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[바이오토픽] CRISPR, 미생물을 넘어서다: 표적지향 유전자 삽입
생명과학 양병찬 (2019-07-05 09:29)

CRISPR, 미생물을 넘어서다: 표적지향 유전자 삽입

The bacterial CRISPR system is an adaptive immune defense mechanism.
A new subtype of CRISPR is now shown to be co-opted by transposons to achieve their insertion into the targeted regions of the genome. This powerful CRISPR-Cas12k system can be programmed to achieve precise and efficient targeted gene insertion, which holds great potential in genome editing applications.
Image: Stephan Schmitz/Folio Art

▶ 대부분의 원핵생물은 바이러스와 이동성 요소(mobile element)에 대응하는 적응적 면역(adaptive immunity)을 구축하기 위해, CRISPR-Cas 시스템(CRISPR-Cas system)에 의존한다(참고 1, 참고 2). CRISPR에서 생성된 소형 RNA는 Cas 이펙터단백질(Cas effector protein)로 하여금 상보적 표적부위를 보유한 침입자들의 핵산을 색출하여 파괴하게 해준다(참고 3). CRISPR에는 여러 가지가 있는데, 그 유형은 각각의 단백질 구성에 기반하여 규정된다. 최근 'II형 및 V형 CRISPR 시스템'과 'Cas9 및 Cas12'에 기반한 「RNA-유도 뉴클레아제(RNA-guided nuclease)」가 프로그램화된 DNA 시퀀스 변형을 가능게 함으로써 유전체편집에 혁명을 일으켰다(참고 4). 그러나 커다란 DNA 분절을 진핵생물의 유전체에 삽입하는 '든든하고 표적화된 방법'은 여전히 도전에 직면해 있다. 이번 주 《Science》 48쪽에서(참고 5), 스트레커 등은 "「CRISPR-관련 트랜스포사제(CAST: CRISPR-associated transposase)」가 RNA의 안내를 받아, 화물 DNA를 대장균(E. coli)의 유전체에 매우 효율적으로 삽입한다"고 보고했다. 한편 클롬페 등은 지난주 《Nature》에 발표한 논문에서(참고 6), 유사한 방식으로 작동하는 또 다른 「CRISPR-유도 DNA 트랜스포사제 시스템(CRISPR-guided DNA transposase system)」을 보고했다(http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=306549). 이러한 연구들은, 유전공학과 유전자요법을 개혁하는 새로운 도구를 제공한다.

▶ 전형적인 CRISPR 어플리케이션에서는, Cas9 또는 Cas12가 가이드 RNA(gRNA)의 안내를 받아, PAM(protospacer-adjacent motif) 옆에 존재하는 '의도된 상보적 유전체 부위(complementary genomic site)'에 도착하여, DNA 이중가닥절단(DSB: DNA double-strand break)을 만든다(참고 4). 유전자편집의 결과는 대체로 숙주세포의 내인성 경로(endogenous pathway)에 의한 DSB 수선에 의존한다. 이 경우 「말단부착 DNA 수리(end-joining DNA repair)」라는 경로가 종종 지배적인데, 이것은 '작은 비상동 DNA'의 삽입/결실(indel)을 유도함으로써 유전자를 파괴하는 경향이 있다. 그러나 많은 어플리케이션들은 커다란 DNA 분절(예: 치료용 유전자, 리포터 유전자)의 표적특이적 삽입(site-specific knock-in)을 요구한다. 이러한 목적은 「상동직접수선(HDR: homology-directed repair)」이라는 경로에 의한 정확한 DSB 수선을 통해 달성될 수 있는데, 이것은 '공급된 DNA 주형'과 '삽입부위 측면의 유전체 영역' 간의 기다란 시퀀스 상동성(long sequence homology)을 요구한다. 그런데 HDR은 비효율적인 데다, 종종 세포주기의 특정 단계나 세포유형에 국한된다는 문제점이 있다(참고 7, 8). 따라서 든든하고 표적화된 DNA 통합을 가능케 하는 도구가 절실히 요망된다.

DNA 트랜스포손은 점핑유전자(jumping gene)라고도 알려져 있는데, 하나의 유전체 위치에서 다른 위치로 움직일 수 있으며, 그들의 재할당과 삽입은 트랜스포사제(transposase)라는 효소복합체에 의해 촉매된다. CAST 시스템은 2017년 이후, 새로운 CRISPR 변이체를 찾아내려는 생물정보학을 통해 발견되었다(참고 9, 참고 10). CAST는 「Tn7-유사 트랜스포손(Tn7-like transposon)」 내부에 코딩된 「I형 또는 V형 CRISPR-Cas」의 축소판으로 구성된다. 이 미니 CRISPR 시스템이 코딩하는 단백질 기구는 I형 CRISPR 시스템의 'Cas3 뉴클레아제-헬리카제'가 결핍되어 있거나, V형 시스템의 Cas12k의 촉매잔기(catalytic residue)에 불활성화 변이를 보유하고 있다. 따라서 그것은 표적시퀀스에 결합할 수는 있지만 DNA를 절단할 수는 없다. 그리하여 그 결함있는 CRISPR는 "「Tn7-유사 트랜스포손」에 의해 하이재킹 되어, 원핵생물의 적응적 방어 이외의 역할을 수행한다"고 추론되었다. 그건 아마도, 세균의 유전체와 다른 이동성 DNA 요소들에 대한 'RNA-유도 전파'를 가능게 함으로써, 트랜스포손의 진화적 성공을 증가시켰을 것으로 보인다(참고 9, 참고 10). RNA를 프로그램밍할 수 있는 것으로 추정되는 CAST의 성질은, 화물 DNA를 반(半)무작위적으로 삽입하는 고전적인 트랜스포사제의 불량한 표적부위 선택성(poor target site selectivity)과 배치된다.

