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웹진 Vol.23, No.12 (2021년 12월) 발간
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박테리아 유래 Sec 경로를 통한 단백질의 분비
박테리아 유래 Sec 경로를 통한 단백질의 분비 저자 우성화 (포항공과대학교)
등록일 2021.11.25
자료번호 BRIC VIEW 2021-R37
조회 361  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
일반 분비(Sec) 경로는 원형질막(plasma membrane)에 결합되는, 혹은 원형질막을 통과하는 대부분의 단백질을 위해 필수적이고, 아주 흔하며, 보편적인 분비 기작을 구성하고 있다. Sec 경로의 대상이 되는 폴리펩타이드는 방출될 완성형 도메인(mature domain)에 잘릴 수 있는 신호 펩타이드(signal peptide)가 융합되어 있는 전단백질(pre-protein)의 형태로 합성된다. 최근 몇몇 연구로부터, 리보솜부터 SecYEG까지의 과정에서 전단백질을 표적화하는 데에 관련된 샤페론과 전단백질의 상호작용 네트워크, 그리고 정확한 표적화 및 이동을 위한 구조적 신호에 대한 연구가 이루어진 바 있다. 또한, 구조적, 기계적 기작에 대한 연구를 통해서 ATPase 및 채널 역할을 하는 SecA가 분비 기작에 중요한 역할을 하는 것이 최근 밝혀진 바 있다. 본 리뷰에서, 저자는 최근 밝혀진 Sec 경로의 연속단계(분류, 표적화, 이동 및 분비)에 대한 생화학적, 구조적, 기계적 통찰에 대해서 다룬다. 특히, SecYEG의 구조 역학과, 리보솜, SecA, 그리고 전단백질에 의한 조절 기작이 주로 다뤄진다. 또한 본 저자는 박테리아에서의 Sec 경로를 통한 분비에 대한 기작과 열역학에 대한 개념적 모델을 제시한다.
키워드: 단백질 분비, Sec pathway, SecA, SecYEG, 신호 펩타이드
분야: Cell_Biology, Microbiology, Molecular_Biology

본 자료는 Protein export through the bacterial Sec pathway. Nat. Rev. Microbiol., 15, 21-36 (2017)의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목 차

1. 개요
2. 전단백질의 분류 및 표적화
  2.1. 신호 펩타이드
  2.2. 완성형 도메인
  2.3. 신호 인식 입자(SRP)
  2.4. 촉발 인자
  2.5. SecB
  2.6. SecA
3. SecYEG의 구조 및 역학
  3.1. SecYEG 채널의 구조
  3.2. 리보솜과 SecA에 의한 SecYEG 구조 조절
4. 이동 및 분비
  4.1. 번역과 동시에 일어나는 막 통합 및 분비
  4.2. 번역 이후 일어나는 막 통합 및 분비
  4.3. 전단백질의 성숙과 분비
5. 결론 및 전망


1. 개요

박테리아에서 합성되는 단백질의 1/3 이상은 세포질의 리보솜으로부터 세포막으로 이동된 후, 기능을 가지게 된다. 이런 단백질은 막에 결합되거나 세포질의 바깥으로 분비된다 (그림 1a). 일반적으로 이런 분비 과정은 일시적으로 단백질의 접힘을 지연시키기 때문에, 대부분의 단백질은 접히지 않아 안정적인 3차원 구조를 이루지 않은 상태로 분비된다.

세포막으로 향하는, 세포막에 결합되는, 그리고 세포막을 통과하는 단백질의 수송과정은 필수적이고 정교하게 조절되는 과정이다. 분비될 단백질은 아래와 같은 여러 가지 문제를 극복해야 한다 (그림. 1b); 1) 해당 단백질은 세포질 내에서 접히지 않지만 용해성이 있는 상태여야만 한다. 2) 해당 단백질은 세포질 단백질과 구분되어야 한다. 3) 해당 단백질은 세포막의 특정 분비 지점으로 정확하게 이동할 수 있어야 한다. 4) 해당 단백질은 알로스테릭하게 채널을 활성화할 수 있어야 한다. 5) 해당 단백질은 에너지 여부에 따라서 세포막에 결합되거나 세포막을 통과해야 한다. 6) 해당 단백질은 최종 목적지로 이동된 후 접혀서 안정적인 완성형의 구조를 가져야 한다.

박테리아는 세포 외피와 막 생합성을 위해서 여러 정교한 분비 기작을 가지도록 진화해왔다 (그림 1c). 이 중에서도 일반 분비(Sec) 경로는 생존에 필수적이며, 대부분의 생명체에서 흔히 발견된다. Sec 경로에 있어서 가장 중요한 구성요소는 단백질을 세포막 안쪽으로 결합시키거나 세포막을 횡단시키는 역할을 하는 막 횡단 단백질 SecYEG이다 (그림 1c). 박테리아에서는 ATPase 모터 SecA가 필수적인 추가 구성요소인데, 이는 SecYEG와 결합하여 완전 효소를 형성하고, 단백질을 정확하게 분비하며, 막을 이동하는 전단백질의 전환을 조절하는 효소이다. 일부 그람 양성 박테리아에는 SecY2나 SecA2로 알려진 추가 구성 요소가 필수적임이 알려진 바 있으며, 추가적으로 SecDF나 YidC로 알려진 구성 요소는 분비 효율을 향상시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.


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그림 1. 박테리아의 단백질 분비 기작


흔히 잘 알려진 대장균의 경우 분비 단백질의 96%가 Sec 경로를 거치는 것으로 알려져 있다. 이 중 60%는 막 단백질로 알려져 있으며, 세포질 단백질의 서열과 크게 다르다. Sec 경로를 통해 분비되는 모든 단백질은 전단백질 형태로 합성되며, 절단 가능한 신호 펩타이드를 가진다 (그림 1d). 이러한 신호 펩타이드는 완성형 도메인의 끝에 위치하여 해당 펩타이드의 분류 및 표적화에 중요한 역할을 한다. Sec 경로를 통해 분비되는 단백질은 크게 3단계의 과정을 거친다 (그림 1c). 첫 번째로, 해당 단백질이 Sec 수송 단백질에 의해 분류되고 표적화된다. 두 번째로, 해당 단백질이 세포막 안으로 결합되거나 세포막 바깥으로 이동하고, 마지막으로, 신호 펩타이드가 잘리고 분비되어 완성형의 형태를 가지도록 3차원 구조를 형성한다.

