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암줄기세포 모델의 진화
암줄기세포 모델의 진화 저자 정의경 (부산대학교)
등록일 2016.08.01
자료번호 BRIC VIEW 2016-R15
조회 7894  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
유전자 분석을 통해 암에 대한 이해가 형성되어 왔다. 그러나, 암세포는 정상조직 구조의 특징을 나타내고 그 안에서 암줄기세포(cancer stem cells, CSC)가 암성장을 촉진할 수 있음이 밝혀지고 있다. 종양 비균질성(tumor heterogeneity)은 주로 상호 배타적인 모델로 설명되었지만, 본 리뷰에서는 유전적 다양성과 비유전적 영향을 함께 고려하여 암의 유전적 모델과 CSC 모델이 조화될 수 있음을 제시한다. 이렇듯 CSC와 암 유전적 자료를 통합하는 접근은 과거의 연구결과를 설명하고 앞으로의 연구 설계에 도움을 줄 것이다.
키워드: cancer stem cells, tumor heterogeneity, CSC and clonal evolution model
분야: Cell_Biology

본 자료는 Evolution of the Cancer Stem Cell Model. Cell Stem Cell, 2014; 14(3): Pages 275-291 의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목차

Ⅰ. 서론
Ⅱ. 본론
  1. 줄기세포능(stemness)의 정의
  2. CSC와 TIC
  3. 역사적 관점에서의 종양 비균질성
  4. 유전적 기작에 의한 종양 비균질성
  5. 종양 내 유전적 다양성
  6. 비유전적 기작에 의한 비균질성 - CSC 모델
  7. 이종이식과 CSC 확인
  8. Clone의 역동성, 휴면상태 및 치료실패
  9. 유연성(plasticity)과 CSC 확인
  10. 후생유전학과 stemness
  11. Noisy 유전자 발현과 비균질성
  12. 유전적 및 비유전적 모델의 한계
  13. CSC와 clone 진화 모델의 통합
  14. 고형종양 연구에 대한 해결 과제
  15. Stemness, 예후, 치료의 연관성
Ⅲ. 나아갈 길


Ⅰ. 서론

암 치료의 발전에도 불구하고, 많은 환자들은 여전히 치료가 실패하여 암이 진행되고 재발하며, 전체 생존율이 감소하고 있다. 역사적으로 많은 연구들은 약제내성을 유발하는 유전적, 생화학적 기작에 집중해왔다. 그러나, 암은 비균질한 질환으로, 종양 내 비균질성(intratumoral heterogeneity)이 치료실패와 질환 진행에 기여한다는 인식이 점차 높아지고 있다. 하나의 종양은 단순히 균질한 악성세포를 담고 있는 “자루(bag)”라기보다는 복잡한 생태계이다. 종양은 암세포뿐만 아니라 침윤한 내피세포, 조혈세포, 기질 및 그 전체로서 종양 기능에 영향을 미치는 다른 종류의 세포들을 포함하고 있다. 이러한 세포들은 암세포에 직접적으로 영향을 주거나 저산소환경 및 영양분 변동과 같은 대사변화를 일으켜 악성 세포 기능의 비균질성에 기여한다. 이렇듯 복잡한 생태계로 작용하여, 전체적인 종양의 적합성을 높여서 치료 실패의 원인이 된다. 이러한 비세포자율 효과(non-cell-autonomous effect)를 제외하고, 한 종양 내에서 각각의 악성세포도 성장, 세포사멸, 대사 및 다른 “암의 특징(hallmarks of cancer)”들이 변할 수 있다. 그러나, 종양 내 세포 기능 변화를 유도하는 기전은 아직까지 불확실하다.

암 연구의 세가지 방안이 종양 비균질성의 조절 기전에 대한 이해를 높이고 치료 내성, 암 진전 및 재발과의 연관성을 밝혀 왔다. 먼저, 유전체 서열분석(genome sequencing) 연구를 통해, 한 환자의 암이 분기진화론(branching evolution)적으로 발생한 유전적으로 뚜렷이 구분되는 subclone들로 이루어진 비균질한 혼합물임을 밝혔다. 각 subclone 내에서 독특한 발암 변이(driver mutation)가 발생하여 암 특징에 서로 다르게 영향을 줌으로써 기능적인 비균질성에 기여한다. 또한, 발생학적 경로와 후생유전적 변화(epigenetic modifications; DNA 메틸화, histone 변형, 염색질 개방성(chromatin openness), microRNA [miRNA], 다른 비암호화 RNA)를 포함하는 비유전적 결정요인이 기능적 비균질성에 기여함이 중요하게 알려지고 있다. 이 결정요인들은 보통 정상조직 줄기세포의 계층을 유지한다. 마찬가지로, 이러한 결정요인들은 계층적으로 조직화된 암조직을 만든다. 그 안에서 암줄기세포(cancer stem cells, CSCs)가 신생물(neoplasm)의 장기간 clone 유지(long-term clonal maintenance)를 지속시킨다. CSC의 성질은 임상결과와 연관되므로 이러한 발생학적 모델과 계층모델에 대한 연구가 주목받고 있다. 실험모델과 임상연구 결과는 CSC가 일반적인 암 치료에서 살아남음을 보여준다. 게다가, CSC 특유의 성질과 전사 특징으로 전체 생존율을 상당히 예측 할 수 있다는 점은 임상 연관성을 나타낸다. 본 리뷰에서는 다루지 않지만 또 다른 유망한 방안은 종양미세환경(tumor microenvironment, TME)이라 불리는, 비종양세포 요소이다. TME는 암세포의 기능에 상당한 변화를 준다. TME에 의한 복잡성(complexity)은 종양세포와 TME 간의 상호작용에 의해 증폭된다. 유전적으로 동일한 세포는 주변 환경에 의존적으로 약제에 민감하거나 내성을 가지기 때문에 TME는 적응 약제 내성(adaptive drug resistance)에 중요한 역할을 한다. 또한 최근에 TME가 암세포에서 줄기세포 프로그램을 시작하게 할 가능성을 발견하였다. 요약하면, 세가지 기작은 모두 치료 실패 및 재발과 강하게 연관되어 있고 암 적합성의 중요한 결정요인이 된다(그림 1).

본 리뷰는 종양 비균질성을 야기하는 유전적, 발생학적 기작에 초점을 맞추고 사람에서의 연구를 강조할 것이다. 비록 종양 비균질성을 주로 상호 배타적인 모델로 나타내지만 본 리뷰는 암의 유전적, 발생학적/계층적 모델이 조화될 수 있음을 제안한다. 실제로, 백혈병과 고형종양에서의 최근 연구결과는 CSC와 정상 줄기세포의 독특한 유전자 발현 특징으로 여러 가지 발암 변이를 가진 광범위한 환자에서 임상결과(outcome)를 상당히 예측 할 수 있음을 보여주었다. 이는 줄기세포능(stemness)이 여러 가지 발암 변이를 하나가 되게 하는 중추적인 생물학적 성질 또는 과정임을 낸다. 따라서, 본 리뷰의 중심 가설은 3개의 양상-유전적 다양성, 후생학, TME-이 종양 비균질성에 기여하고 각각은 stemness에 영향을 미쳐서 임상적 연관성을 가진다는 것이다(그림 1).

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그림 1. Stemness에 의한 치료 반응 조절

Ⅱ. 본론

1. 줄기세포능(stemness)의 정의

현재의 줄기세포 연구는 1961년에 Till과 McCulloch의 선구적인 연구에서 시작되었다. Till과 McCulloch는 생체 내 clone 재증식 분석법(clonal in vivo repopulation assay)을 개발하여 하나의 조혈세포가 다분화능력(multilineage differentiation potential)을 가지면서 자기복제 성질도 유지하고 있음을 밝혔다. 비록 다분화능력이 주로 줄기세포의 성질로 여겨져 왔지만, 조혈계의 특정 세포의 경우, 재증식하고 다분화능력은 가지지만 자기복제능력(self-renewal)이 없음을 확인하였다. 따라서, 정상이든 악성인 경우이든, 줄기세포의 주된 성질은 자기복제이다. 자기복제는 하나의 줄기세포가 비대칭 분열을 통해 하나의, 혹은 대칭 분열을 통해 2개의 자기복제가 가능한 딸세포를 만드는 주요 세포분열 과정이다. 이를 통해 줄기세포군이 유지되거나 확장되어 장기간 clone 성장이 가능하다. 실험적으로는, 줄기세포의 황금 표준 측정은 연쇄 수혜자로의 이식이나 생체 내 추적(in situ tracking)과 관련된 기능적 재증식 분석을 통해 장기간 clone 성장 유지를 확인한다. 실제로 이러한 원칙을 고수하지 않아서 CSC 분야에서 혼란을 야기하였다. 많은 연구에서 3차원 종양 모델(tumorsphere)의 연쇄 계대배양과 덩어리 종양세포의 연쇄 계대배양과 같은 체외 분석을 수행하였다. 그러나, 생체내 clone의 연쇄 재증식 분석법만이 정식으로 줄기세포의 자기복제를 분석할 수 있다. 줄기세포 상태를 조절하는 분자적인 프로그램으로는 후생유전적 상태와 세포에 자기복제능력을 부여하는 전사인자 및 후생 유전적 변형인자(e.g., Polycomb 복합체와 miRNA)가 보고되고 있다. “stemness”라는 용어는 “줄기세포 상태를 조절하고 유지하는 분자적인 프로그램의 통합된 기능”을 총체적으로 가리키기 위해 많은 논문에서 사용되고 있고 본 리뷰에서도 같은 개념으로 이 용어를 사용할 것이다.

