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신규 유전자가위, 표적에 정확히 작동하는지 규명했다
생명과학 한국생명공학연구원 (2020-09-10)

국내연구진이 DNA 염기 하나만을 바꾸는 유전체 교정 도구 ‘Cpf1 기반 염기교정 유전자 가위(Cpf1-linked base editors, 이하 염기교정 유전자 가위)’의 정확성을 입증하는데 성공했다. 염기교정 유전자 가위의 성능과 정확성이 확인됨에 따라 이를 이용한 유전자 교정기법이 유전자치료 등에 널리 사용될 것으로 기대된다.

한국생명공학연구원(이하 생명연) 유전체교정연구센터 김대식 박사팀(교신저자 겸 제1저자: 김대식 박사)과 기초과학연구원(IBS) 유전체 교정 연구단 김진수 수석연구위원 연구팀 (교신저자 : 김진수, 공동 제1저자 : 임가영)이 공동으로 수행한 이번 연구는 기초과학연구원(IBS) 및 국가과학기술연구회가 추진하는 창의형 융합연구사업(CAP)의 지원으로 수행되었고, 네이쳐 커뮤니케이션지(Nature Communications, IF 11.878) 8월 13일자온라인 판에 게재되었다.
(논문명 : Genome-wide specificity of dCpf1 cytidine base editors)

생명체에 대한 모든 정보를 담고 있는 DNA는 네 개의 염기로 구성되어 있다. 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G) 염기는 서로 쌍을 이뤄 순서를 만들고 3개의 염기를 조합해 코돈(Codon)으로 유전 정보를 저장한다. DNA 염기서열이 중요한 이유는 단일 염기 하나만 잘못 되어도 심각한 병을 초래하기 때문이다. 낭성 섬유증, 겸상 적혈구 빈혈증 등은 특정 염기 하나가 잘못되어 발생하는 대표적인 유전질환이다.

이러한 질환을 치료하기 위해 크리스퍼 유전자가위(CRISPR/Cas9 혹은 CRISPR/Cpf1)를 사용하려는 연구가 많이 진행되었으나, 이는 DNA 염기서열을 잘라 유전자가 작동을 하지 못하게 하는 일은 가능하지만 특정 염기를 바꾸어 주는 것에는 어려움이 있었다.

이를 보완하기 위해 염기교정 유전자 가위(Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위)가 개발되었으나, 염기교정 유전자가위가 표적 위치에 정확히 작동하는지, 비표적 위치에 오작동하지 않는지는 전혀 알려지지 않았었다.

본 연구진은 자체 개발한 절단 유전체 분석 기법(Digenome-seq)으로 세계에서 처음으로 유전체 전체 수준에서 염기교정 유전자가위가 비표적 위치에서 오작동이 일어나는 위치를 확인, 그 정확성을 규명했다.
    ※ 절단 유전체 분석 기법(Digenome-seq) : 유전자가위 처리 전과 후를 유전체 시퀀싱(Genome Sequencing) 방법을 통해 잘린 위치를 구별하는 방식

연구책임자인 김대식 박사는 “동 연구성과는 염기교정 유전자가위의 정확성을 측정한 결과, 염기교정 유전자가위의 DNA에서 오작동이 일어나는 위치가 유전자가위와 다른 것을 확인 한 성과”라며

“이번 연구에서 Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위를 구성하는 탈아미노효소에 변이를 줌으로써 정확성이 더 높은 크리스퍼 염기교정 유전자가위를 제작하였고, Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위의 성능이 확인됨에 따라 향후 이 기술은 유전자 및 줄기세포 치료제 개발, 고부가가치 농축산물 품종 개량 등 널리 활용될 것으로 기대된다.”고 밝혔다.
 

연   구   결   과   개   요

□ 연구배경

○ Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위(dCpf1 Base Editor)는 2018년 상해과학기술대학교의 지아첸(Jia Chen) 교수 연구그룹에서 개발한 인공제한 효소로, 세포 수준에 적용한 바 있다.
○ 단일 염기의 문제로 발생하는 대표적인 유전질환으로는 낭성 섬유증(Cystic Fibrosis)과 겸상 적혈구 빈혈증(sickle-cell anemia)가 있다. 낭성 섬유증은 기관지 안에 점액 분비선에 문제가 생기거나 췌장 소화 효소의 분비를 방해해 폐와 소화기관에 심각한 영향을 미친다. 겸상 적혈구 빈혈증은 낫 모양(초승달 모양)으로 적혈구가 변형되어 산소와 결합력이 감소한다. 두 질환 모두 DNA 서열의 변이로 발병한다. Cpf1 시토신 염기교정 유전자 가위는 기존에 개발된 Cas9 시토신 염기교정 유전자 가위와 유전자 서열이 달라 타겟할 수 있는 DNA 위치가 서로 다르기 때문에 상호 보완적으로 사용 가능하다.
○ 하지만, 이에 대한 정확성이 밝혀지지 않았기 때문에 앞으로의 기술 활용을 위해 Cpf1 시토신 염기교정 유전자 가위의 정확성을 확인하는 연구에 대한 필요성이 꾸준히 제기되어 왔다.