분비될 단백질은 번역됨과 동시에 세포막으로 이동하거나, 번역이 끝나고 나서 만들어진 전단백질이 세포막으로 이동하는데, 이때 신호 인식 입자(SRP) 및 이에 대한 막 수용체인 FtsY가 해당 역할을 수행한다 (그림 1c). SecA나 샤페론 SecB와 같은 분비 관련 요인들이나 촉발 요인과 같은 보편적인 샤페론은 분비될 단백질의 번역 후 표적화에 관련된다. SecA의 경우 최근 리보솜에 결합된 형태도 보고된 바가 있어, 리보솜 결합과 관련된 인자의 중요성에 대한 연구도 진행되고 있다. 이후, 전단백질이 세포막을 통과하기 위한 에너지는, 번역과 동시에 진행되는 경우 리보솜으로부터, 번역이 진행된 후의 경우에는 대사 과정에서 생기는 양성자 원동력(proton motif force; PMF)으로부터 얻는다. SecYEG 또는 이와 협력하는 삽입효소 YidC는 단백질이 세포막에 삽입될 수 있도록 돕는 역할을 한다. 마지막으로, 신호 펩타이드가 완성형 도메인으로부터 잘려 나가 분비 과정이 완성된다 (그림 1c).

Sec 경로의 복잡성 때문에, 관련 세부 사항에 대한 많은 의문점을 해결하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다; 관련 없는 수많은 단백질 중에서 분비 단백질만을 어떻게 선택적으로 분류하고 세포막으로 이동시키는가? 어떤 검증 기작을 통해서 분비를 목적으로 하지 않는 단백질이 분비되는 것을 막는가? Sec 수송 단백질은 어떻게 활성화되고 분비 단백질을 통과시킬지 아니면 막에 결합시킬지 선택하는가? 그리고 SecA는 어떻게 연속적으로 이동을 촉진하는가?

최근 연구를 통해, Sec 경로 관련 단백질의 분비 과정에 대한 기계론적 통찰력이 제공되었으며, 이러한 의문 중 일부가 밝혀졌다. 기술 발전으로 인해 전단백질과 결합 파트너 사이의 분자 간 상호작용이 밝혀졌고, 리보솜 초기 사슬(RNC)-SRP-FtsY 복합체의 구조 및 동역학 연구를 통해 번역과 동시에 일어나는 선택적 표적화가 어떻게 일어나는지 파악하였다.

게다가, RNC, SecA, 전단백질과 복합체를 이룬 SecYEG 구조 및 전단백질과 복합체를 이룬 SecA의 구조에 대한 계산적, 생화학적, 생물리학적 연구를 통해, 단백질의 분비를 관장하는 수송 단백질의 역학에 대한 이해도를 높일 수 있었다. 해당 연구들은 SecYEG의 구조 및 상호작용 파트너에 의해 조절되는 기능에 대한 모델을 제시하기도 했다. 또한, SecA의 경우, 번역 후 이동 과정에 있어 4차 구조 역학을 사용하여 고유한 역할을 수행한다는 것도 파악되었다.

해당 리뷰에서는 Sec 경로의 연속 단계에 대해서 현재까지 알려진 사항을 설명할 것이다. 번역 도중 및 번역 후에 일어나는 분류 및 표적화, 이동 및 분비에 대해서 전반적으로 다룰 것이며, 그 중에서도 본 저자는 SecYEG의 구조 및 역학과 리보솜과 SecA에 의한 SecYEG의 조절을 중점적으로 다룰 것이다. 또한, 번역과 동시에 작용하는 막 결합 과정과 SecA에 의해 일어나는 번역 후 이동 과정의 기작 및 열역학에 대한 현재까지의 모델들을 소개할 것이다. 본 리뷰에서는 YidC에 의한 독립적인 세포막 결합 과정은 다루지 않는다. 해당 리뷰에서 논의된 대부분의 결과는 가장 흔하게 쓰이는 대장균을 기준으로 연구된 것이다. 하지만, 유전체 서열 기반 분석 및 생화학적 데이터를 통해 분석한 결과, Sec 경로의 대부분이 다른 박테리아에서도 보편적으로 사용될 것으로 예상되기 때문에, 대장균에 국한된 리뷰는 아닐 것이다. 적절한 경우 일부 박테리아에만 존재하는 고유한 기능에 대해서도 설명할 것이다.

2. 전단백질의 분류 및 표적화

신호 펩타이드와 완성형 도메인이 리보솜에서 번역될 때, 이들은 별개의 단백질 인자에 의해 인식된다 (그림 1c). 신호 펩타이드 및 완성형 도메인의 이러한 동적 상호작용 및 고유한 구조적 특징은 세포질 내에서의 분류를 용이하게 하고, 단백질 접힘 과정의 범위 및 분비를 위한 표적화 경로에 중요한 역할을 한다.

번역과 동시에 일어나는 표적화 과정의 경우, RNC를 SecYEG 혹은 YicD로 이동시키는 역할을 하는 SRP가 리보솜 출구 터널에서 소수성 신호 펩타이드 혹은 N-말단의 막 횡단 나선(transmembrane helices; TMH)를 인식한다 (그림 1c). SRP는 막 수용체인 FtsY와 작용하고, 지질 및 SecYEG와 상호작용하여 SecY 채널의 입구로 초기 사슬이 삽입되게 한다.

