이 튈 수 있으니 주의하셔야합니다.

목 부분이 위로 꺾여서 올라가면 Spinal cord가 잘 나오지 않을 수 있습니다. 구조적인 문제 때문에 엉덩이 부분은 높고, 허리등은 아래를 향해 내려가고, 다시 목부분이 위로 꺾여 올라오기 쉽습니다. 최대한 일자가 되도록 이런 부분을 잘 정리해주시면 좋습니다. 조금 잔인하지만, 저는 분리된 머리를 가슴 아래에 받쳐 두어서 척추가 지면과 최대한 평행하게 되도록 높이를 맞춰줍니다.

골반 바로 윗부분의 척추를 한 번에 수술용가위로 절단합니다. 가위를 벌리고 허리를 따라 아래를 내려가다보면 걸리는 곳이 있습니다. 그 부분을 절단하시면 됩니다. 이 때 하반신을 전체 제거하는 것이 아니라 뼈가 절단되지만 몸이 뒷다리에 붙어서 고정되도록 하는 것입니다. 자르는 위치가 너무 아래가 되면 척추뼈의 단면이 너무 좁아서 나중에 바늘을 넣을 수 없고, 너무 위를 자르게되면 Lumbar 부분을 잃어버리게 됩니다. 연습을 통해 위치를 익히는 과정이 필요합니다.

3ml syringe (21G needle)에 PBS를 채우고, 등쪽에 바늘을 넣어서 강하게 밀어줍니다. 강하게 한 번에 밀어주는 것이 중요합니다. 너무 살살 밀어서 분리가 안 되면 PBS에 의해 Lumbar부분이 손상되고 역류해서 나오게 됩니다. 바늘을 또한 너무 깊게 집어넣어도 Lumabr 부분이 손상됩니다. 연습을 통해 감을 익히는 과정이 중요합니다.

가끔 Spinal cord가 반으로 쪼개져서 절반만 나오고 나머지 절반은 안에 머물러 있는 경우도 생깁니다. 한 번 더 PBS를 넣어주어서 혹시라도 남아있는 Spinal cord가 나오도록 해줍니다. 한 번 분리가 되면 이후에는 쉽게 나옵니다.

이렇게해서 분리하면 Spinal cord가 목 부분으로 나와서 날아가게되는데, 이 과정에서 분실되거나 오염되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

글로 설명하는 것이 쉽지 않습니다만, 연습을 많이 하는 것이 큰 도움이 됩니다.


뼈를 뜯어낼 경우에는 개인적으로 배쪽에서 접근하는 것이 더 쉬운 것 같습니다. 내부 장기를 모두 제거하고 갈비뼈를 제거하여 비교적 깨끗한 조직을 분리한 뒤, 목부분부터 시작해서 척추 뼈의 옆부분을 가위로 조금씩 자르고 잘린 부분을 (배 쪽에서) 집어 올리는 과정을 반복하면 Spinal cord가 깔끔하게 노출됩니다. 다만 이 때 사용하는 가위는 날이 크지 않고 작아야 Spinal cord에 손상을 적게 줍니다. 그리고 글에서 설명했지만, 이렇게 분리할 경우 Meninge를 제거하기가 쉽지는 않습니다.

방법도 중요하지만 일관성있는 분석방법이 더 중요한 것 같습니다. 추가적으로 질문이 있으시다면 eunchong.park@duke.edu로 연락주셔도 됩니다.
 
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