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동물실험 고수님들 질문있습니다
동물실험
  (2013-02-12 20:08)
 공감2   조회11763  인쇄  주소복사  소셜네트워크로 공유하기
수정  

최근 저희 실험실에서 몇가지 동물실험을 세팅하는 중인데요 그와중에 질문이 있어서
고수님들의 의견을 묻고 싶습니다. 초보라서 기초적인 것도 질문드리는 점 양해 부탁드립니다;

동물에서 당대사능을 테스트하는 실험중에 glucose tolerance test랑
insulin tolerance test는 어느정도 자료도 많이 있고 빈번하게 논문에서 공부할 수 있는데요

당신생능을 실험하는  pyruvate tolerance test (PTT)에 대해서는 제가 자료를 잘 못찾았는지
상세한 설명을 못찾아서요

제가 이해하기로는 pyruvate가 혈중으로 유입이 되어 세포내로 흡수가 되면
TCA cycle의 출발물질로서 acetyl CoA로 전환이 되면서 소비가 되거나 또는 gluconeogenesis의 출발물질로 쓰여 세포내 glucose 생성에 쓰이는 걸로 알고 있습니다. 

여기서
1. 세포내로 흡수된 pyruvate가 어느 회로로 (우선적으로) 쓰이게 되는지 어떻게 판단을 하고 gluconeogenesis 활성을 판단하는 지표로 분류할 수 있는지

2. 그리고 gluconeogenesis를 주로 담당하는 장기가 간인것은 의심의 여지가 없는 것이지만 그렇다면 PTT가 주로 간에서의 gluconeogenesis를 비교하는 assay라고 단정할 수 있는가요? 만약 그렇다면 다른 장기(adipose tissue, skeletal muscle등) 에서도 어느정도 gluconeogenesis를 일으키고 잇을텐데 단지 간이 타 장기에 비해 gluconeogenesis 신호가 월등히 강해서
그렇게 설명할 수 있는 건지 아니면 PTT자체가 간을 포함한 모든 에너지대사에 관여하는 장기들에서의 gluconeogenesis의 총합을 비교하는 assay라고 봐야되는지 궁금합니다

3. 그리고 마지막으로 PTT 실험을 할 때 대부분 2g/kg로 투여하는데 일부 논문들을 보니  
normal chow diet를 먹이는 그룹은 그대로 2g/kg로
high fat diet 등으로 유도한 DIO(Diet induced obesity) 그룹은 1g/kg으로 용량을 조절해서 투여하던데 특별한 이유가 있는지, obese한 개체들에게선 어떤 민감한 facTor가 있는건지 궁급합니다.

아직 배우는 입장이라 질문이 정돈되지 못했습니다만
고수님들의 상세한 답변 부탁드립니다. ^^;;

미리 감사드립니다.

김기현  (2013-02-13 15:17)
공감0  비공감0   수정 삭제
다른 부분에 있어서는 지식이 짧아 대답을 못드리지만, 3먼 질문에 있어서는,
고지방식을 급여할 경우, 상대적으로 탄수화물의 함량이 적어집니다. 극단적인 경우 탄수화물free사료를 급여한 논문도 본 적이 있습니다만~ 따라서, 탄수화물의 결핍에 의해 단백질로 부터 분해된 아미노산이 당신생을 일으키게 됩니다. 따라서, 고지방식으로 비만을 유도한 동물로 실험을 할 경우 PTT의 투여량을 조절하는 것으로 생각됩니다.
회원작성글 둘리  (2013-02-14 03:18)
공감2  비공감0  
답글 다는 것을 즐겨하지는 않지만, 제가 가진 경험을 토대로 몇 글자 적어보았습니다. 참고하세요~

1. pyruvate를 주고, glucose를 측정하는 것이기 때문에, pyruvate가 다양한 metabolites로 사용되거나 전환될 수 있지만 (예, Glyceroneogenesis), 그런 부분은 직.간접으로 blood glucose level를 변화시키는 효과가 적거나 거의 없기 때문에, pyruvate를 주고 blood glucose가 변화되면 결국 gluconeogenesis의 효과라고 생각할 수 있기 때문입니다. (물론, 극단적인 경우 pyruvate가 sk. muslce등에 glycolysis rate에 영향을 주어서 effect를 줄 수도 있겠지만, blood glucose를 level를 증가시키는 것에 얼마나 기여할지는 의문입니다. glucose transporter와 MCT의 kinetics를 비교해보시길...)

2. Gluconeogenesis는 Hepatic >> Renal > Intestine 순이라고 알려져 있습니다 (intestine에 대한 논문이 있지만, 실제 생리학적 기여정도는 아직 논란이 있는 것으로 압니다). 다른 조직은 gluconeogenesis를 하지 않습니다. 간단하게 G6Pase (G6pc)의 조직별 발현을 찾아보시면 됩니다. 세 가지 조직 (liver, kidney, small intestine)을 제외하고는 발현하지 않는다고 생각하시면 됩니다.