번역 이후 일어나는 표적화의 경우, 촉발 요인이나 SecA와 같이 리보솜에 결합되는 샤페론 등이 새롭게 만들어진 분비될 전단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 세포질에 떠다니는, 홀다아제 활성을 가진 샤페론(e.g., secB)이 전단백질에 결합하여 해당 단백질이 접히지 않고도 가용성을 유지할 수 있게 하는 것으로 예상된다. 하지만, 촉발 인자나 SecB와 같은 인자는 필수적이지 않으며 이러한 인자가 Sec 경로를 통한 단백질 분비 과정에 어느 정도 관여하는지는 아직 정확히 규명되지 않았다. 더욱이, 샤페론이 없을 때도, 신호 펩타이드가 전단백질의 접힘을 지연시키고, 이를 통해 분비가 가능함을 확인한 바가 있다. 샤페론에 대한 결합 여부와 상관없이 접히지 않은 전단백질은 후속적으로 SecA와 결합된 SecYEG로 전달된다 (그림 1c).

2.1. 신호 펩타이드

대부분의 신호 펩타이드는 비슷한 물리화학적 특성을 공유하지만, 서열은 서로 다를 수 있다 (그림 1d). 신호 펩타이드의 소수성 나선 H 영역은 리보솜 출구 터널에서부터 이미 소수성 및 정전기적 상호작용을 통해 SecA, SRP 또는 촉발 인자와 결합할 수 있다 (그림 1d). 신호 펩타이드의 소수성이 증가하면, 해당 단백질은 SRP와의 결합력이 강해지고, 번역과 동시에 수행되는 기작으로 분비될 가능성이 더 높아진다. 신호 펩타이드의 경우 사용 비율이 적은 코돈으로 구성되어 있는 경우가 많은데, 이로 인해서 번역 및 접힘 과정이 지연되고, 리보솜에 비해 세포 내 함량이 낮은 SRP와의 결합에 대한 효율성이 크게 증가하는 것으로 알려져 있다. 더불어, 번역 연장의 일시 정지, 초기 전단백질에 대한 결합 강화, 그리고 잘못된 접힘을 방지하는 기작은 일반적으로 막으로의 표적화에 기여할 수 있다.

소수성이 낮은 신호 펩타이드를 포함하는 전단백질의 경우에는 SRP 대신 리보솜에 결합되어 있는 촉발 인자 혹은 SecA에 결합하여 분비 과정이 수행된다 (그림 1d). 그러나 이러한 과정은 소수성 임계값에 의해 명확히 나눠지지 않으며, 리보솜 상호 작용 인자들의 농도에 큰 영향을 받는다. 신호 펩타이드 및 TMH가 없는 경우에도 SRP에 의한 표적화 및 이동이 이루어지는 경우가 보고된 바가 있으며, 더 나아가 알려지지 않은 방식으로 SRP와 결합하지 않고서도 SecA에 의해 분비가 되는 경우도 확인이 되었다.

2.2. 완성형 도메인

리보솜 출구 터널은 좁은 친수성 터널로, 리보솜으로부터의 방출 후 바로 접힘이 발생하지 않게 하고, 막 결합 혹은 막 횡단 초기 사슬에 적합한 접힘을 시작할 수 있도록 하는 역할을 한다. 번역과 동시에 SRP에 의해 분비 조절되는 단백질의 경우, 리보솜 출구 터널은 해당 전단백질이 물에 노출되지 않도록 보호하며, 조기 접힘 또는 응집을 방지하는 역할을 수행한다.

대조적으로, 번역 후에 분비되는 단백질의 경우, 리보솜에서 세포막으로 이동하는 동안, 해당 단백질이 접히지 않고도 이동에 적절한 상태를 유지할 수 있도록 하는 것이 가장 중요하다. 이 상태의 유지에는 세 가지 주요 요소가 관련되어 있다. 1) 신호 펩타이드는 접힘이 굉장히 빠르게 진행되는 단백질(e.g. 말토오스 결합 단백질(MBP))의 완성형 도메인이 접히는 것을 방해하며 지연시킨다. 2) 리보솜으로부터 방출된 완성형 도메인에 촉발 인자, SecA, 특수 샤페론, 또는 하우스 키핑 샤페론이 결합하여 복합체를 이루고, 이것이 접히지 않은 전단백질을 안정화할 수 있다. 3) 완성형 도메인의 일부 구조적 특성(e.g. 이황화 결합)은 주변 세포질의 산화 환경에서만 획득되기 때문에, 환원 환경에서는 해당 단백질의 접힘이 방지될 수 있다.

일부 접히지 않은 완성형 도메인은 신호 펩타이드 또는 샤페론이 없더라도 분류, 표적화가 가능함이 확인된 바가 있다. 이때, SecA가 높은 친화도로 결합되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 접히지 않은 완성형 도메인은 그 자체로도 샤페론 및 SecA에 의한 선택적 표적화 과정에 필요한 신호를 가지고 있을 것으로 예상된다.

2.3. 신호 인식 입자(SRP)

박테리아 SRP는 Ffh (SRP54 동족체) 및 헤어핀 구조를 가지는 4.5S RNA로 구성된다 (그림 2a, 아래)

(그림 2~5는 단백질 구조 그림이 대부분이기 때문에 다음 리뷰 원문의 Figure 링크로 대신한다.
그림 2: https://www.nature.com/articles/nrmicro.2016.161/figures/2;
그림 3: https://www.nature.com/articles/nrmicro.2016.161/figures/3;
그림 4: https://www.nature.com/articles/nrmicro.2016.161/figures/4;
그림 5: https://www.nature.com/articles/nrmicro.2016.161/figures/5)