▶ 스트레커 등은 남세균인 Scytonema hofmanni(Sh)와 Anabaena cylindrica(Ac)를 이용한 in vivo 연구에서 두 가지 CAST 로커스(유전자자리)의 기능성을 확립하고, 그 배경에 깔린 메커니즘을 규명했다. 각각의 CAST 로커스는 길이가 20kb(kilobase) 미만이고, 「Tn7-유사 트랜스포손」(tnsB, tnsC, tniQ), 추가적인 화물 유전자, V-K형 CRISPR와 그 이펙터인 Cas12k를 코딩하는 유전자, 그리고 tracrRNA(trans-activating crRNA)로 구성되어 있다. tracrRNA는 Cas12k에 필수적인, 불변성 소형 RNA 보조인자를 말한다. 저자들은 비상동 숙주 E. coli의 플라스미드 DNA에 잠재적 전위(transposition)를 시도했다. 즉, 공여자 플라스미드, 표적 플라스미드와 함께 (모든 CAST 단백질과 RNA 요소들을 코딩하는) 헬퍼 플라스미드를 E. coli에 전달했다. 그 결과, 13~75%의 효율로, 표적화된 공여자 통합(targeted donor integration)이 하나의 특이적인 방향으로 일어났다. 통합은 CRISPR-Cas12k에 의해 안내되었는데, 그 이유는 그게 tracrRNA, 하나의 동족표적(cognate target), 하나의 5′ 측면(flanking) GTN PAM를 필요로 하기 때문이다. 가장 주목할 만한 것은, 삽입부위가 협소한 DNA 시퀀스 창(PAM의 하류로, ShCAST의 경우에는 60~66 bp, AcCAST의 경우에는 49~56 bp) 안에 한방향으로 모여있다는 것이다. 최대 길이 10kb의 공여자 화물은 표적 플라스미드에 효율적으로 통합되었다.

☞ CRISPR-유도 DNA 삽입(CRISPR-guided DNA insertion)

「CAST(CRISPR 관련 트랜스포소나제)가 매개하는 DNA 삽입」은 CRISPR-Cas12k에 의해 유도된다. 삽입된 트랜스포손은 유전공학을 위한 화물 DNA를 포함할 수 있다.

① CAST 시스템이 세포에 전달된다.
② CAST는 'gRNA의 표적 상보성'과 'Cas-12k가 인식하는 측면 PAM'을 통해 숙주세포 속의 표적 DNA 시퀀스를 찾아간다.
③ CAS의 구성요소는 든든한 화물 DNA 삽입을 매개하는데, 그 과정에서 숙주세포 경로에 의한 이중가닥절단(DSB)를 필요로 하지 않는다.
④ 숙주의 유전체에서, 삽입은 PAM 하류의 60~66 bp 지점에서 일어난다.
⑤ '트랜스포손의 말단'과 '개입된 맞춤형 DNA 화물'은 한 방향으로만 삽입된다.

PAM과 CRISPR-Cas12k의 표적 시퀀스는 전위 후에도 온전했지만, (이미 트랜스포손의 사본을 수령한) 동일한 하류영역에 효과적인 CAST를 통합하는 시도를 더 이상 뒷받침하지는 않았다. 이는 표적면역성(target immunity)이라는 현상과 유사한데, 그 내용인즉 "세균의 T7 트랜스포손이 동일한 부위로의 삽입을 회피한다"는 것이다(참고 11). 주목할 것은, 각각의 통합 부위 앞의 5 bp짜리 시퀀스가 복제되어, 삽입된 DNA의 다른쪽 말단의 측면에 배치된다는 것이다. 이는 T7 트랜스포손에 의해 뒤늦게 생성된 한가닥 DNA 갭과 일치하는데(참고 12), 아마도 갭을 메우는 숙주의 인자에 의해 밀봉된 것으로 보인다.

