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유전자치료제 AAV 특성분석(Characterization) 및 안정성 분석법
자연과학
Adeno-Associated Virus (AAV) Vector 란?
유전자 치료(Gene Therapy) 는 유전자 재조합 기술을 이용하여 치료 유전자를 환자의 세포 안으로 전달하여 질환을 치료하거나, 예방하는 것을 말합니다.
유전자 치료제 개발에 사용되는 AAV 벡터의 특성 분석(Characterization)은 Whole viral particle, Viral DNA, Capsid protein 등의 특성을 통합적으로 분석해야 합니다.
Transduction assay, ELISA, qPCR, 전자 현미경 등의 다양한 분석 방법을 사용하여 분석할 수는 있으나, 시간이 오래 걸리고, 비용과 노동력도 많이 소비할 수밖에 없습니다.
Uncle 은 한 장비로 Capsid protein 과 DNA 의 열적 안정성(Thermal stability)을 분석할 수 있습니다.
AAV 안정성 분석 방법
열에 의해 AAV 가 분해되는 2가지 기작은 Genome ejection 과 Capsid disruption 으로
구분될 수 있습니다.
1) Genome ejection: 정상적인 Capsid 밖으로 DNA가 방출되는 경우
2) Capsid disruption: Capsid protein 이 unfolding 되거나 분해되는 경우
Uncle 에서의 AAV 안정성 실험 결과
1) Free DNA나 RNA 에 결합하면 Fluorescence 을 나타내는 SYBR Gold Assay 를 통해
Viral DNA 안정성 분석이 가능합니다. 1E13 vg/mL AAV9 로 SYBR Gold Assay 결과,
아래와 같이 50.3도 에서 Viral DNA 가 방출되기 시작하는 것을 확인할 수 있습니다.
2) 단백질 내부에 흡광도를 갖는 아미노산(예: 트립토판)의 Intrinsic fluorescence 측정하여
Tm, Tonset 을 측정할 수 있습니다. 5E11vg/mL AAV9 로 Tm 분석 결과, 75-80도 사이에
Capsid 단백질의 구조가 unfolding 되었습니다.
Uncle 을 사용해야 하는 이유
1. 3 가지 검출 방식: 형광, 동적 광 산란(DLS) 및 정적 광 산란(SLS) 검출 + 온도 조절 가능
- 3가지 Detection 방식을 통해 단백질 의약품 안정성과 관련된 12개 결과 획득 가능
2. 다양한 Application 적용 가능: 단백질 의약품의 안정성과 관련된 12개 결과 획득
3. High-Throughput: 소량의 시료로(9 uL) 로 한번에 48개 분석 가능
- Tm, Tagg, DLS 한번에 분석 가능하며, 48개 분석시 실험 조건에 따라 2~5 시간 소요됨
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