Ffh에는 나선형 N-말단, GTPase, 메티오닌이 많이 포함되어 있는 도메인이 포함되어 있으며, 진핵생물 유래의 동족체와 거의 동일하지만, 번역을 정지시키는 역할은 하지 않는 것으로 알려져 있다. Ffh의 N-말단 및 GTPase 도메인은 비어 있거나 번역 중인 리보솜의 L23 및 L29 단백질과 결합하며, 메티오닌 함량이 높은 도메인은 신호 펩타이드 인식을 위해서 리보솜의 출구 터널 주위에 결합한다 (그림 2a, 중간). 이러한 고친화성 복합체는 신호 펩타이드 혹은 TMH를 가지는 적절한 소수성을 가지는 새로운 기질(분비될 전단백질)에 의해서만 동역학적으로 안정화되는데, 이로 인해서 SRP가 리보솜 출구로부터 기질을 빠르게 인식하여 결합하는 것이 가능해진다. 기질 특이성은 FtsY를 활용하여 추가로 조절된다. Ffh와 비슷하게 FtsY에도 나선형 N-말단 및 GTPase 도메인이 있으며, 대장균 유래의 FtsY의 경우 N-말단에 추가로 산성을 띄는 도메인이 위치해 있다. SRP가 선호하는 TMH 또는 신호 펩타이드를 가지는 기질과 결합할 때, 안정적인 RNC-SRP-FtsY 중간체가 형성되고, 이 복합체가 세포막으로의 이동을 촉진한다 (그림 2a, 위). Ffh와 FtsY는 N-말단 및 GTPase 도메인을 통해 상호작용을 하며, 이러한 결합은 4.5S RNA에 의해 매개되고, GTP 가수분해에 의해 조절된다. 적절하지 않은 전단백질이 비특이적으로 SRP와 결합한 경우, 해당 복합체의 안정성이 떨어지고, 결과적으로 빠른 GTP 가수분해로 인해 세포질에서 일찍 해리되어, 세포막까지 정상적으로 이동되지 않을 수 있다. 반대로, 안정적인 RNC-SRP-FtsY 복합체는 막 횡단 단백질로 정확하게 기질을 이동시킬 수 있다. FtsY에 의한 지질의 결합은 알로스테릭하게 리보솜과 SRP의 친화력을 약화시킨다. SecYEG는 GTP 가수분해를 유발하고, SRP를 해당 리보솜에서 떨어뜨려, 다른 리보솜 출구 터널의 스캔에 재활용될 수 있도록 한다.

2.4. 촉발 인자

촉발 인자는 박테리아에서 아주 흔하게 발현되는, 하지만 단백질의 분비와 생존에는 필수적이지 않은 샤페론이다 (그림 2b, 아래). 세포질 아포단백질(apoprotein)은 대부분 이량체이지만 이 촉발인자는 리보솜에 단량체 형태로 결합한다. N-말단 도메인이 리보솜의 L23에 결합함에 따라 유발 인자 단백질의 대부분이 리보솜의 출구 터널 방향으로 노출되고, 이는 분비될 전단백질과의 소수성/극성 상호작용을 수월하게 한다 (그림 2b, 중간). 촉발 인자와 결합하는 일부 세포질 단백질은 DnaK-DnaJ, 그리고 GroEL-GroES와 같은 단백질 접힘 기작으로 안내된다 (그림 1a, 단계 1). 촉발 인자의 높은 세포 내 농도, 그리고 리보솜에 대한 높은 친화력 때문에, 촉발 인자는 SecA 이량체에 비해 리보솜에 더 많이 결합해 있다. 하지만, SRP보다는 친화력이 낮아, 촉발 인자와 SRP가 동시에 리보솜에 결합해 있는 경우가 많은데, 이를 통해 SRP와 촉발 인자가 초기 전단백질 사슬을 동시에 스크리닝할 수 있다. 분비될 전단백질의 특정 신호(일반적으로 양전하를 띈 잔기 사이의 확장된 소수성 잔기를 포함하는 단백질 서열)에 대한 촉발 인자의 결합은 RNC-SRP 상호작용과 RNC-SRP-FtsY에 의한 세포막 표적화를 약화시킨다. 따라서, 번역 후 분비 기작으로 분비되는 단백질이나 세포질 단백질과 같은, SRP 경로 분비 기작에 대한 부적절한 기질들은 촉발 인자에 의해 번역과 동시에 일어나는 분비 기작에서 제거된다. 촉발 인자는 신호 펩타이드 및 완성형 도메인을 둘 다 인식하며, 일반적으로 100개 이상의 아미노산으로 구성된 초기 펩타이드 사슬에 결합한다. 이때 결합은 촉발 인자의 프롤릴 이성화 효소 도메인, N-말단, C-말단 도메인에서 일어난다 (그림 2b, 위). 번역 연장 중의 지속적인 결합으로 인해, 하나의 초기 전단백질 사슬에 여러 개의 촉발 인자 샤페론이 결합할 수도 있다. 응집 경향이 있는 단백질 서열에 대한 촉발 인자의 결합은 단백질이 가용성으로 존재하도록 하여 이동에 적합할 수 있도록 유지함으로써 전단백질의 분류 및 표적화에 기여할 수 있다. 하지만, 촉발 인자가 초기 전단백질 사슬을 어떻게 SecB 또는 SecA에 전달하는지는 알려진 바가 없다.

2.5. SecB

SecB는 이량체의 이량체로 구성되는 필수적이지 않은 홀다아제이며, 활성에 ATP를 필요로 하지 않는다 (그림 2c, 아래). 프로테오박테리아에 국한되지만, SecB와 유사한 유전자 서열이 분류학적으로 다른 그룹에서도 발견된다. 대장균에서 분비되는 단백질의 4% 정도만 SecB를 활용하지만, SecB는 분비 관련 샤페론의 전형적인 예시이다.