2. CSC와 TIC

정의한 대로, CSC와 정상 조직 줄기세포는 자기복제능력을 가진다; 그러나, CSC는 보통 자기복제가 조절되지 않는다. 많은 암에서, CSC는 다른 암세포와 구분하여 전향적 분리(prospective isolation)가 가능한 독특한 군집이고 장기간 clone 재증식과 자기복제가 가능하다. 그러나, 일부 암에서는 대부분의 세포가 CSC 기능을 가져서 non-CSC로부터 CSC를 구분하는 것이 불가능하다. 이런 종양은 균질하거나 매우 얕은 계층(shallow hierarchy)구조를 가진다. 뿐만 아니라, 최근 몇몇 연구는 특정 암세포가 줄기세포와 비줄기세포 상태를 가역적으로 전환하는 유연성(plasticity)을 가짐을 보고하고 있다. stemness 상태는 암세포가 치료에 대해 생존하게 하는 다양한 기능에 기여하므로 stemness의 결정요인(determinant)이 치료 실패에 영향을 주는 핵심 기여자일 것이다. 명확한 CSC가 아닌 stemness 결정요인이 일시적인 상태의 세포도 종양 개시(tumor-initiation) 능력을 가지지만, 전향적 분리는 어렵다. 따라서, CSC는 전향적 분리가 가능한 경우로 제한하여, 일시적인 세포를 정식으로 CSC라고 명명해서는 안될 것이다. 이러한 세포는 기능적 종양-개시 세포(tumor-initiating cell, T-IC) 또는 백혈병-개시 세포(leukemia-initiating cell, L-IC) 분석을 통해 지칭되어야 한다. T-IC 또는 L-IC로 정의되려면: (1) 모종양(parent tumor)을 대표하는 이종이식(xenograft)을 형성할 수 있고, (2) 이종이식 분석에서 연속 계대에 의해 입증되는 자기복제를 할 수 있으며, (3) 증식은 하지만 연속 계대 상에서 clone 형성 및 유지는 할 수 없는 딸세포를 생성할 수 있어야 한다. T-IC/L-IC 용어는 진정한(bona-fide) CSC가 존재하지만 전향적 분리에 필요한 세포 표지자가 보고되지 않은 경우에도 적용할 수 있다. 본 리뷰에서는 T-IC/L-IC 용어를 장기간 종양개시 능력은 있지만 전향적 분리는 할 수 없는 모든 세포를 지칭하는데 사용할 것이다.

3. 역사적 관점에서의 종양 비균질성

종양의 세포 모양에서의 비균질성은 1800년대부터 많은 실험 병리학자들에 의해 잘 알려져 있었다. 기술이 발달하면서 세포 표지자의 차이, 유전적 이상, 성장 속도, 치료 반응을 포함하는 다른 특징들도 종양간에 비균질함이 밝혀졌다. 초기의 연구는 하나의 암에 여러 세포 아군집(subpopulation)이 존재함을 입증하였다. 마찬가지로, 전이성 흑색종 세포주로부터 각각의 단일 세포를 복제하여 동계 쥐에 주입한 결과, 각각의 전이 정도가 광범위하게 다름을 확인하였다. 이는 모종양 세포가 다양하고 일부 clone만이 전이 될 수 있음을 나타낸다. 종양세포의 다양성은 신경교종 연구에서 중요하게 확인하였다. 신경교종에서 분리한 1차 세포의 분열한 세포를 핵형분석 하고, 규명한 핵형 비균질성은 단일세포 배양법(limiting dilution plating)으로 배양한 clone 아군집의 표지자로 이용하였다. 이를 통해 확인한 결과, 아군집들은 서로 화학요법에 대한 민감도와 유전적 안정성에서 차이를 보였다. 또한 종양세포의 기능적인 비균질성은 급성 골수성 및 림프구성 백혈병 환자에서 체내 3H-TdR 방사선을 표지하여, 백혈병 세포의 증식 속도가 뚜렷하게 다름을 통해 확인하였다. 따라서, 이 시기에는 기능적 특징에 차이가 있음을 많은 연구들이 보고하였고 종양 내 각 세포의 성장이 균질하지 않음을 규명하였다.

이러한 암 연구 초기에는 동계 쥐에 종양이식 한 실험의 양적인 증거가 특히 중요하였다. 모든 세포가 T-IC로 기능할 수 있는 것은 아니기 때문에 새로운 종양의 개시 및 유지가 다양하게 나타났다. 또한 T-IC가 희박함을 확인하였다. 요약하면, 종양은 동일하게 증식하는 균질한 세포로 이루어진 것이 아니라, 다양한 특징과 기능을 가진 세포들이 함께 전체로서 종양의 성장과 유지를 지지하는 복잡한 네트워크이다.

다윈의 진화론에서, 한 종(species)의 유전자풀(gene pool) 내 유전적 다양성은 그 종의 생존과 변화하는 환경에 대한 적응성을 강화한다. 마찬가지로, 생물의 다양성이 생태계의 안정성과 견고함에 중요하다. 발생학적 관점에서는, 서로 다르게 분화한 세포들이 장기의 효율적인 기능을 위해 필요하다. 예를 들어, 혈액계의 적절한 기능을 위해, 조혈모세포(hematopoietic stem cells, HSCs)는 구조와 기능이 서로 다른 세포로 분화되어야 한다. 심지어 HSC pool 내에도 비균질성이 있다. 이러한 다양성이 없다면, 혈액계의 기능을 위태롭게 할 것이다. 생태계에서 종의 진화와 생물의 다양성은 유전적 수준에서의 변화의 결과인 반면, 한 개체 내에서 세포 기능과 조직 발달의 다양성은 비유전적, 발생학적 프로그램의 결과이다.

4. 유전적 기작에 의한 종양 비균질성

암 연구에서 중요한 원칙은 종양의 개시와 진행이 clone 확장에 기여하는 잇따른 유전적 변이에서 기인한다는 것이다. 대장암의 진행 단계별 유전적 변이를 분석한 연구가 이를 뒷받침한다. 이 연구는 유전적 변화가 표현형의 발현을 유발함을 규명하여 암 진행이 다윈의 진화론을 따른다는 견해에 무게를 실었다. 이 견해의 기본 전제는 유리한 유전성 돌연변이를 부여 받은 세포가 이 돌연변이가 없는 다른 세포보다 생존에 유리한 자손을 만든다는 것이다. 그 결과, 보다 높은 적합성을 가진 자손 세포가 번성하고 clone 군집을 형성하여 가장 크게 자리를 차지한다. 시간이 흐르면서, clone 내에서 다른 세포보다 성장에 유리한 추가 변이가 발생할 수도 있다. 독특한 subclone이 발생하면서, 서로 다른 결과가 가능하다: 보다 덜 적합한 subclone은 완전히 없어지고 가장 적합한 subclone이 우위를 차지하거나, 많은 이류의 subclone이 우세한 clone과 함께 살아남아 계속 진화할 수 있는 저장소(reservoir)를 형성할 수도 있다. 하나의 종양 내에서 subclone이 유지되고 독립적인 가지를 형성하는 모델은 분기진화론을 연상시킨다. 다윈은 분기진화론이 한 종의 적합성을 증가시키고 전체적인 견고함으로 이어진다고 기술하였다(그림 2).
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그림 2. Clone 진화와 CSC의 통합 모델