□ 연구내용

○ 연구팀은 절단 유전체 시퀀싱(Digenome-seq)을 이용하여 Cpf1 시토신 염기교정 유전자 가위의 정확성을 유전체 전체수준에서 최초로 입증했다.
○ 이 연구에서 연구팀은 Cpf1 유전자 가위와 Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위가 서로 다른 비표적(off-target) 위치를 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 정확성이 높은 Cpf1 유전자 가위와는 달리 비표적 변이를 많이 일으킴을 확인할 수 있었다.
○ 연구진은 Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위를 구성하는 탈아미노효소에 변이를 줌으로써 정확성이 더 높은 Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위를 제작하였다.

□ 연구성과의 의미

○ Cpf1 시토신 염기교정 유전자 가위의 정확성을 입증 : 이를 이용한 유전자 교정기법이 유전자치료 등에 널리 사용될 것
○ 본 연구를 통해 새로운 염기교정 유전자 가위인 Cpf1 염기교정 유전자 가위의 성능과 정확성이 확인됨에 따라 이를 이용한 유전자 교정기법이 유전자치료 등에 널리 사용될 것으로 기대된다.
○ 정확성이 높은 Cpf1 시토신 염기교정 유전자 가위 개발
○ 기존에 개발된 Cpf1 시토신 염기교정 유전자 가위에 비해 정확성이 향상시킴으로써 이를 이용한 유전자 교정 기법이 널리 사용될 것으로 기대된다.

Cpf1 염기 교정 유전자 가위의 개념 및 작동 원리

그림 1. Cpf1 염기 교정 유전자 가위의 개념 및 작동 원리

Cpf1 시토신 염기교정 유전자 가위는 DNA에 결합하며 자르는 활성이 억제된dead Cpf1 (dCpf1)와 시토신(C)을 우라실(U)로 바꾸어 주는 탈아미노효소 (APOBEC)로 구성된다. TTTN을 PAM으로 하는 dCpf1이 염기교정을 하고자 하는 위치로 염기교정 유전자가위를 인도하고 이중 가닥을 단일 가닥으로 풀어준다. 이 때 탈아미노효소는 DNA가 풀린 위치에 있는 시토신(C)을 우라실(U)로 바꾸어 준다. 이후, 우라실(U)로 바뀐 염기는 DNA 복제 과정에 의해 티민(T)이 된다.

 

Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위 절단 유전체 시퀀싱 기법 적용 과정

그림 2. Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위 절단 유전체 시퀀싱 기법 적용 과정

연구진은 Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위의 정확성을 측정하고자 개량된 절단 유전체 시퀀싱((Digenome-seq) 기법을 이용했다. 기존의 절단 유전체 시퀀싱 기법은 DNA 두 가닥 절단이 유도되어야 하는데, 이번 연구에서는 단일 가닥의 절단 위치를 찾을 수 있는 새로운 기법을 개발하였다.
Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위의 경우 DNA의 시토신 (C)을 우라실(U)로 바꾸어 준다. 그 후 Uracil DNA glycosylase (UDG)와 DNA glycosylase-lyase Endonuclease VIII를 차례로 처리함으로서 DNA에 존재하는 우라실(U)을 제거하고, 이를 이용하여 Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위에 의해 시토신 (C)이 우라실(U)로 변화한 부분에 단일가닥 절단을 유도한다.
 연구진은 이 방법을 활용해 절단 유전체 시퀀싱 기법을 진행한 뒤, 전체 유전체 시퀀싱 기법(Whole genome sequencing)으로 Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위의 정확성을 측정하는데 성공했다.

Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위와 Cpf1 유전자 가위의 비표적 위치 비교

그림 3.  Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위와 Cpf1 유전자 가위의 비표적 위치 비교

DNMT1 유전자의 같은 서열을 target 하는 Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위와 Cpf1 유전자 가위의 비표적 위치 비교한 결과 서로 다른 비표적 위치를 가지고 있음을 확인 할 수 있었다. 이를 통해 Cpf1 시토신 염기교정 유전자가위의 비표적 위치를 찾기 위해서는 이를 이용한 정확성 측정방법을 이용하여야 한다는 사실을 알려준다.

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