SecB는 초기 전단백질 사슬의 전체 혹은 일부에 주로 소수성 결합을 형성하여 전단백질 표면의 넓은 부분을 뒤덮는다. NMR을 통한 SecB-전단백질 결합 구조에 대한 분석 결과, SecB는 소수성 표면이 조금 더 확장될 수 있도록 구조를 약간 변형하고, 이를 통해서 더 긴 전단백질을 수용할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 전단백질에 대한 SecB의 결합력은 굉장히 높지만, 전단백질 대신에 촉발 인자와도 결합할 수 있다는 기질 특이성 측면에서의 특징이 있다. SecB는 3차 구조는 없지만 2차 구조는 가지는 전단백질과 결합하여 해당 단백질의 응집을 지연시키거나 방지하는 역할을 한다. SecB에 의한 접힘의 방지 또는 지연은 아마도 전단백질과 SecB 사이의 결합 속도와 전단백질의 내재적인 접힘 및 SecB-전단백질 복합체의 안정성에 의해 결정될 것이다.

전단백질은 SecB와 SecA 사이의 결합력을 향상시키고, 이로 인해 SecB는 전단백질을 SecA와 결합되어 있는 SecYEG로 전달한다 (그림 1c). SecA2-SecB4 복합체는 여러 부분에서 상호작용을 형성한다; SecB의 β-시트 구조는 SecA의 아연 함유 C-말단과, SecB의 C-말단은 SecA의 N-말단과 결합한다 (그림 2c, 위). 이러한 비대칭적인 상호작용으로 인해 전단백질이 SecA 쪽으로 옮겨가는 것으로 생각된다. 전자 현미경을 통한 분석으로 SecA와 SecB의 결합 방향이 어느 정도 예측은 되었지만 높은 해상도의 구조는 아직 밝혀진 바가 없다.

2.6. SecA

트랜스로카아제 모터 SecA는 박테리아에서 필수적이며 대부분의 박테리아에서 발견된다. SecA의 DNA 결합 도메인(NBD 혹은 NBD1) 및 ATPase2 (NBD2)가 염기서열 가닥을 샌드위치처럼 감싸서 헬리케이즈 모터를 형성한다 (그림 2d, 아래). 전단백질 결합 도메인(PBD)의 손잡이처럼 생긴 구조가 NBD에 결합되고, 이것이 전단백질의 인식에 기여한다. NBD2에 결합된 C-말단 도메인은 SecA를 SecY에 결합시키는 역할을 한다. C-말단 도메인 영역에는 모든 SecA 도메인을 물리적으로 상호 연결하는 나선형 비계 도메인(HSD), NBD2, 나선형 날개 도메인(HWD), 마지막으로 접혀서 손잡이 구조를 형성하는 C-말단 꼬리가 포함된다.

SecA는 세포질에 떠다니거나 SecYEG에 결합된 상태로 존재하며 모두 전단백질에 결합할 수 있다. 세포질에 떠다니는 SecA는 이량체로 존재하며, 리보솜 L23 단백질에 단량체 (그림 2d, 중간), 또는 연장된 이량체 형태로 결합한다. 극저온 전자 현미경(cryo-EM)를 통한 분석 결과, 단량체 SecA가 전단백질 초기 사슬 및 촉발 요인과 함께 동시에 결합하며, SRP와는 상호작용이 없을 것으로 예측되었다. SecA는 해당 단백질에 존재하는 두 개의 별개 면을 통해서 신호 펩타이드와 완성형 도메인에 결합한다. 해당 부분은 작은 홈을 이루며, 소수성 파트는 길이가 서로 다른 신호 펩타이드의 H 영역을 수용하고, 산성 잔기를 통해서 양전하를 띈 N-말단 영역을 정전기적으로 붙잡는다. 이때 C-말단 꼬리는 앞서 언급한 홈을 일부 덮어주는 역할을 한다. SecA가 어떻게 서열, 크기, 전하, 구조 또는 소수성이 서로 다른 500개 이상의 완성형 도메인을 인식하는지, 어떤 부분이 이를 수행하는지는 아직 명확히 밝혀지지 않았다. PBD 및 PBD-NBD2로 구성된 클램프가 해당 역할을 수행할 것으로 예상되고 있다 (그림 2d, 위).

전단백질의 신호 펩타이드는 굉장히 비슷한 생물물리학적 특성을 지니고 있는데, 이러한 특성으로 인해 전단백질이 선택적으로 SecA의 동일한 홈에 결합된다. SecA의 홈의 입구에 있는 산성 잔기로 인해 Sec 경로를 경유하지 않고 배출되는 단백질이나 세포질 단백질과 SecA 사이의 비특이적 소수성 상호작용이 방지된다. 완성형 도메인은 SecA와 이보다는 덜 특이적인 결합을 하며, 신호 펩타이드, 완성형 도메인, 그리고 SecA로 이루어진 복합체를 안정화시키는 역할을 하는 것으로 예상된다. SecA의 C-말단 꼬리가 없을 때 SecA와 신호 펩타이드의 결합 친화도가 향상되는 것으로 미루어 보아, 이 C-말단 꼬리가 신호 펩타이드 결합 홈에서 비특이적인 기질과 결합하는 것을 차단하고 억제하는 것으로 보인다. 일부 신호 펩타이드는 그 자체만으로도 C-말단 꼬리를 떼어내고 홈에 결합할 수 있지만, 다른 신호 펩타이드는 더 높은 결합력을 위해서 SecB를 필요로 하기도 한다. 이때 SecB는 C-말단 꼬리에 결합하여 SeCA의 신호 펩타이드 결합 홈에서 C-말단 꼬리를 떼어내서 신호 펩타이드가 결합하기 쉽도록 한다. 따라서, SecA의 C-말단 꼬리는 기질 검증 메커니즘에 중요한 역할을 하는 것으로 보여진다.

3. SecYEG의 구조 및 역학

동시 번역 및 번역 후에 일어나는 표적화 과정은 둘 다 SecYEG로 수렴된다. SecYEG는 수직 방향과 측면 방향이 동시에 열리는 고유한 채널이다. 또한, SecYEG의 구조는 리보솜, SecA, 그리고 전단백질에 의해 조절된다.