지난 6년간 많은 종양의 전체 exome 염기서열분석(whole exome sequencing, WES)과 전체 유전체 염기서열분석(whole genome sequencing, WGS) 결과가 쏟아져 나와 단일 종양과 여러 종양에서 나타나는 돌연변이의 복합적인 분석을 가능하게 하였다. 이를 통해 유전자 변이부담(mutational burden)이 종양 종류에 따라 매우 다양함을 확인하였다. 예를 들어, 같은 종류의 종양 내에서도 발암 변이에 상당한 차이가 있고 동일한 발암 변이가 서로 다른 종류의 종양에서 발생하여 동일한 기작이 활성화 되기도 한다. 특정 체세포 다형성(somatic polymor-phism)이 발암 변이인지 암과 무관한 일과성 변이(passenger mutation)인지는 종양간, 종양 내 비균질성으로 인해 기능적인 분석 없이는 규명하기 어렵다. 일과성변이의 기원은 최근 급성 골수성 백혈병(AML)에서 확인하였다. AML 골수 아세포(blasts)의 수백 개 돌연변이 중에서, 많은 변이가 AML subclone의 기원 세포인 조상 HSC(founder HSC)에 존재한다; 이러한 변이는 정상 HSC가 분열할 때 언제든지 발생하여 기능이 없는 상태로 남아 일과성변이로 여겨진다. HSC 내에서 발암 변이를 획득하면 AML subclone 내 기존 돌연변이를 잡아서(“trapped”) 이 개시 세포로부터 subclone 이 확장되고 진행되도록 한다. 백혈병이 진행되는 동안 변이가 지속적으로 발생하지만 극히 소수의 부가적인 변이만이 군집의 확장에 필요하다. 따라서, AML subclone이 획득하는 발암 및 협력 변이(cooperating mutation)는 많은 일과성 변이로부터 구분할 필요가 있다. 이러한 접근은 환자 개개인의 전체 돌연변이(mutational landscape)가 어떻게 환자 간의 비균질성에 영향을 주는지 입증하였다. 그러나, 어떻게 유전적 기작이 종양 내 비균질성에 기여하는지에 대해서는 보다 정교한 접근이 필요하다.

5. 종양 내 유전적 다양성

암발생의 다단계과정 모델(multistep tumorigenesis model)은 종양이 언제 채취되느냐에 따라 변화하는 clone 우성의 순차적인 발달이 있음을 제안하였다. 그렇지만 또한, 종양이 독립적으로 진화하는 여러 subclone을 포함한다고 생각하였다(그림 2). 실제로, 심층 염기서열분석(deeper sequencing)과 생물정보학적 방법을 이용하여 종양이 주로 유전적으로 우세한 하나의 clone과 하나 혹은 보다 많은 유전적으로 별개인 subclone으로 이루어져 있음을 확인하였다. 예를 들어, 한 종양 내에서 서로 다른 부분은 그 유전적 subclone 의 속성을 보여주는 별개의 돌연변이를 가진다. 전이성 신장암의 경우, 체세포 변이의 70%가 동일 종양 내의 모든 부분에 있는 것은 아니다; VHL 돌연변이와 3번 염색체 단완(3p)상의 소실만이 흔하게 관찰된다. 심지어 예후가 좋거나 나쁜 유전자 발현 특징이 동일한 종양의 서로 다른 부분에서 발견되기도 한다. 전이 진행에서의 종양 내 다양성은 췌장암에서 관찰하였다. 췌장암 말기 환자로부터 전이암과 그에 상응하는 원발 종양의 서로 다른 부분을 채취하여 유전체 서열분석을 하였다. 이를 통해, 원발 종양에 폐, 간 또는 복막으로 전이가 되게 하는 위치상으로도 유전적으로도 별개인 subclone들이 있음을 확인하였다. 중요한 점은, 모클론(parental clone) 내에 조상 돌연변이가 있음에도 불구하고, 전이 개시 세포는 상당수의 추가 변이를 가진다는 점이다. 이는 전이가 일어나는 동안에도 clone 진화가 일어났음을 보여준다. 따라서, 원발 종양의 유전적 구조를 규명하더라도, 어느 subclone이 전이될지를 예측하는 것은 단순하지 않을 것이다.

종양 내에서 유전적 subclone을 찾는 기술을 이용하여, 이제 subclone의 진화를 나타내는 계통지도(lineage maps)를 작성하는 것이 가능하다. 서열분석을 통해, 유방암의 생활사를 재구성하여 유방암은 clone 확장을 유발하는 발암 변이의 획득을 통해서 진화함을 확인하였다. 흥미롭게도 그 발암변이는 확장하지 않고 소극적으로 돌연변이를 축적하는 오래된 계통에서 드물게 발생하였다. 가장 최근의 공통 조상은 의외로 초기의 것이었다. 이는 subclone의 다양성과 이러한 초기 암세포간의 진화를 유도하는데 많은 시간이 걸림을 나타낸다. 이러한 연구는 진단 이전에 발생했던 단계를 설명하여 초기검진에 유망한 방안을 제공한다. 그러나 환자간의 종양 유전적 다양성이 광범위하므로 서로 다른 유방암 subtype의 특징을 공통된 단계로 설명하는 것에는 주의가 필요할 것이다. 이러한 subclone 다양성의 발견은 어느 clone이 치료에서 살아남아 재발이나 전이로 진행될 것인가에 대한 의문을 제기하였다.

백혈병에서의 연구를 통해 subclone의 존재와 종양 진행에서의 기능을 규명하였다. ETV6-RUNX1 양성 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL) 쌍둥이 환자에서, 전백혈병 clone(preleukemic clone)이 자궁 내 태아에서부터 시작되고 확장되어 두 쌍둥이에 정착하지만, 이후 각각에서 서로 다른 속도와 DNA 복제수변이(copy-number alteration, CNA)를 획득하며 진화했음을 확인하였다. ALL의 진단 sample과 재발 sample에서 전체 유전체 CNA를 분석(profiling)한 연구는 유용한 정보를 주었다. 대략 40%의 경우, 재발 subclone은 진단 subclone과 동일하거나 직접 진화된 것이지만 50%의 경우, 재발 subclone이 진단 subclone과 제한된 유전적 유사성을 가지고 그로부터 진화한 것이 아니었다. 이러한 결과는 유전적으로 별개인 진단 subclone과 진단 이전의 조상 subclone이 존재함을 보여준다. 따라서, 종양은 보다 복잡한 분기진화를 통해 발생하여 유전적으로 별개인 진단 subclone이 생기게 함으로써 각각의 공격성 및 치료에 대한 반응이 서로 다를 것이다. 게다가, 이러한 결과는 subclone의 치료에 대한 반응의 다양성과 subclone이 생존하여 새로운 종양을 재생산할 확률에 대한 다양성을 규명하였다.

그렇지만, 이것은 종양 내 다양성에 대한 가상 그림일 뿐이고 종양 조직 덩어리로부터 추론한 것이다. 이러한 한계는 언제, 어떻게 종양 군집이 확장하여 subclone을 생성하는지 결정하는 것을 어렵게 하고 서열분석이 전체 군집의 하부구조(substructure)를 밝힐 정도로 충분한지에 대한 의문을 가지게 하였다. 사람이나 생태계에서의 진화에 대한 군집 연구와 마찬가지로, 진화적 내력을 나타내는 계통수 작성은 단일세포에서 시작하는 것이 가장 좋다. 다수의 단일 세포를 분석한다면, 관계도를 작성하고 계통수를 그릴 수 있다. 지금까지 일부 백혈병과 림프종에서 이에 대해 보고하고 있고 하나의 종양 내에 상당한 복잡성이 있음을 규명하였다. Shlush 등은 많은 단일 백혈병 세포에서 다형성 체세포 돌연변이를 추적하고 그들의 세포분열 내력을 토대로 하여 세포 계통수를 재구성하였다. 진단 세포와 비교하여 재발 세포에서 재구성한 계통수는 얕고(거의 분열하지 않음) 더 많은 아군집을 가지고 있었다. 흥미롭게도, 재발 세포는 진단 sample의 휴지상태인 L-IC와 밀접한 관련이 있었다. 이 결과는 재발이 거의 분열하지 않는 L-IC로부터 유래하였을 것임을 시사한다.

요약하면, 단일 종양 내에서 유전적으로 다양한 subclone을 동정함으로써 종양 내 비균질성은 각각의 subclone에 있는 독특한 돌연변이들에 의해 유도됨을 확인하였다(그림 1). 하지만, 서열분석 연구만으로는 해결할 수 없는 중요한 의문이 남아있다. 어느 돌연변이가 종양 성장을 유도하는가? 어떻게 이러한 발암변이가 subclone의 clone 증식능력으로 연결될 수 있는가? 종양세포의 유전적 다양성이 장기간 종양 증식의 원인이 되는가? 어느 subclone이 더 진화할 것인가? 한 subclone 내에 있는 모든 세포가 치료에 동일하게 민감할 것인가? 어느 clone이 재발하거나 전이될 것인가? 이러한 의문을 풀기 위해서는 기능적인 분석이 필요하다.

