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신형 유전자가위 Cpf1으로 생쥐 유전자 교정 성공...동물 개체 적용 첫 사례… 질병 동물모델 활용 기대
생명과학 기초과학연구원 (2016-06-07)

기초과학연구원(IBS) 유전체 교정 연구단 김진수 단장(서울대 화학부 교수) 연구팀이 주도하고 ㈜툴젠(대표 김종문)이 참여한 공동 연구팀은 신형 크리스퍼 Cpf1 유전자가위를 사용해 생쥐 배아의 유전자 교정에 성공했다. Cpf1 단백질이 발표된 이후 동물 개체 수준에서 유전자 교정에 시도해 성공한 첫 번째 사례다.

지난해 유전공학 혁명을 일으킨 ‘크리스퍼 유전자가위(CRISPR Cas9)’를 대체할 ‘크리스퍼 Cpf1 유전자가위(CRISPR Cpf1)’가 학계에 보고되자 전 세계 연구진들이 들썩였다. 유전체교정에 널리 활용할 수 있는 새로운 도구가 발견된  것이다.

 크리스퍼 Cpf1 유전자가위는 DNA를 자르는 Cpf1 단백질과 염기서열을 찾아가는 크리스퍼RNA(crRNA)를 혼합해 만든다. Cpf1 단백질 구조는 Cas9 단백질과 달라 결합하는 RNA의 길이가 짧다. 길이가 짧으니 제작에도 수월하다는 장점이 있다. 연구진은 Cpf1 단백질의 특이점에 집중해 연구를 시작했다.

 연구진은 생쥐의 면역체계에 관여하는 전사인자 Foxn1과 백색증(Albino)에 관여하는 Tyrosinase 유전자에 교정을 시도했다. Foxn1 인자가 사라지면 면역체계에 문제가 생길 뿐만 아니라 털이 자라지 않게 된다. 백색증에 관여하는 유전자가 사라지면 멜라닌 생성에 문제가 생겨 까만 털을 가진 쥐도 하얀 털을 갖게 된다. 연구진은 생쥐의 배아에서 유전자 교정을 시도했고, 그 결과 특정 유전자의 변이가 도입된 돌연변이 생쥐 제작에 성공했다.

 연구진은 기존에 적용하던 미세 주사(Microinjection) 방법이 아닌 전기 충격 방법을 이용했다. 전기충격을 통해 유전자가위를 대량의 배아에 한 번에 주입해 높은 효율을 유지하는 방법을 개발한 것이다. 이 방법을 이용하면 짧은 시간에 다수의 동물 배아에 유전자가위를 효과적으로 적용할 수 있다. 배아 수준에서 동물의 유전자를 교정할 수 있는 정교한 방법을 개발한 것이다. 또한 실제 유전체 교정이 맞게 일어났는지 유전체 시퀀싱을 이용해 확인한 결과 표적위치에만 유전자 변이가 있고 비표적 위치에는 변이가 없음을 확인했다.

 이번 연구가 질병 동물 모델을 만드는데 적용될 경우 생명과학 연구 분야 에서 크게 활용될 것으로 기대된다. 실험 동물 모델인 유전자 결손 생쥐(Knock-out mice)를 만들 때, 크리스퍼 Cpf1 유전자가위를 도입하면 크리스퍼 Cas9으로 일으킬 수 있는 유전자 교정과 다른 종류의 교정을 만들 수 있다. 여기에 전기충격 방식을 이용하면 훨씬 짧은 시간에 많은 수의 배아에 유전자가위를 전달할 수 있다.

 이번 연구를 이끈 김진수 단장은 “새로운 크리스퍼 Cpf1 유전자가위를 활용하면 생쥐는 물론 소, 돼지 등 동물에 보편적으로 활용할 수 있다. 특히, 전기 충격 방법은 크리스퍼 Cpf1을 동물 배아에 효율적으로 주입하게 해 가축 유전자 교정에 널리 활용될 수 있다 ” 고 이번 연구 성과의 의미를 강조했다.

 본 연구결과는 ‘네이처 바이오테크놀로지(Nature Biotechnology, IF 41.514)’ 온라인판에 6월 7일 새벽12시(한국시간)에 게재됐다.

연 구 결 과 개 요

Targeted mutagenesis in mice via eletroporation of Cpf1 ribonucleoproteins
Junho K Hur*, Kyoungmi Kim*, Kyung Wook Been, Gayoung Baek, Sunghyeok Ye, Junseok W Hur, Seuk-Min Ryu, Youn Su Lee, Jin-Soo Kim
(Nature Biotechnology, in press)