3.1. SecYEG 채널의 구조

SecY는 원형질막을 가로질러 채널 기공을 형성하는 10개의 TMH로 구성된다 (그림 3a). 채널 중앙 기공 주위에 TMH가 둘러싸이며 위치하게 되는데, 6개의 부피가 큰 소수성 잔기가 기공 고리를 수축시키는 역할을 한다고 알려져 있다 (그림 3a, 청록색 구체). 휴지 상태에서 SecY는 특징적인 모래시계 모양을 이루며, 잔기에 의해 형성되는 주변 세포질(periplasm) 방향의 굴뚝 모양 채널은 나선형 플러그로 밀봉된다 (그림 3a, 왼쪽). 이때 고리와 플러그로 인해 해당 채널이 열리고 닫히는 형태로 바뀌게 된다. 반대쪽 세포질 방향의 굴뚝 모양 채널과 평행하게 TMH2, 3, 7, 그리고 8이 느슨하게 접합되어 세포막 지질 방향으로의 측면 출입구를 형성한다 (그림 3a, 아래). SecE는 측면 출입구와 정반대인 외부에서 SecY와 결합하여 SecY의 형태를 안정화하는 역할을 한다. SecG는 필수적이지 않고 균주 전체적으로 잘 보존되어 있지 않은 요소인데, SecG는 SecY의 TMH3과 TMH4와 긴밀한 소수성 상호작용을 하여 세포질 방향의 굴뚝 모양 채널을 밀봉하는 역할을 한다 (그림 3a).

휴지가 아닌 상태에서의 SecYEG의 기능적 구조는 파악하기 어려운 상태로 남아있다. 계면 활성제로 용해된 복합체에 대한 구조분석 결과, 단량체부터 마주 보고 결합된 이량체, 그리고 거꾸로 보며 결합된 이량체까지 다양한 구조를 가진다고 밝혀졌다. 이런 두 가지 결합은 모두 생체 내에서도 관찰되었다. 이 중 거꾸로 보며 결합된 구조에 대한 모델은 측면 출입구를 통한 막 단백질의 분비에 대해 잘 설명할 수 있는 모델이다.

이량체를 이루지 않은 SecYEG 단일 복합체만으로도 SecA 결합, 전단백질 결합 및 이동에 충분하다고 알려져 있다. 또한 삽입된 신호 펩타이드는 SecYEG 이량체의 두 측면 출입구 중 하나에만 국한되어 상호작용을 한다고 알려져 있다. 더불어, 이량체가 단백질 이동의 효율성을 향상시킬 수 있다는 사실도 알려져 있다. SecYEG 복합체의 결합은 아마도 SecA의 결합을 통해 트랜스로카아제를 간접적으로 안정화하거나 활성화를 촉진할 수 있는 것으로 생각된다.

3.2. 리보솜과 SecA에 의한 SecYEG 구조 조절

SecYEG의 기공이 폐쇄된 기저 상태에서 개방 상태로 전환되어야 원형질막 단백질 및 분비될 전단백질의 이동이 가능하다. 분자 역학 시뮬레이션을 통해서 분석된 결과에 따르면, 외부 다른 인자의 상호 작용 없이 SecYEG의 상태가 전환되기 위해서는 20 kcal/mol의 자유에너지가 필요하다고 한다. 리보솜과 SecA는 모두 SecY의 굉장히 역동적인 세포질 돌출부와 상호작용을 하는데, 이러한 알로스테릭한 상호작용을 통해 SecYEG의 형태 변화를 유도하고, 개방 상태의 안정화를 수행한다.

리보솜은 SecYEG에 강하게 결합하지만, 채널 구조에는 제한적으로 영향을 미친다. 리보솜은 SecY의 루프 6-7 및 루프 8-9 근처에 고정되며, 주로 리보솜 단백질 출구를 따라서 늘어선 L23 및 L29 단백질과 함께 긴 통로를 형성한다 (그림 3b). 동시에, 루프 6-7 및 루프 8-9는 채널을 향해 안쪽으로 이동하는데, 이로 인해 측면 출입구는 TMH2 및 TMH3의 바깥쪽으로 약간 열린다 (그림 3d). 이러한 구조 변화로 인해, 측면 출입구 주변의 닫힌 상태를 안정화하는 수소 결합 네트워크(TMH2, 3, 7 사이 극성 클러스터)가 방해된다 (그림 3b). 결과적으로 이렇게 약간 열린 측면 출입구 주위의 결합력이 약해지면서, 소수성 전단백질의 삽입이 가능해진다.

리보솜은 SecYEG와 일시적으로 상호 작용하는 반면, SecA는 트랜스로카아제 완전 효소의 전용 특수 소단위체이며 함께 알로스테릭하게 결합하여 복합체를 형성한다. SecA는 뛰어난 역동성과 유연성을 가지며, 그것의 도메인들 또한 구조적으로 유연하고, 서로 상대적으로 움직인다. 세포질 SecA는 강력한 상호 작용을 통한 동종 이량체를 형성한다. SecA의 역학은 전단백질, 염기 서열, SecYEG, 지질 및 샤페론에 의해 조절되어 기질 수용체, 채널 조절자, 펌프, ATPase 모터 등의 기능을 수행한다.

SecA가 SecYEG와 결합했을 때의 4차 구조에 대해서는 아직 명확히 밝혀진 바가 없지만, 리간드 결합 또는 완충액 조건으로 인해서 단량체 및 이량체의 평형이 이루어진다고 알려져 있다. 최근 연구를 통해서는 이량체와 단량체 모두가 전단백질의 이동에 밀접한 관련이 있다는 것이 밝혀지기도 했다. SecA는 비대칭적인 이량체로 SecYEG에 결합하고, 이후 단량체화 과정이 일어나기 전에 고유한 활성 도메인을 가지는 4차 구조를 획득하는 것으로 알려졌다. SecYEG2-SecA2 복합체의 구조는 알려진 바가 없지만, 계면활성제 용해를 통해 밝혀진 바에 따르면, SecA가 ATP의 가수분해 이전에 SecYEG 채널에 구조적인 영향을 주는 위치에 결합하여 있다고 한다. 이 상태에서 SecY의 TMH7이 이동하며 측면 출입구가 약간 열린 상태로 유지된다 (그림 3c, e). 동시에, SecY의 C-말단에 위치한 TMH가 바깥쪽으로 회전하여 기공 고리에 약간의 불안정화를 일으킨다. 이에 따라 TMH9도 약간 이동하며, 양친매성 나선인 SecE을 바깥쪽으로 이동시킨다 (그림 3e). 이때, 채널을 막고 있던 플러그도 고리로부터 TMH7으로 옮겨가지만, 여전히 기공을 밀봉한 상태로 존재한다 (그림 3e).