6. 비유전적 기작에 의한 비균질성 - CSC 모델

기형암종, 폐소세포암종, 유방암에서의 연구를 시작으로 현재는 정상 조직을 구성하는 발생 프로그램(developmental program)이 암에서 일부 기능하고 있을 것으로 생각하고 있다. 정상 줄기 세포가 분화된 조직을 만드는 것과 유사하게 많은 종양에서 종양 “줄기” 세포로부터 “분화된” 세포가 생성된다. 따라서, 종양은 배발생이나 정상 조직 재생의 서투른 모방(caricature)이라고 볼 수 있다. 조혈계에 대한 초기 연구에서 백혈병 골수 아세포의 대부분이 유사분열 후의 상태(postmitotic)이고 빠르게 증식하는 세포들의 소군집으로부터의 보충이 필요함을 확인하였다. 또한 매우 천천히 분열하여 항증식성 치료에 내성을 가지는, 재발의 근원이 되는, 백혈병 군집이 드물게 있을 것임을 예측하였다. 이 군집은 정상 조혈모세포와 유사한 속도의 세포질 분열을 보이므로, 백혈병의 “줄기 세포” 군집으로 제안되었다. 이러한 초기 연구는 AML 전구세포를 동정하기 위한 노력과 함께, 계층 구조 측면에서 백혈병에 대한 관심을 유발하였다.

종양의 계층 구조를 확인하기 위해서는 종양이 전향적 분리 및 분석이 가능한 기능상 뚜렷이 구분되는 세포들로 이루어져 있음을 규명하는 것이 중요하다. 유세포분석(FACS) 기술과 함께 면역결핍 쥐에 이종이식하는 기술이 진보하면서, 사람의 정상 조혈세포와 백혈병 세포를 쥐에 이식하는 것이 가능해졌다. 이러한 방법은, 정량분석과 함께, T-IC 분리에 대한 토대를 마련했다
 예를 들어, L-IC(AML의 T-IC)의 전향적 분리에 세포 표지자 CD34와 CD38을 이용하여 CD34+CD38- 세포는 백혈병 개시능력이 있지만, CD34+CD38+이나 CD34- 세포는 이식이 되지 않음을 확인하였다. 또한 쥐마다 서로 다른 수의 세포를 주입함으로써, 백혈병을 개시할 수 있는 2.5 × 105 세포를 1로 계산하여 이식에 대한 선형 상관관계(linear correlation)를 규명하였다. 게다가 보다 민감한 면역결핍 쥐 모델(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency, NOD/SCID)을 이용하여, AML은 CD34+CD38- L-IC가 정상(apex)에 있는 계층을 이루고 있음을 확인하였다. 이 연구를 통해 모든 AML 세포가 동일하지 않고 L-IC가 매우 드물게 존재함을 규명하였다.

이러한 AML에서의 초기 연구는 이후 고형 종양 CSC 연구의 토대가 되었다. 유방암에서 처음으로 고형종양 CSC를 동정하였다. 유방암 세포의 일부(subset, CD44+CD24-)는 전향적 분리가 가능하고 면역결핍 쥐에서 이종이식을 형성하였다. 이 CSC는 연속계대가 가능하고 모종양과 유사하게 비균질한 이종이식을 형성하였다. 이러한 결과는 AML과 동일한 CSC 원칙이 고형종양에도 적용될 수 있음을 보여주었다. 이후, 뇌종양, 두경부암, 췌장암, 폐암, 전립선암, 대장암, 육종을 포함한 수많은 암에서 CSC를 확인하였다. 모든 경우에, 이종이식에서 non-T-IC가 생성되었고 이는 계층구조에 대한 증거가 되었다. 그러나, 환자 암 조직에서 확인한 대부분의 경우, 하나 혹은 보다 많이 파생된 subclone이 있는지, 이종이식과 원발종양을 비교한 유전적 분석이 수행되지 않았다. 그럼에도 불구하고, CSC는 서로 다른 종양의 아형(subtype) 및 조직 종류에서 공통적인 특징을 가지는 것으로 보인다. 요약하면, 종양 성장을 시작하고 촉진할 수 있는 능력은 종양 내 서로 다른 세포간에 다양하고 발암성과 비발암성 세포간의 계층적 관계가 이러한 다양성에 기여한다. 이러한 관계는 정상 조직의 발생학적 계층과 유사하게, 줄기세포가 정상(apex)에 있으며 자손 생성의 원인이 되어 결국 계통 제한을 증가시킨다.

7. 이종이식과 CSC 확인

종양 개시가 CSC를 정의내리는 특징 중 하나이므로, 이종이식 연구는 CSC 모델의 중심적인 역할을 한다. 그러나 이종이식 연구는 정위이식(orthotopic transplantation)으로도 TME나 환자의 종양 내에 있는 성장인자 환경을 정확하게 재현하지 못한다는 한계가 있다. 일부 쥐 성장인자는 종 교차 반응이 없다(e.g., TNF). 이러한 환경의 차이는 종양 세포에 선택적인 영향을 줄 수 있다. 그 결과, 사람에서는 T-IC 활성을 가지는 세포가 이종이식에서는 성장하지 못할 수 있다. 게다가, T-IC 활성을 확인하기 위한 실험적 기술이 손상을 줄 수 있다. 고형 종양을 단일 세포로 분해하는 과정에서 기질 성분과 세포 구조물이 손실될 수 있고, 세포는 대기에 노출되고 영양분과 pH에 갑작스런 변화를 겪는다. 그리고 세포 표지자에 대한 항원으로 염색하여 분리기를 통과하면서 non-CSC로부터 CSC로 추정되는 세포가 분리된다. 이렇게 종양의 본래 환경과는 급격히 다른 환경에서 몇 시간을 준비한 후, 세포는 이종 환경으로 주입되어 들어가 성장 잠재력을 분석받는다. 이러한 혹독한 실험 과정을 고려해 볼 때, CSC를 확인하는 실험은 가장 튼튼한 세포를 효과적으로 확인하는 것이다. 게다가, 이식 과정에서 TME의 주요 요소가 변한다. 이러한 모든 변화가 이종이식 분석에서 암세포 성장에 영향을 줄 수 있다.

지난 20년 동안, 보다 면역결핍된 쥐의 개발, 이식 방법의 개선, 사람 TME나 성장 인자를 가진 인간화된 수혜자(humanizing recipients)를 포함하여 이종이식 분석법이 점차 향상되어 왔다. 따라서, 초기 CSC 모델의 일부 측면은 세밀히 구분하여 논의할 필요가 있다. 예를 들어, AML의 L-IC는 CD34+CD38- 분획에만 존재하는 것으로 알려져 있었다. 그러나 보다 면역 결핍된 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)쥐를 이용한 결과, L-IC가 다른 분획에서도 발견되었다. 거의 모든 시료에서, CD34+CD38 분획에 L-IC가 존재하지만, 적어도 시료의 절반에서(>100 sample), L-IC는 또 다른 분획(보통 CD34+CD38+)에서 발견되었다. L-IC가 포함된 표현형 분획을 분석하는 것 외에도, 세포군집의 크기와 그 안에서 L-IC 빈도를 고려할 필요가 있다. 그럼에도 불구하고, 대부분의 경우에서, L-IC가 결여된 분획이 밝혀진 이후로도 계층의 증거는 여전히 확인되고 있다. CD34와 CD38로는 L-IC가 결여된 분획을 확인할 수 없는 sample에서, miRNA 발현 정도를 기반으로 하여 L-IC와 non-L-IC 분획을 전향적 분리할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 이러한 sample에서도 종양이 CSC 모델을 따르지 않는다고 추측하여 결론 내릴 수 없다. 그 보다는, 이런 경우에는 세포 표지자가 계층구조를 결정하는데 적절하지 않은 것으로 보인다. miRNA의 발현을 기반으로 한 세포 분리는 이미 사람의 HSC 분리에서 유용함을 보였다. 이 방법은 세포 표지자로는 분리가 불가능하거나(많은 고형종양 종류에서) 유용하지 않은 경우에 세포를 분획하는 방법으로 보다 연구될 필요가 있다. miRNA에 더하여, Wnt reporter와 같은 세포의 신호전달 활성을 측정하는 reporter 분석(reporter assays)도 T-IC와 non-T-IC를 분리하는 대체 가능한 방법일 것이다.