 크리스퍼 Cpf1 유전자가위는 현재 널리 이용되는 크리스퍼 Cas9 유전자가위와 다른 종류다. Cpf1은 타이미닌(thymidine)이 많은 염기서열에 적용한다. 반면 Cas9은 구아노신(Guanisine)이 많은 염기서열을 인식한다. Cas9 단백질에 비해 짧은 길이의 RNA와 결합하는 Cpf1 단백질은 타이미닌이 풍부한 염기서열을 찾아 들어가기 때문에 크리스퍼 Cas9이 표적할 수 없었던 염기 서열의 유전체 교정이 가능하다. 새롭게 등장한 크리스퍼 Cpf1 유전자가위에 대한 학계의 관심은 높지만 아직까지 Cpf1 단백질을 사용하여 동물 개체 수준에서 유전체 교정은 시도되지 않았다.
본 연구에서는 Cpf1 단백질과 크리스퍼RNA(crRNA)로 구성된 혼합체를 사용하여 형질전환 생쥐를 만들었다. 동물 개체 수준에서 Cpf1 단백질을 사용해 유전자 교정에 성공한 첫 사례다. 연구진은 대장균을 사용해 발현하고 정제해 재조합한 Cpf1 단백질과 표적위치를 읽는 크리스퍼RNA을 결합해서 생쥐 배아에 도입했다. 수정된 후 세포분열이 일어나지 않은 세포기에 미세주사로 주입하는 방법과 전기적으로 충격을 준 방식의 방법 두 가지를 비교한 결과, 연구진은 전기적 방법을 활용하면 짧은 시간 내에 효율적으로 크리스퍼 Cpf1 유전자가위를 전달할 수 있음을 밝혔다.
연구진은 유전자가위를 적용해 만든 돌연변이 생쥐의 유전체 시퀀싱을 통해 크리스퍼 Cpf1의 정확성을 확인했다. 표적 염기서열 위치에만 변이가 일어났음을 확인한 것이다.
본 연구는 크리스퍼 Cpf1 유전자가위를 이용해 동물의 형질전환을 할 수 있음을 보고한 첫 사례다. 이를 활용해 생쥐, 소, 돼지 등 일반적인 동물과 가축 유전자 교정에도 널리 활용될 수 있을 것으로 보인다. 또한 결손 유전자 실험 동물모델을 효율적으로 제작할 수 있다면 앞으로 난치성 유전 질환 연구 및 치료에도 활용할 수 있을 것으로 크게 기대된다.

연 구 이 야 기

□ 연구를 시작한 계기나 배경은?

 지난 해 새로운 유전자가위인 크리스퍼 Cpf1 유전자가위가 보고되면서 많은 호기심이 생겼다. 크리스퍼 Cpf1 유전자가위를 형질전환 동물 제작에 적용하면 난치성 유전질환의 연구 및 치료제 개발에 크게 활용할 수 있을 것으로 판단했다. 이를 통해 생명과학연구 분야에 기여할 수 있을 것으로 예상되어 연구에 착수하게 되었다.

□ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지?

  재조합한 Cpf1 단백질을 사용한 첫 연구였기 때문에 단백질을 정제해 유전체 교정에 활용할 수 있도록 최적화시키는 것이 어려웠다. 또한 생쥐 배아에 유전자가위를 전달하고 생쥐가 태어날 때까지 기다리면 1번 실험에 한 달 가량이 소요되어 전체적으로 실험 기간이 길어질 수밖에 없다. 본 연구에서는 이를 단축하기 위해 배아수준에서 바로 유전체 교정이 정확하게 이뤄졌는지 확인하는 시퀀싱 작업을 거쳤다. 이런 일련의 과정을 통해 전반적인 실험 효율을 높일 수 있었다.

□ 이번 성과, 무엇이 다른가?

 형질전환 동물을 제작하기 위해서는 먼저 재조합 Cpf1 단백질을 대량으로 제작하는 과정이 필요하다. 이를 위해 대장균에서 Cpf1 단백질을 발현하고 정제하여 크리스퍼RNA와 혼합체를 제작하고 생쥐 배아에 전달하였다. 이렇게 만들어진 형질전환 생쥐들에서 특이적인 유전체 교정이 되었음을 확인할 수 있었다.

□ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은?

 이 연구를 통해 난치성 유전 질환 동물 모델을 만들어 질환의 기작 연구 및 치료제를 개발하는데 기여하고자 한다.

□ 기타 특별한 에피소드가 있었다면?

 크리스퍼 Cpf1 유전자가위는 최근 발견되어 알려진 것이 많지 않은 단계다. 연구단 내 다양한 연구자들이 많은 관심을 가지고 협력해 연구성과를 낼 수 있었다.
 초반에는 Cpf1에 결합하는 RNA가 Cas9에 결합하는 RNA 길이보다 짧기 때문에 교정해야 하는 염기서열을 잘 찾지 못할 것이라고 예상했다. 하지만 실험을 진행해보니 오히려 Cas9에 결합하는 RNA보다 특이적으로 작용해 새로웠다. 또한 현재 가장 효과적인 유전자가위로 알려진 spCas9과 비슷한 효율을 보이면서 장점이 많아 크리스퍼 Cpf1 유전자가위의 연구가 앞으로 지속적으로 더 진행될 것으로 예상된다.

연구진이 개발한 전기충격을 활용한 유전자 교정
[그림 1] 연구진이 개발한 전기충격을 활용한 유전자 교정

 Cpf1단백질과 크리스퍼RNA(crRNA)의 혼합체를 전기적 방법을 이용해 배아에 전달했다. 이 방식을 이용하면 짧은 시간 내에 많은 수의 배아에 크리스퍼 Cpf1 유전자가위를 적용할 수 있다. 연구진은 전기적 방법을 이용해 효과적으로 형질전환 생쥐를 제작하는 방법을 개발했다.

크리스퍼 Cpf1 유전자가위를 활용한 생쥐의 유전자 형질전환 실험
[그림 2] 크리스퍼 Cpf1 유전자가위를 활용한 생쥐의 유전자 형질전환 실험

 연구진은 크리스퍼 Cpf1 유전자가위를 활용해 일반 생쥐에서 형질 전환 생쥐를 제작하였다. 털에 관여하는 전사인자 Foxn1과 멜라닌에 관여하는 유전자 Tyrosinase를 교정하고자 했다. 유전자 교정이 성공하였고, 다음 세대에서는 결과적으로 완전히 털이 없는 생쥐와 흰 털이 나는 생쥐가 나타날 것으로 연구진은 예상하고 있다.

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