4. 이동 및 분비

4.1. 번역과 동시에 일어나는 막 통합 및 분비

원형질막 단백질은 번역과 동시에 막에 결합되는데, 이는 SecYEG의 측면 출입구를 통해 이동하도록 설계된 20 아미노산 길이의 소수성, 나선형 TMH에 의해 매개된다. 초기 전단백질의 번역 도중 내보내진 TMH는 측면 출입구의 세포질 측면에 있는 소수성 입구에 결합한다 (그림 4a). 이후, 초기 전단백질의 TMH가 SecY의 TMH2와 TMH7 사이의 상호 작용을 대체하고 (그림 4b), 미끄러져 세포막 지질과 수성 기공 사이의 상호 작용을 대체하며 측면 출입구로 삽입된다 (그림 4e). 이렇게 크게 열린 측면 출입구는 소수성이 강한 펩타이드에 의해서만 안정화된다. 이후 친수성 부분은 지질로 진입하지 못하고 막혀서 친수성 기공 내부에 머물며 측면 출입구에 약간의 구조적 변화를 유도한다 (그림 4c).

구조 및 생물정보학 데이터를 통해 TMH 삽입 중에 변화하는 SecYEG 구조에 대해서 연구가 진행되었다. 기공 고리는 유입되는 폴리펩타이드에 반응하여 확장될 수 있고, 이는 플러그의 불안정화 및 측면 출입구의 확장을 초래할 수 있다 (그림 4b, c). 초기 전단백질의 TMH가 삽입하는 동안, SecY의 TMH10와 플러그 사이의 더 긴밀한 상호작용에 의해서 기공 확장이 더 원활하게 일어날 수 있다. 막에 결합되는 초기 전단백질, 막을 통과하여 분비되는 전단백질, 그리고 친수성 초기 전단백질에 대해 SecYEG 채널이 세 가지 형태로 조절된다.

채널 삽입 및 세포막 결합 도중 SecY는 TMH에 양쪽으로 당기는 힘을 가한다. 원형질막 단백질 중 한 방향으로만 결합되어 있는(single-spanning), 강한 나선성 및 소수성을 가지는 단백질은 빠르게 외부로 배출되지만, 여러 가닥이 한꺼번에 여러 방향으로 막에 결합되어 있는 (polytopic) 원형질막 단백질의 삽입은 이보다 더 복잡하다. 이 경우 여러 개의 TMH가 확장된 기공에 일시적으로 위치하게 되며, 인접 TMH는 적당히 소수성을 띄는 선행 TMH의 배출을 돕는다. 이러한 지질로의 삽입 및 원형질로의 배출은 순차적으로 진행될 수도 있으며, 일괄적으로 한꺼번에 진행될 수도 있다.

SecYEG와 YidC가 복합체를 이룰 때, YidC는 일반적으로 측면 출입구에 인접하게 위치하며 막 결합에 도움을 주는 역할을 한다. SecA는 원형질막 단백질의 친수성 루프가 이동해야 할 때마다 번역과 동시에 조건적으로 모집된다. 여기서 세포질 샤페론은 SecYEG와 리보솜으로 구성된 통로를 통해 초기 전단백질을 확률적으로 밀어내는 역할을 하는 것으로 생각되고 있다.

트랜스로카아제를 둘러싸고 있는 인지질 분자는 막 단백질의 삽입 및 접힘에 영향을 줄 수 있다. 그들은 막단백질과 세포질 단백질 도메인의 접힘을 위한 샤페론으로 기능하며, 막단백질의 위상 및 배치를 결정하는 중요한 요소이다.

4.2. 번역 이후 일어나는 막 통합 및 분비

SecA는 번역 이후 일어나는 막 통합 및 분비 방식의 중심 역할을 한다. 해당 과정은 완전히 규명되지는 않았지만, 순차적 단계의 작업 모델로 요약될 수 있다 (그림 5a).

첫 번째 단계에서 SecA는 주로 정전기적 접촉을 통해서 복합체를 이루는데, 복합체 중 하나의 단량체만 확률적으로 (SecYEG)2와 결합하게 되고, 결과적으로 비대칭적으로 구조를 이루게 된다. 이후 SecA에 의해 ATP의 분해가 촉진된다.

다음으로 단일 전단백질이 SecYEG에 결합된 비대칭 SecA2에 높은 친화도로 결합한다. 이때 전단백질의 신호 펩타이드와 완성형 도메인은 SecA의 서로 다른 부분에 결합한다. 또한 (SecYEG)2 중 하나의 기공만 활성화된다.

세 번째 단계에서 신호 펩타이드가 SecA2에 결합하여 SecA2의 구조를 느슨하게 만든다. 이러한 변화는 SecYEG에까지 영향을 주어, 전체 효소 복합체의 활성화 에너지가 감소한다. 이와 같이 기본 Sec 시스템의 모든 후속 단계에서 이 신호 펩타이드의 물리적 존재는 필수적이다.

단백질 분해 효소 저항성 실험을 통해서 ATP의 결합이 SecA2 C-말단 도메인과 채널 사이의 긴밀한 상호 작용에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 동시에, 전단백질의 20-30 잔기 정도의 짧은 부분이 함께 삽입된다.