스트레커 등은 in vitro에서도 'CAST에 의해 촉매되는 DNA 삽입'을 재현했으며, "CAST가 세균의 유전체 조작을 위한 '표적화된 DNA 삽입도구'로 전용(轉用)될 수 있다"는 사실을 증명했다. shCAST는 E. coli 유전체의 48개 상이한 표적부위를 겨냥하여 재프로그래밍되었고, 29개 로커스에서 표적화된 삽입을 달성했다. 그중 몇 군데의 경우 효율이 인상적으로 높아(50~80%), 전위를 탐지하기 위한 양성선택(positive selection)의 필요성을 제거했다. 또한 삽입의 프로파일링은 비편향적인 심층적 시퀀싱을 통해, 전유전체 범위에서 수행되었다. 모든 삽입 중 약 절반은 과녁에 적중한 데 반해, 나머지 비표적 삽입은 염색체 전역에 산재(散在)했다. 빈발하는 비표적 부위 중 상당수는 독특한 gRNA를 이용한 E. coli 샘플에서 반복적으로 일어난 것으로 보아, CRISPR과 독립적인 메커니즘에 의해 초래되었을 가능성이 높다. 세포에서 생산되는 트랜스포사제의 양을 제한할 경우 비표적 효과를 줄이는 데 도움이 될 것으로 보인다.

▶ 한편 클롬페 등은 "비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)의 트랜스포손에서, 미니 I형 CRISPR-Cas가 화물 DNA를 두 가지 가능한 방향으로 삽입할 수 있다"고 보고한 바 있다. 그 통합은 CRISPR에 의해 유도되었고, 든든했으며, 낮은(10% 미만) 비표적 효과를 보였다.

스트레커와 클롬페 등이 보고한 「CRISPR-유도 DNA 프랜스포사제 시스템(CRISPR-guided DNA transposase system)」을 이용하여, 진핵생물에서 고효율의 표적화된 유전제 통합을 달성할 수 있을까? 바이러스 또는 트랜스포손에 기반한 현행 '인간세포에의 치료용 유전자전달'과 비교할 때(참고 13), 「CRISPR-유도 DNA 프랜스포사제 시스템」은 맞춤 유전자를 원하는 부위에 삽입함으로써, 무작위적 유전체 통합과 관련된 발암위험을 회피할 수 있을 것으로 보인다. Cas9나 Cas12에 기반한 편집도구와 달리, 「CRISPR-유도 DNA 프랜스포사제 시스템」은 숙주의 HDR 경로에 의한 DSB 수선이 필요하지 않으므로, 광범위한 세포유형과 조직을 대상으로 매우 효율적인 유전자 삽입을 가능케 할 수 있다. 그러나 한 가지 한계는, "트랜스포손의 말단이 '개입한 화물 DNA'와 통합됨으로써, '흉터 없는 삽입'을 필요로 하는 어플리케이션을 좌절시킨다"는 것이다.

또한 「CRISPR-유도 DNA 프랜스포사제 시스템」의 발견은, '방어기능을 넘어선 새로운 CRISPR 변이체'를 발굴하려는 생물정보학의 힘을 만방에 과시했다(참고 9, 10). CRIPSR와 관련된 액세서리 유전자들이 더 많이 발견됨에 따라, CRISPR 생물학의 비고전적 측면은 더욱 많이 드러날 것으로 기대된다(참고 14, 참고 15).

※ 참고문헌
1. R. Barrangou et al., Science 315, 1709 (2007).
2. K. S. Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 9, 467 (2011).
3. S. J. Brouns et al., Science 321, 960 (2008).
4. G. J. Knott, J. A. Doudna, Science 361, 866 (2018).
5. J. Strecker et al., Science 365, 48 (2019).
6. S. E. Klompe, P. L. H. Vo, T. S. Halpin-Healy, S. H. Sternberg, Nature (2019).
7. M. Heidenreich, F. Zhang, Nat. Rev. Neurosci. 17, 36 (2016).
8. A. C. Komor, A. H. Badran, D. R. Liu, Cell 168, 20 (2017).
9. J. E. Peters, K. S. Makarova, S. Shmakov, E. V. Koonin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, E7358 (2017).
10. G. Faure et al., Nat. Rev. Microbiol. (2019). 10.1038/s41579-019-0204-7
11. A. E. Stellwagen, N. L. Craig, EMBO J. 16, 6823 (1997).
12. R. Bainton, P. Gamas, N. L. Craig, Cell 65, 805 (1991).
13. P. Kebriaei, Z. Izsvák, S. A. Narayanavari, H. Singh, Z. Ivics, Trends Genet. 33, 852 (2017).
14. S. A. Shmakov, K. S. Makarova, Y. I. Wolf, K. V. Severinov, E. V. Koonin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115, E5307 (2018).
15. G. Faure, K. S. Makarova, E. V. Koonin, J. Mol. Biol. 431, 3 (2019).

※ 출처 Science http://science.sciencemag.org/content/365/6448/25

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양병찬 (약사, 번역가)
서울대학교 경영학과와 동대학원을 졸업하고, 은행, 증권사, 대기업 기획조정실 등에서 일하다가, 진로를 바꿔 중앙대학교 약학대학을 졸업하고 약사면허를 취득한 이색경력의 소유자다. 현재 서울 구로구에서 거주하며 낮에는 약사로, 밤에는 전문 번역가와 과학 리포터로...
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