고형종양에서는, 실험 조건과 이종이식 실험법의 종류에 따라 T-IC의 표현형과 성질이 일치하지 않는 결과가 더 많았다. 흑색종의 경우, 면역 결핍이 증가된 수혜자를 이용하여 가장 수용적인 수혜자에서 T-IC 빈도가 거의 1분의 1로 분석될 만큼 엄청난 배수로 변화되었다. 이러한 종양은 대부분의 종양 세포가 T-IC이므로, 균질하고 계층 모델을 따르지 않을 것이다. 그렇지만, 보다 면역 결핍된 쥐 모델을 사용하는 것이 반드시 CSC의 존재를 입증하는 증거들을 변화시키는 것은 아니고, 많은 종양에서 T-IC와 non-T-IC를 포함하는 계층을 발견할 수 있게 하였다. 다른 경우로 유방암의 경우, 사람의 기질 요소를 이식하여 신뢰할 수 있는 T-IC를 검출하는 것이 가능하였다. 따라서, 이종이식 실험법에서 사람 면역계 성분뿐만 아니라 종간 교차 반응하는 성장 인자를 발현하는 수혜자를 이용하는 것은 종양 계층 구조에 대해 보다 신뢰 있는 판단을 가능하게 할 것이다.

지금까지 CSC 연구의 주요 한계점은 T-IC의 유전체와 기능적 특징에 대한 통합이 부족하였다는 것으로 앞으로 이 부분에 대해 기술할 것이다. 특히, 어느 유전적 clone이 이종이식을 생성할 수 있는지, 어떻게 이것이 상응하는 CSC 측정에 영향을 미치는지를 알아볼 필요가 있다.

8. Clone의 역동성, 휴면상태 및 치료실패

앞에서 살펴본 바와 같이 비록 모든 종양 세포가 T-IC 기능을 가지는 것은 아니지만, 모든 T-IC의 종양 증식 능력이 동일한지에 대한 의문을 제기해 볼 수 있다. 만약 차이가 있다면, 한 유전적 clone내에서 차이가 있는지 규명하는 것이 중요할 것이다. 이 문제를 다루기 위해 각 clone에서 유전적 분석과 함께 종양 증식을 측정하는 기능적 분석이 필요하다. Kreso 등은 최근 대장암 이종이식을 통해 환자 종양에서 단일 유전적 subclone이 분리될 수 있고 쥐에서 안정적으로 여러 계대 동안 증식이 가능함을 확인하였다. 또한 연속 이식을 통해 10개의 원발 대장암 sample로부터 150개 세포에 대한 성장 역학을 확인하였다. 분석한 모든 유전적 clone에서, 세포의 특성에 상당한 차이가 있었다: 일부 세포는 모든 이식에서 증식하고 살아남는 반면, 다른 세포는 활성이 약하고 이식을 하는 동안 나중에는 발견되지 않았다. 이러한 결과는 고형종양의 한 유전적 clone 내 세포 간에 기능적인 다양성이 있음을 보여준다.

게다가, 세포의 거의 20%는 처음에는 발견되지 않았지만 연속 이식 후에 점차 활성화되어 계속 기능을 하였다. 이는 원발 대장암에 종양 성장을 촉진하는 휴면상태의 세포 군집(dormant cell populations)이 있음을 나타낸다. 또한 이종이식에서 일반적인 화학요법에 의해 일부 장기간 유지되는 세포는 죽지만, 휴면세포는 살아남아서 종양의 재생에 기여함을 발견하였다. 휴면 종양세포는 유방암, 흑색종, 백혈병과 같은 다른 체계에서도 관찰된다. 대부분의 일반적인 화학요법은 분열하는 세포에 독성을 나타내므로, 휴면은 암세포의 회피나 생존을 가능하게 할 것이다(그림 3). 요약하면, 한 유전적 clone내에서 암세포는 화학요법에 대한 생존 또한 비균질하다. 이러한 기능적인 다양성은 종양 내 복잡성에 새로운 단계를 더할 것이다.

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그림 3. Subclone내 세포 간의 기능적 다양성과 치료 반응

9. 유연성(plasticity)과 CSC 확인

생체 외 연구는 T-IC를 연구하는 대용 방법으로 주로 이용된다. 생체 외에서 배양해 온 세포주에서 T-IC가 고정된 상태가 아님을 확인하였다. T-IC가 풍부한 군집은 non-T-IC를 생성하지만, non-T-IC 군집이 T-IC를 생성하는 경우도 있다. 히스톤 탈메틸화효소인 JARID1B에 대한 연구를 통해 흑색종 T-IC 상태의 복잡성을 확인하였다. JARID1B는 천천히 분열하는 흑색종 세포의 특징이 된다. 이 세포는 종양 개시에는 필요하지 않지만 흑색종의 지속적인 암 성장과 전이에 중요하다. JARID1B 발현은 작은 아군집으로 제한되지만, 이 아군집은 역동적으로 유지된다: 분리된 JARID1B-양성 세포가 JARID1B-음성 세포를 생성하는 동안, CSC 모델에서 예측되듯이, 단일 JARID1B-음성 세포도 JARID1B-양성 세포를 포함한 다른 종류의 자손을 증가시킨다. 이러한 결과는 종양 유지에 필수적인 일부 세포가 고정된 상태가 아니라 상황에 따라 종양 유지 능력을 획득할 수 있음을 보여준다.

정상 세포가 다시 줄기세포 상태로 돌아갈 수 있다는 연구 결과는 non-T-IC로부터 T-IC가 생성될 가능성을 제시한다. 실제로, 유방암에서 EMT 인자가 non-T-IC로부터 T-IC를 생성하는데 이용된다. 암세포가 있는 환경도 줄기세포 상태를 유도할 수 있다. 예를 들어, 근섬유아세포가 분비한 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor)는 생체 내에서 분화된 대장암 세포에 Wnt 신호를 활성화하여 T-IC 상태를 유도할 수 있다. 장상피 비줄기 세포는 Wnt 활성에 의해 줄기세포 표지자를 재발현하고 T-IC로 “역분화(dedifferentiate)”할 수 있음을 장 종양개시 쥐 모델에서 확인하였다. 마찬가지로, 내피 세포로부터 방출된 혈관주위의 산화질소(nitric oxide)는 Notch 신호를 활성화하여 신경교종(PDGF-induced gliomas)에서 줄기세포 상태를 유도하였다. 이러한 연구는 암세포의 역동적인 성질을 강조하고 종양 생성에서 줄기 세포의 중요성을 보여주었다.

다른 암도 이런 성질을 가질 수 있는지, 또한 유연성을 증가시키는 것이 원발 종양 조직에 존재하는지, 그것이 세포주와는 달리, 생체 내에서 유도 될 수 있는지를 규명하는 것이 중요할 것이다. 비록 도발적이지만, 일부 연구에서 보고하는 유연성은 clone에 의해 결정되는 것이 아니므로 각 상태에서 세포의 균질성 및 상태를 변화시킬 수 있는 세포의 빈도를 이해하는 것이 필요하다. 모든 non-T-IC가 새로운 T-IC를 생성하는가 혹은 일부 non-T-IC만이 새로운 T-IC를 생성할 수 있는가? 만약 일부라면, non-T-IC 군집의 비균질성을 반영하는 것인가? 명백한 것은, T-IC와 non-T-IC 상태를 상호변환 할 가능성이 높은 종양은 그러한 상호변환이 드문 경우보다 계층 구조를 덜 의미 있는 것으로 만든다는 것이다. 따라서, 이러한 상호변환의 가능성과 이에 영향을 미치는 요인을 결정하는 것이 중요하다. 그러나, 상호변환이 높은 종양에서도, stemness를 가진 암세포가, 반대 상태일 때보다 더 진행되고, 전이되고, 치료 내성 및 자기복제 능력을 가진다. 따라서, 종양이 정확하게 CSC 모델을 따르지 않는 경우에도, stemness라는 개념은 중요하다. 이러한 근거를 토대로 봤을 때, stemness를 가진 세포를 근치하기 위한 새로운 접근이 필요하다.

