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김한섭
김한섭(Hanseop Kim) 저자 이메일 보기
한국생명공학연구원
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Enhancement of target specificity of CRISPR–Cas12a by using a chimeric DNA–RNA guide

1. 논문관련 분야의 소개, 동향, 전망을 설명, 연구과정에서 생긴 에피소드

CRISPR-Cas 시스템은 박테리아 또는 고세균의 면역 시스템에서 기인한 기술이며, 세계적으로 많은 분야에서 사용되고, 특히 표적 특이적인 genome engineering 에 최적화된 기술입니다. CRISPR-Cas 시스템은 일반적으로, 가이드 RNA와 Cas 단백질로 구성되어 있으며, 표적 DNA 또는 RNA 에 특이적으로 결합하여 절단하는 것으로 알려져 있습니다. 대표적인 CRISPR-Cas 시스템으로, CRISPR-Cas9 유전자 가위가 있습니다. 그러나, 이 유전자 가위는 표적 DNA의 PAM (G-rich) 염기서열을 특이적으로 인식하는 특징이자 조건을 가지고 있습니다. 이에, 이러한 조건을 보완할 수 있는 CRISPR 시스템으로, CRISPR-Cas12a 시스템이 있고, Cas9 시스템과 다르게 표적 DNA 의 PAM (T-rich) 염기서열을 인식하는 특징을 가지고 있어, Cas9 시스템과 병행하여 널리 사용되고 있습니다.

그러나, 두 가지 CRISPR-Cas 시스템들은 공통적인 한계점이 있는데, 바로 비표적 절단 효과 (Off-target cleavage effects) 입니다. 가이드 RNA와 표적 DNA 의 염기간 결합이 일어나기 때문에 나타나는 문제점으로서, 표적 DNA와 흡사한 비표적 DNA의 절단도 발생한다는 것이 보고되어 왔습니다. 본 연구에서는 비표적 절단 효과는 가이드 RNA와 비표적 DNA 간의 결합에너지가 높을 때, 일어날 수 있다고 가정하였습니다. 따라서, CRISPR-Cas12a 시스템의 가이드 RNA 염기서열 3’ 말단에 부분적인 DNA 치환으로, 표적 DNA와 가이드 RNA 간의 결합 에너지에 변화를 도입하였고, 다양한 유전자에서의 표적 DNA와 비표적 DNA 상의 절단 효율을 확인하였습니다. 그 결과, 3’ 말단의 부분적인 DNA 치환이 도입된 키메릭 가이드 RNA (Chimeric guide RNA) 를 사용하였을 때, 표적 DNA의 절단 효율은 변화가 없었으나, mismatch 가 들어간 비표적 DNA 에서의 절단효과가 크게 감소하는 것을 다양한 유전자에서 확인할 수 있었습니다.

결론적으로, 본 연구는 CRISPR-Cas12a 시스템의 가이드 RNA에 부분적인 DNA를 도입하는 것만으로도 유전자가위의 표적 특이성을 크게 증가시킬 수 있다는 것을 규명한 데 의의가 있습니다. 이 방법은 가이드 RNA를 이용하는 다른 CRISPR 시스템에도 적용할 수 있고, 다양한 불치성, 난치성 유전 질환에 대한 유전자 치료제 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대됩니다.

2. 연구를 진행했던 소속기관 또는 연구소에 대해 소개 부탁 드립니다.

저는 경북대학교 생명과학부에서 박사과정을 밟고 있으며, 한국생명공학연구원의 미래형동물자원센터에서 이승환 박사님의 지도 하에 유전체 교정팀에서 연구를 하고 있습니다.

미래형동물자원센터는 중대동물자원의 인프라기관으로서, 형질전환 및 복제를 통한 동물자원의 생산 및 연구를 지원하고 있습니다. 기본적인 분자생물학부터, 발생, 줄기세포, 유전체 교정까지 다양한 팀과 첨단 장비들이 한 곳에 모여 있어, 최적의 연구환경을 가지고 있다는 장점이 있습니다.

3. 연구활동 하시면서 평소 느끼신 점 또는 자부심, 보람

실험을 하면서 연구가 스무 고개 푸는 것 같다는 생각이 참 많이 들었습니다. 매 번의 실험은 답을 알아내기 위한 질문들이고, 결과들이 질문에 대한 답인 것이죠. 그리고 ‘허를 찌르는 질문들’ 에 집착하게 되면서, 이 집착이 다양한 실험을 구상하고 진행하는데 많은 도움이 되었다고 생각합니다..

4. 이 분야로 진학하려는 후배들 또는 유학준비생들에게 도움이 되는 말씀을 해 주신다면?

저도 아직 박사과정 중인 학생이라, 감히 조언을 이야기하기는 어렵습니다. 대신, 제가 이 분야를 선택하였을 때, 중요하게 생각했던 기준을 말씀 드리겠습니다. 개인적으로, 나에게 궁금증을 끊임없이 일으키는 분야를 선택하는 것이 중요하다고 생각합니다. 궁금증은 예상 외의 실험 결과에도 낙담하지 않고, 새로운 실험을 이어 나가게 할 수 있는 원동력이라고 생각하기 때문입니다.

5. 연구활동과 관련된 앞으로의 계획이 있으시다면?

이번 논문에서 사용된 표적 특이적 유전체 교정 기법은, 전반적으로 세포실험 수준까지 완료되어 검증한 상태입니다. 이에 기초하여, 추후에는 Mouse 와 같은 동물의 in vivo 실험에 적용하여, 동일한 결과를 낼 수 있는 지 검증해보고 싶습니다. 더 나아가, 전임상을 위한 질병 모델 동물에도 적용하여, 기존의 유전체 교정 기법과 비교해 안전성을 증진하여 향후 임상 적용까지 발전시켜보고 싶습니다.

6. 다른 하시고 싶은 이야기들....

이 논문의 출판되기까지 정말 많은 분들의 도움이 있었습니다. 이번 기회에, 미처 전해드리지 못했던 감사인사를 드리고 싶습니다. 먼저, 아무 것도 모르던 저에게, 그 누구보다도 열정적으로 가르침을 주신 이승환 박사님께 큰 감사의 말씀을 드리고 싶습니다. 박사님께 연구자로서의 자세와 마음가짐을 배울 수 있었던 것은, 너무나도 큰 행운이었다고 지금도 느끼고 있습니다. 정말 감사합니다. 그리고 항상 아낌없는 지원을 해주시고, 저의 멘탈을 꽉 붙들어 주신 김선욱 센터장님께도 감사의 말씀 올립니다. 멀리, 대구에서 바쁘신 와중에도 협력해주시고, 많은 배려를 해주신 이동석 교수님과 연구실 식구 분들께도 감사드립니다. 또, 학위과정을 하시며 동고동락하는 우리 센터 동료 선생님 분들께도, 모두 감사드린다는 말을 전해드리고 싶습니다.

마지막으로, 고향에서 열정적인 응원과 지지를 보내주는 우리 형, 어머니, 아버지, 막내 손자 건강만 생각해주시는 할머니, 할아버지께 사랑하는 마음과 감사의 말씀을 올립니다. 지금껏 도와주시고 배려해주신 분들께, 더 좋은 모습 보여드릴 것을 약속 드리면서 이만 줄이겠습니다. 감사합니다.

 등록일 2020-07-29
Category: Biotechnology, Genetics, Genomics
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