어떻게 되었든 tracer (isotope labeled metabolites)를 사용하지 않고는 tissue specificity는 단정해서 이야기를 할 수 없습니다. G6Pase가 liver에서 가장 dominant하게 발현하지만, kidney와 intestine에서도 발현을 하기 때문입니다. 간단히 말씀드리면, GTT, ITT, PTT 모두 systemic effect를 보는 것이지 tissue specific effect를 보는 실험이 아닙니다. 하지만, 본인의 다른 데이터 (간에서 변화를 보여주는 여러 가지 cell based 실험과 biochemistry 실험 등)와 함께 하나의 논문이 되어, PTT의 변화가 간에서의 변화이지 않게냐고 주장할 수 있는 것입니다. (참고로, kidney는 pyruvate보다는 glutamine를 사용한 gluconeogenesis에 liver보다 더 의미가 있다고 논문이 나와 있습니다. 필요하시면 찾아보세요)

3. DIO mouse 등은 이미 insulin resistance가 생기기 시작했거나, 생겨서 basal blood glucose level이 높습니다. 그리고 일반적으로 사용하는 glucometer는 600mg/dl를 초과하는 값은 측정이 불가능 합니다. 실제로 db/db의 경우 측정범위를 넘는 경우가 종종 있습니다. 또한 가능한 적은 양의 pyruvate를 줘야 차이를 관찰할 확률이 높아집니다. 한 그룹은 정상의 pyruvate tolerance를 가지고 다른 그룹은 intolerance를 보인다면, 정상 그룹에서는 차이가 나지 않을 (정상그룹에 tolerable 한) 양을 주면, 정상은 정상 수치를 그리고 다른 그룹에서는 차이를 볼 수 있을 확률이 높아집니다. 반면 너무 많은 양을 주면, 두 그룹 모두에서 혈당은 증가하지만 차이를 보지 못할 수도 있습니다.

그 외에 PTT에 대해서 아셔야할 것은 일종의 공공연한 비밀(?)입니다. 세계적으로도 clamp실험을 할 수 있는 여건의 실험실이 많지 않습니다. clamp를 대신해서 hepatic glucose output을 볼 수 있는 실험은 거의 PTT가 유일하다고 할 수 있습니다. 그래서, PTT가 완벽하지 않음에도 차선책으로 많은 랩에서 수행을 합니다. 문제는, PTT를 하는 동안과 또한 PTT가 이뤄진 다음에 마우스의 상태가 별로 좋지 않다는 것입니다. 가끔 죽는 마우스도 있습니다. 사실 왜 죽는지, 왜 상태나 행동이 이상한지는 정확하게 알려져 있지는 않은 듯합니다. 어떤 랩은 dH2O를 사용해서 그렇다고 생각해서 PBS를 사용해 PTT를 해보았지만, 동일하게 마우스 상태가 안 좋았다는 이야기도 있고요, pyruvate 자체가 박테리아 등에 감염이 되어서 마치 LPS를 인젝션한 것의 효과가 있어서 그렇다고 생각해서, 필터도 하고 autoclaving도 하였지만, 유사한(마우스 상태가 이상한) 결과를 얻었다는 이야기도 이름만들어도 알만한 랩에서 들었습니다. PTT를 해본 세계의 여러 랩이 마우스 상태가 이상한 것을 알고 있습니다. 그럼에도 울며 겨자 먹기로 실험을 합니다. 저도 첫 실험에 몇 마리를 잃은 적이 있습니다. 그 외에는 제 경험으로는 pyruvate 투여 후에 물 섭취가 증가한다는 것도 알고 있습니다. 행여나 상태가 매우 안 좋은 마우스 움직이지 않고 이상한 증상(shivering을 하거나, 복부통증을 가진 마우스처럼 crouching한 자세를 보이 등의 증상)을 보이면, 실험을 중단하고 물을 준비하셨다가 경구투여해보는 것도 좋습니다. 그리고 저도 아직 정확한 이유는 모릅니다. 일반적으로 혈중에 pyruvate가 0.05mM이 정상 수치라고 하면, 2g/kg로 pyruvate를 인젝션하면, 대략 계산 해봐도 일반적인 크기의 마우스에게 약 5-6배정도 많은 양입니다. 그런데, pyruvate가 cell 내부로 uptake될 때, proton-symporter인 MCT에 의해서 이동을 합니다. 그래서 혈중에 많은 pyruvate가 세포 내의 pH에 영향을 주거나, 세포내 proton balance의 이상을 주어 마우스에 이상현상을 야기 하지 않을까 추측해보는 정도입니다. 말이 길어졌네요. 아무튼, PTT가 최선은 아니라는 것, 그리고 PTT는 (GTT, ITT도 물론) systemic effect를 보는 것이다라는 것. 하지만, gluconeogenesis가 가능한 G6Pase가 발현하는 tissue는 liver, kidney, small intstine이라는 것 정도를 기억하시면 답이 되지 않을까 합니다.
동물실험  (2013-02-16 18:31)
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글쓴이입니다. 늦게 확인하는 바람에 이제야 답변을 쓰네요ㅠㅠ
친절하고 자세한 답변해주신 김기현 님과 둘리 님께 진심으로 감사드립니다
안그래도 저희도 몇마리 테스트 했을 때 쥐들이 상태가 안좋아서 추가로 질문드리고 싶었던 내용이었습니다. 다음에도 이런 내용으로 여러 선배님들께 조언을 구할 수 있으면 좋겠습니다.
감사드립니다!

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