10. 후생유전학과 stemness

발생학적 계층을 조절하는 주된 비돌연변이 기작은 유전체의 후생 유전자 조절이다. DNA, histone, nucleosome 및 miRNA를 포함하는 비암호화 RNA의 후생유전적 변화는 유전자 발현을 변화시킨다. 후생유전체(epigenome)에서의 변화는 세포 운명을 결정하고 비암화세포를 재설정(reprogramming)하는 방법으로 이용되어 왔다. 비록 후생유전적 변화가 돌연변이만큼 안정적이지 않고 반전될 수 있다 하더라도, 일부 변화는 독특한 세포 상태와 기능을 생성할 수 있는 안정적이고 유전적인 수단이다. 여러 체계에서 다양성에 기여하는 후생유전학적 조절의 중요성을 확인하였다. 예를 들어, 종양 성장에 필수적인 느리게 분열하는 흑색종 소군집은 jumonji/ARID1 histone 3 K4 탈메틸화효소인 JARID1B의 발현을 이용하여 분리할 수 있다. 정상 줄기 세포의 자기복제에 관여하는 Polycomb 그룹 전사 억제자(BMI-1, EZH2)를 포함한 다른 후성유전학적 인자도 종양 내에서 발현에 차이를 보이고 종양 진행에 중요한 역할을 한다. 또한 암생물학에서 stemness의 중요성을 보여주는 또다른 결과로, 정상 줄기세포 기능을 조절하는 후생학적 조절자의 유전적 손실이 암 발병에 관여함을 유전체 서역분석을 통해 확인하였다. AML에서 빈번하게 나타나는 DNMT3A 변이는 유전자 발현 이상을 유발하여 stemness 유전자 발현 증가와 정상 HSC의 재증식 및 자기복제 증가를 유도하였다. IDH1/IDH2 및 TET2에서의 변이와 같은 다른 빈번한 변이는 stemness를 조절하는 후생학적 program에 영향을 주었다. 따라서, 정상 세포의 다양성을 조절하는 후생학적 인자가 서로 다른 암세포 상태 유지에 관련 있음이 밝혀지고 있다.

또한 후생학적 기전은 치료 반응의 다양성에 중요할 것이다. 흑색종, 폐, 위, 대장, 유방암 유래의 세포를 포함하는 몇몇 세포주에서 치료 후 약제에 대한 내성으로 생존하는 소군집을 발견하였다. 항암제-감수성 세포주(drug-sensitive cell lines)를 항암제로 치료하면, 대부분의 암세포는 죽는 반면에 소군집의 세포가 살아남았다. 이러한 항암제 내성 표현형은 히스톤 탈메틸화효소인 JARID1A의 높은 발현 및 IGF-1R 신호전달의 증가와 함께 전체 염색질 수준에서의 변화와 관련 있었다. 중요하게, 항암제 반응에 대한 비균질성이 한 암세포로 시작한 세포배양에서도 생길 수 있음은 이것이 비유전적 기작에 의한 것임을 나타낸다. 또 다른 연구 결과는 특정 단백질의 역동성에 대한 세포 간의 차이가 항암제 치료 반응과 관련있음을 보여주었다. 또한 항세포분열 항암제(antimitotic drugs) 반응에 대한 딸세포 간의 차이는 유전적 차이에 의한 것이 아니라 caspase 활성 및 cyclin B1 발현과 관련된 세포 내 네트워크 경쟁에 의한 것으로 보고되고 있다. 이러한 연구들은 세포 운명과 항암제 반응 조절에 있어서 비유전적 기작의 중요성을 강조한다.

유전자 발현 분석은 서로 다른 세포 상태를 확인할 수 있는 또 다른 중요한 방법이다. 단일 세포 복합 PCR(single cell multiplex PCR) 분석법과 FACS를 결합하여 대장암에 정상 대장 상피의 계통과 유사한 전사 상태를 가진 특정 소군집이 있음을 확인하였다. 또한 단일 세포로부터 형성된 종양에서 정상 조직의 다분화를 보여주는 형태상의 다양성과 전사상의 변화를 관찰하였다. 뿐만 아니라, 이러한 유전자 발현 program은 환자 생존의 중요한 지표가 되었다. 이러한 결과는 다분화 과정에 의한 후생학적 비균질성이 clone의 표현형과 기능의 다양성에 기여할 수 있음을 보여준다. 따라서, 이는 종양 비균질성이 유전적 다양성에 관계없이 정상 조직의 분화와 유사한 전사 pro-gram에서 기인할 수 있음을 입증한다.

11. Noisy 유전자 발현과 비균질성

하등 생물에서의 연구를 통해, 단백질의 합성 및 분해와 관련된 확률적인 비유전적 과정(stochastic nongenetic processes)으로 많은 표현형 효과를 설명할 수 있음을 발견하였다. 포유류 세포에서, 균질한 세포의 생존은 단백질 수준에서의 내재된 차이에 의해 영향을 받을 수 있고, 그 단백질은 세포들간의 수용체 매개 세포사멸을 조절하여, 유전자 발현 시 나타나는 noise에서 있을 수 있는 엄청난 효과를 보여준다. 세포 내 단백질 수준에서의 차이는 비록 일시적으로 유전이 가능하더라도, 성장 속도의 차이와 유전자 발현에서의 noise로 인해 딸세포에서 빠르게 변한다. 이것은 앞에서 논의했던 후생학적 조절과는 본질적으로 다르다. 일반적으로, 근치 실패가 유전적 차이, 증식 상태, TME에서 기인하는 것으로 여겨져 왔지만, 단백질 수준에서의 내재된 차이에서 기인했을 가능성이 있다.

세포 군집 수준에서, 세포 상태의 균형을 조절하는 확률적인 과정에 대한 증거가 밝혀지고 있다. 예를 들어, 세포 표지자 발현을 기반으로 하여 표현형 분획이나 “상태”에 의해 분리된 후, 유방암 세포주는, 생체 외에서 시간이 지나면 균형상태로 돌아간다. 이는 서로 다른 표현형 상태간의 상호 변환에 의해 이루어진다. 이를 세포의 현재 상태에만 의존적인 상호변환율에 대한 Markov 과정을 이용하여 각 세포 분열마다 발생하는 확률적인 과정으로 모델링할 수 있다. 이 연구는 유방암 세포주에서 표현형의 균형을 설명하기 위한 이론적인 틀을 제공하였다.

요약하면, 동일한 환경에서 동일한 유전자형의 세포가 그들의 특성에 영향을 미치는 서로 다른 상태로 존재할 수 있다. 이러한 차이를 생명작용과 약물에 적용하는 것이 중요할 것이다. 대부분의 실험은 균일한 세포 군집이 균일한 방식으로 반응한다고 가정한다. 그렇지만, 각 세포 간의 생물학적 noise를 고려해 봤을 때, 많은 세포에 대한 평균 결과는 단일 세포 수준에서의 비균질성은 상쇄하고 순효과만을 나타낸 것이다. 새로운 기술 발전과 함께, 단일 세포에 대한 연구가 증가하면서 균질한 군집에서 세포간에 상당한 차이가 있음을 확인하였다. 예를 들어, 다양한 쥐 HSC와 전구세포 군집의 1,500개 단일 세포에서 280개 유전자에 대한 정량 PCR 유전자 발현 분석을 수행하였다. 이를 통해, 전형적으로 균일하다고 여겨졌던 세포에서 상당한 비균질성을 확인하였다. CSC 모델에서도, 균일하다고 여겨졌던 CSC 군집에서 상당한 차이가 있었고 이는 치료 표적에 영향을 주었다. 세포에 내재된 차이가 군집 내 일부(subset) 세포에 주어져 약제 표적에 불균등하게 반응한다면 분자 표적 치료는 효과적이지 않을 것이다.

12. 유전적 및 비유전적 모델의 한계

이 리뷰에서 논의했듯이, 유전적, 비유전적 결정요인은 모두 종양 비균질성에 영향을 미치고 이러한 두 가지 관점은 상호 배타적인 모델로 여겨져 왔다. 그러나, 각각의 관점을 분리해서는 암의 다양성을 완전히 설명하기에 불충분하다. 유전적 모델은 개개의 세포는 고려하지 않고 유전적 비균질성에 초점을 둔다. 그러나 앞에서 서술하였던 비유전적 결정요인에 의해 유전적으로 균질한 subclone 내에서도 기능적인 면에서 다양성을 보일 수 있다. 마찬가지로, CSC 모델이나 계층 모델은 종양이 유전적으로 균질하고 고정된 상태로 존재한다고 본다. 유전적으로 뚜렷이 구분되는 subclone의 존재나 종양 진화를 고려하지 않는 주요한 한계점을 가지고 있다. 예를 들어, 하나의 종양은 서로 다른 subclone을 포함한다. 그 중 일부 subclone은 상당히 진행되었고 큰 변이부담을 가지므로 T-IC 활성 면에서 거의 균질할 것이다. 반면에 보다 적은 발암 돌연변이를 가진 다른 subclone은 T-IC가 거의 없을 것이다. 이런 subclone들은 분리에 이용하는 세포 표지자에도 차이가 있을 것이다. 따라서 종양 덩어리를 T-IC와 non-T-IC 군집으로 분획하는 것은 단순히 높은 T-IC 활성을 가진 것으로부터 매우 낮은 T-IC 활성을 가진 subclone을 분리하는 것으로 가능할 것이다. 이러한 가정에서, 세포 분리는 단순히 유전적 유사성을 기반으로 하여 이루어져 왔다. 그러나 CSC model은 한 subclone 내에서 유전적으로 동일한 세포의 T-IC 능력을 분석하는 것이 필요하다(그림 4). subclone의 다양성에 대한 최근 결과는 T-IC에 대한 전반적인 결과의 타당성에 대한 이의를 제기하였다. 그러나, 다음에서 논의할 것처럼, clone의 유전적 진화와 CSC 모델을 통합하여 암 비균질성에 대한 포괄적인 설명이 가능할 것으로 생각한다.

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그림 4. 유전적 subclone 맥락에서 CSC 성질을 연구하기 위한 실험적 접근법

13. CSC와 clone 진화 모델의 통합

치료 실패와 재발은 단순히 새로운 변이의 획득에 의한 것이 아니다. 살아남은 암세포는 종양의 재성장을 위해 재생력도 있어야 한다; 재발에 원인이 되는 세포는 T-IC처럼 작용해야 한다. 게다가, 종양은 역동적인 독립체이다: 세포는 죽거나, 증식하거나 잠복상태로 들어간다. 따라서, 종양 조직 덩어리나 종양의 서로 다른 부위에서 채취한 단일 세포에 대해 수행하는 정적(static)인 유전자 분석으로는 유전적으로 별개인 세포나 subclone의 기능적 중요성을 입증하기 어렵다. 예를 들어, 유전체 분석에 이용하기 위해 분리된 세포는 채취 직전에 죽으려는 중이었을 것이므로 종양 성장과 관련이 없다. 주장하건대, 종양에 있는 유일하게 중요한 세포는 장기간 clone 성장을 하는 세포일 것이다; 다른 세포는 궁극적으로 clone 고갈을 초래한다. 이런 근거를 토대로 봤을 때, clone-증식 세포는 종양에 대한 선택 단위를 나타낸다. 앞에서 논의했듯이, 자기복제 능력이 없으면 clone 고갈이 불가피하기 때문에 이 세포의 특징은 자기복제 능력을 가진다는 것이다. 따라서, 종양 내 subclone의 다양성을 보여주는 서열분석 연구에서 제기되는 의문은 장기간 증식하는 암세포에도 이러한 다양성이 존재하는가 하는 것이다. 이 의문을 확인하기 위해, 가장 좋은 방법은 유전적 분석과 T-IC 기능 분석을 결합하는 것이다.

B-ALL과 T-ALL에서의 연구는 기능적으로 확인된 L-IC 내에 subclone의 유전적 다양성이 존재함을 보여주었다. 단일 세포 FISH(fluorescence in situ hybridization) 연구를 통해 진단 종양이 유전적 subclone을 포함하고 있음을 규명하였고 그들간의 진화적 관계를 보여주었다. 이 종양을 이종이식한 결과, L-IC만이 백혈병 증식을 개시할 수 있기 때문에, 이종이식의 유전자 구성은 이식된 L-IC(s)의 유전자형을 반영하였다. 동일한 sample의 세포를 이식하여도 각각의 쥐는 유전적으로 별개인 subclone을 보였다. 이는 L-IC 간에 유전적으로 다양함을 나타낸다. 게다가, 각각의 subclone을 구별 짓는 서로 다른 변이가 발생하여 stemness, L-IC 빈도, 이종이식 재증식의 공격성(aggressiveness)을 포함하는 기능적 특징에서 변화를 초래하였다. 실제로, 덜 공격적인 성장 성질을 가진 일부 subclone은 보다 공격적인 subclone으로부터의 경쟁이 없도록 희석 한계(limiting dilution)로 이식했을 때에만 clone 분석에서 발견되었다. subclone의 유전적 다양성을 확인하는 것은 조상 subclone으로 돌아가려고 하는 진화적 과정의 재현을 가능하게 하였고 기능적으로 별개인 subclone들이 분기진화론에 의해 연관되어 있다는 것을 증명하였다. 중요하게, 이러한 연구는 일부 이종이식이 재발과 관련된 진단상의 소수 subclone이 재증식한 것임을 보여주었다. 요약하면, 이러한 이종이식 연구는 일부 재발의 경우, 우세한 진단 clone의 지속적인 변이에 의한 것이라기보다는 검출되지 않은 조상 clone에서 발생한 것이라는 기능적인 증거를 제공하였다.

이렇게 유전적, 기능적 연구를 결합하여 유전자형이 L-IC 빈도에 영향을 미침을 발견하였다. CDKN2A/B 변이를 가진 B-ALL sample은 L-IC 빈도가 이 변이를 가지지 않은 sample보다 평균 1,000배가 증가하였다. 또한 유전적 병변을 가진 쥐 모델에서 유전자형이 T-IC 성질에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다. 예를 들어, 3가지의 서로 다른 폐암 쥐모델에서 T-IC의 표현형과 관련된 다양성을 발견하였다. 발암성 K-rasG12D 의 활성과 p53 결핍에 의해 개시된 종양에서는, Sca-1 발현 세포가 T-IC 활성을 가졌다. 그러나, K-rasG12D 단독에 의해 생성된 선암에서는 Sca-1이 T-IC 활성을 강화시키지 않았다. 게다가, 사람의 돌연변이 EGFR 이식유전자를 발현하는 선암은, Sca-1-음성 세포만이 T-IC 활성을 가졌다. 이 결과는 특정 암 종류의 모든 환자 sample에서 동일한 표지자로 CSC를 동정할 수 없을 것임을 보여준다. 중요한 점은, CSC 표지자는 서로 다른 유전적 종양 모델간에 서로 다른 반면에, 계층구조는 각 모델 내에 존재한다는 것이다. 이는 유전적 다양성 외에, 비유전적인 기능적 변화가 종양 성장을 조절함을 보여준다. 따라서, 이러한 모델은 암의 유전적 배경이 CSC 성질에 미치는 영향을 강조한다.

요약하면, T-IC는 고정된 독립체가 아니라 진화할 수 있다. 그들이 진화하고 추가적인 변이를 획득하면, T-IC 빈도가 증가한다. 이는 유전적 부담의 증가가 자기복제 능력을 증가시킬 뿐만 아니라 악성 분화 과정을 방해할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 종양 진행 초기의 종양은, 소수의 T-IC와 보다 분화된 다수의 non-T-IC를 가지고, 발생한 조직의 발생학적 계층을 모방한다(그림 2). T-IC에 이로운 변이가 축적되면서 분화 과정이 교란되고 자기복제 능력이 증가되어 subclone에서 T-IC가 확장된다. 이는 분석상에서 T-IC의 증가한 빈도로 나타난다. 종양이 진행되면서, 변이부담이 더 높아져서 남아있는 분화과정을 손상시키고 자기복제 능력을 더욱 증가시킴으로써, T-IC 성질을 가진 세포가 더 확장된다. 이러한 역동적인 모델에서, 암이 진행될수록 유전적 subclone 내에서 종양 계층은 점차 얕아진다. 일부의 경우에는, T-IC 빈도가 너무 높아서 종양 subclone은 계층이 없는 기능적으로 균질한 상태가 될 것이다. 이 모델이 정확하다면, 왜 같은 종류의 종양에 대한 연구에서 T-IC 표현형, 빈도 등에 있어서 실험실 간에 서로 다른 결과가 관찰되는지에 대한 설명이 가능하다; 서로 다른 진행 단계의 종양은 변이부담이 다르기 때문에 비교될 수 없을 것이다.

돌연변이는 T-IC와 non-T-IC 군집 둘 다에서 발생하고, T-IC만이 장기간 증식하고 자기복제하는 세포를 포함하기 때문에, 대부분의 T-IC는 non-T-IC가 아닌 T-IC의 유전적 진화로부터 생길 것이다. 그렇지만, 가끔 non-T-IC에서 발생한 돌연변이가 자기복제 능력을 가지게 하여 T-IC로 전환될 수 있을 것이다. 따라서, 종양이 진행되는 동안, T-IC는 진화하는 T-IC로부터 생성된 T-IC 뿐만 아니라 일부 새롭게 생성된 T-IC로 구성될 것이다. T-IC는 암의 진화 동안 선택 단위인 반면, non-T-IC도 T-IC의 전체적인 견고함에 중요하다. 이렇듯 유전적 진화와 발생학적/CSC 계층 모델을 통합하여 수정된 모델을 제안한다. 실제로, 앞에서 언급하였던 다른 비유전적 결정요인(noise, 확률성, 유연성, TME)이 non-T-IC를 T-IC로 전환하는 기작도 조절할 것이다. 전체적으로, 이 통합된 모델은 어떤 종양 종류가 이런 예측을 따를지를 결정하기 위한 앞으로의 연구에 틀을 제시할 것이다.

14. 고형종양 연구에 대한 해결 과제

고형 종양 연구들은 모종양 내에서 subclone의 다양성을 밝히기가 어려움을 제시한다. 몇몇 연구들은 유전적 subclone이 위치상으로 분리됨을 보여주었다. 그렇다면, 연구에 사용된 생체 검사 시료는 전체 모종양을 대표하지 못할 것이다. 고형종양의 경우, 원발 종양의 서로 다른 위치에서 많은 sample을 채취하는 것이 별개의 유전적 subclone을 연구하는데 중요할 것이다. 하나의 생체 시료에도, 여러 가지 유전적 subclone이 있을 것이다. 각각의 subclone에 대한 CSC 연구를 수행하기 전에 clone을 분리하는 과정이 필요하다. 심층염기서열분석을 이용하여 subclone의 계층 관계를 재구성할 수 있고, 암세포를 여러 쥐에 극히 소량으로(clonal cell doses) 이식하여 subclone을 분리할 수 있다(그림 4). 독립적인 유전적 subclone을 이식한 이후, 각각의 subclone에서 CSC를 연구할 수 있다. 따라서, 종양 시료 전체가 채취되지 않았더라도, 적어도 모종양의 일부 subclone에 대해서는 CSC를 연구할 수 있을 것이다. 성공적인 치료를 위해 모든 subclone과 그에 상응하는 CSC가 근치되어야 하기 때문에 독립적인 subclone의 맥락에서 CSC를 연구하는 것이 중요할 것이다.

15. Stemness, 예후, 치료의 연관성

만약 CSC가 종양에서 선택 단위를 나타낸다면, 생존을 포함한 임상 지표는 non-CSC보다는 CSC의 성질에 보다 밀접하게 관련 있어야 한다. 이 개념을 시험하기 위해 non-T-IC와 비교하여 T-IC의 독특한 분자 회로를 이해하는 것이 필요하다. 16개 AML sample 각각을 4개의 분획(fraction)으로 분리하고 각 분획의 L-IC 활성은 이종이식으로 확인하였다. AML sample의 유전자 발현 분석을 통해, L-IC의 독특한 전사적 특징을 확인하였다. 각 sample 에서 L-IC를 포함하는 분획은 다양하기 때문에 기능적인 L-IC 시험이 필수적이다. 그 결과, L-IC 특징으로 광범위한 AML 환자에서 전체 생존 예측이 가능하였다. 이는 CSC 모델의 타당성과 L-IC의 임상적 연관성을 보여준다. 이와 동시에, 정상 HSC와 전구세포에 대한 전사적 풍경(transcriptional landscape) 분석을 수행하였다. 그 결과, HSC와 L-IC 유전자 발현 특징이 stemness의 특징을 공유하고 있고 이 또한 예후 예측과 관련이 있었다. 각각 독특한 유전적 변이를 가진 광범위한 환자에서 단일 특징으로 강력한 예후 예측이 가능하다는 점은, stemness가 많은 발암변이를 연합하는 과정임을 규명한다. 최근에, stemness 특징이 고형조직의 정상 줄기세포에서 확인되었다. AML에서의 연구와 유사하게, 줄기세포 특징은 T-IC 함량(content)과 환자 결과를 상당히 예측하였다. 전체적으로, 이러한 초기 연구는 유전적 특징과 stemness의 연관성을 보여주고 이 개념을 일반화하는 것이 가능한지 시험하기 위해 광범위한 종양으로부터 보다 많은 stemness 특징을 확인할 필요가 있음을 강조한다.

교아종, 대장암, 유방암 및 수많은 다른 종양에서 stemness와 치료 내성과의 연관성을 확인하였다. 그 결과, T-IC 분획이 non-T-IC 보다 치료에 내성을 보였다. 실제로, T-IC는 나머지 종양세포와는 뚜렷이 구분되는 치료 내성뿐만 아니라, 세포죽음 회피와 휴면을 포함한 여러 가지 생물학적 성질을 가졌다. 생체 외 혹은 이종이식 결과와 함께 환자에서도 많은 결과가 축적되었다. 골수형성이상증후군(5q–myelodysplastic syndrome, MDS) 환자에서, lenalidomide 치료를 통해 완전 관해가 가능하더라도 변함없이 재발이 발견되었다. 치료 이전에 채취한 골수 시료에서 전구세포(CD34+CD38+)와 L-IC(CD34+CD38−Thy1+)의 분획 모두에서 5q– 결실을 확인하였다. 대부분의 환자에서 L-IC 분획은 lenalidomide 치료에 내성을 가지는 반면에 전구세포는 제거되었다. 한 말기 환자의 경우, L-IC와 전구세포 분획 둘 다에서 치료 내성을 보였다. 이는 CD34+CD38−Thy1+ 표면 표지자로 표지되지 않는 L-IC 군집을 가진 유전적 subclone에 대한 치료였거나 non-CSC에서 추가적인 변이로 L-IC 성질을 획득했을 가능성을 나타낸다. 요약하면, 이러한 연구는 치료 반응 및 생존과 같은 임상 지표를 조절하는 유전적 특징과 CSC 성질간의 상호작용을 강조한다.

stemness와 예후, 치료 실패에 대한 연관성을 나타내는 결과는 stemness의 결정요인에 대한 표적치료가 T-IC를 근치하고 재발을 막는 효과적인 방법이 될 것임을 제안한다. Bmi-1은 자기복제능력을 조절하고 몇몇 조직에서 줄기세포 유지에 관여한다. 사람 대장 T-IC 기능이 BMI-1에 의존적이고, BMI-1의 발현을 억제하면 T-IC의 자기복제 능력이 저해되어 종양 형성이 억제됨을 발견하였다. 원발 대장암 이종이식에 BMI-1 억제제를 처리하면 T-IC가 감소하고 장기간 비가역적으로 종양 성장이 억제되었다. 그러므로, BMI-1과 다른 예상되는 자기 복제 기전의 요소에 대한 임상 표적을 찾는 시도가 필요할 것이다. stemness와 관련된 인자는 정상 줄기세포와 CSC간에 공유하므로, 정상 줄기 세포에 대한 치료 영향을 최소화하기 위해 정상 줄기세포와 다른 CSC의 범위를 이해하는 것이 필요할 것이다.

Ⅲ. 나아갈 길

지난 몇 십 년간, 암성장에 대한 이해가 높아졌다. 서열분석 기술의 발전은 종양 유전체를 판독하는 길을 닦았다. 이를 통해 종양이 하나의 유전체가 아닌, 별개의 subclone들에 대한 다수의 유전체로 이루어져 있음이 명백해졌다. 이러한 subclone은 암의 일생에 걸쳐서 동시에 진화할 것이고 종양 내 비균질성에 기여할 것이다. 그러나, 한 유전적 subclone 내에서도 모든 세포가 동등하게 기능하는 것은 아니다: 일부 세포는 자기복제 능력을 보유하여 장기간 clone을 유지하고, 일부는 휴면상태로 들어가며, 일부는 종양 성장을 촉진하고, 대부분의 종양 세포는 유사분열 후 제거된다.

이러한 복잡성에도 불구하고 발생학적 계층에 근거를 둔 통합 원칙이 있어서 암을 표적으로 한 접근이 가능할 것이다. clone이 무한 성장 능력을 가진 세포를 포함하고 있는지 리트머스 시험으로 확인한다. 무한 성장 능력은 자기복제 능력과 같은 stemness 성질을 가진 대부분의 초기 세포에서 나타난다. 따라서, 종양 내 stemness 성질에 대한 이해를 통해, 종양 성장을 추진하는 중요한 세포에 대해 간파하는 것이 가능할 것이다. 여러 종류의 종양에서, 줄기세포 성질을 가진 세포는 방사선과 화학치료로부터 스스로를 보호할 수 있는 내재된 시스템을 갖추고 있음을 발견하였다. 뿐만 아니라, 줄기 세포 유전자 발현 프로그램은 환자 결과와 일치하였다. 이는 암과 stemness 성질의 연관성을 보여준다. Stemness에 대한 유전적, 비유전적 영향을 설명하는 것을 통해, 어떻게 각각의 발생학적 계층을 가진 다양한 유전적 subclone이 종양 유지를 조절하는지에 대한 통합적인 이해가 가능할 것이다.

자연에서, 진화는 생물다양성에 기여하여 전체적인 생태계를 견고하게 한다. 암에서, 종양 세포 내 유전적, 기능적 다양성은 TME와 함께 종양의 적합성을 증가시켜 치료로부터 살아남는 것을 가능하게 할 것이다. 따라서, 보다 효과적인 치료를 위해 이러한 다양성을 이해하는 것이 중요할 것이다.

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정의경(2016). 암줄기세포 모델의 진화. BRIC View 2016-R15. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=2549 (Aug 01, 2016)
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