전단백질은 SecA의 ATPase 활성을 촉진하여 ATP가 가수분해되도록 한다. 다음으로 완성형 도메인은 SecA-SecYEG 복합체에 갇히게 되지만 채널에 깊숙이 삽입되지 않고 SecA를 단량체로 분해한다. 이후, 이량체화 도중 숨겨져 있던 SecA IRA1 스위치가 노출되며 SecY의 채널에 상호작용 한다.

다음으로, 신호 펩타이드는 아직 알려지지 않은 기작에 의해 N-말단이 세포질을 향하고, C-말단이 주변 세포질을 향하여 측면 출입구로 재배치된다. 완성형 도메인은 기공을 따라 펼쳐지고, 그에 따라 플러그가 완전히 분리되어 바깥쪽으로 이동한다 (그림 4f). 확장된 기공 고리는 부분적으로 풀린 전단백질의 주위에 마개와 같은 구조를 형성한다. 측면 출입구로 열림으로 인해 기공 고리가 열리게 되고, 이로 인해서 전단백질과 세포막 지질과의 상호작용이 가능해지며 소수성 신호 펩타이드가 측면 출입구 바깥으로 이동하게 된다. 이렇게 이동하는 폴리펩타이드 루프는 원래 플러그로 막혀 있던 SecY 굴뚝 구조를 채우게 되고, C-말단 신호 펩타이드는 측면 출입구를 막게 된다 (그림 4f). 따라서, 채널 내부의 루프를 이루고 있는 전단백질의 구성과 SecYEG의 모래시계 모양은 세포막 투과성 장벽을 유지하면서 채널을 통한 이동을 용이하게 하는 구성요소이다.

ATP의 결합 및 가수분해는 완성형 도메인의 이동에 필수적인 요소이다. 가수분해 후 SecA에서 방출된 완성형 도메인 부분의 이동은 양성자 원동력에 의해서 촉진되는데, 이때 SecDF 단독으로, 혹은 SecYEG에 결합된 SecDF-YiajC (그림 1c)가 이를 돕는 역할을 수행한다.

SecA의 다양한 역할과 전단백질의 이동 및 분비를 어떻게 수행하는지에 대한 여러 가지 모델이 제시된 바 있다. ‘피스톤 모델’에서, SecA는 단량체로 작동하는 모터로 제안되었다. 접힘이 풀린 완성형 도메인은 PBD 및 IRA2에 의해 형성된 특정 구조를 따라 이동한다 (그림 5b). IRA1의 끝부분이 일시적으로 전단백질 사슬에 걸려 기공을 향해 밀려지고, 결과적으로 ATP 결합 및 가수분해로 인해 전단백질이 방출되게 되는 모델이다. 또 다른 모델은 ‘알로스테릭 채널 조절 모델’ 이다. 해당 모델에서 SecA는 ATP 가수분해를 통해서 SecYEG를 제어한다. 브라운 운동을 하며 자유롭게 움직이는 전단백질은 에너지가 없이는 열린 채널을 통한 수동 확산이 불가능하다. 이때 SecA가 브레이크 역할을 하며 전단백질이 반대로 이동하는 것을 방지하고, 양성자 원동력을 받아 세포 바깥으로 향하게 한다는 모델이다.

대부분의 완성형 도메인이 바깥으로 이동되면, SecA는 접촉 부위를 잃어서 ATPase 활성이 촉진되고, SecA-ADP는 주변의 트랜스로카아제와 일부 연결된다. 마지막으로, SecA-ADP는 SecYEG로부터 분리되며 세포질에서 다시 이량체화를 수행하며 이런 분비 주기를 반복할 수 있다.

4.3. 전단백질의 성숙과 분비

신호 펩티다아제(분비되는 단백질의 경우 SPase I, 세포막 지질에 결합되는 단백질의 경우 SPase II; 그림 5c, 왼쪽)는 SecYEG를 거쳐 완전히, 또는 적어도 80% 이상 바깥으로 이동된 전단백질의 신호 펩타이드 부분을 절단하고 완성형 도메인을 주변 세포질로 방출한다. 세포막에 박혀 있는 SPase I에는 특정 AXA 모티프의 뒤를 절단하는 단백질 분해효소 도메인이 있다. SecYEG 관련하여, 원형질막에 고정되어 있는 주변 세포질 샤페론 PpiD (그림 5c, 중간) 및 SecDF (오른쪽) 또한 분비되는 단백질의 방출에 도움이 되는 것으로 생각되고 있다. 방출 후, 단백질은 세포막 후 분비 시스템으로 향하거나 세포 외피, 세포 외 환경, 또는 표적 세포에서 접힌다.

5. 결론 및 전망

지난 30년 동안 수많은 구조와 별개의 단계에 대한 상세한 생화학적 및 생물물리학적 연구가 지속적으로 이루어져 박테리아 Sec 경로의 기본 기작이 해명되었으며 여러 요인에 의해 미세하게 조절되는 기작 또한 밝혀졌다. 이러한 상당한 진전에도 불구하고, 몇 가지 기작은 아직 규명되지 않은 채로 남아있는데, 그중 몇 가지 예시는 다음과 같다. 분비되는 전단백질이 세포질에서 어떻게 접히거나 응집되지 않고 트랜스로카아제까지 도달하는가? 아직 접히지 않은 분비 단백질과 세포질 단백질은 어떻게 서로 구분이 되는가? 촉매 작용 중의 SecA-SecYEG 구조는 어떻게 바뀌는가? SecA는 완성형 도메인에 어떻게 결합하는가? 등등. 이런 기작의 복잡성과 동적인 특성 때문에, 기작의 확실한 규명을 위해서는 굉장히 민감하고 동적인 접근법이 필요하다. 이를 규명하기 위해서 단일 분자 연구, 다양한 복합체에 대한 고해상도 구조 및 형태 역학 모니터링 등등의 방법이 활용되고 있다. 박테리아에서 단백질 분비의 기작을 이해하는 것은 생물의약품 및 항생제 개발에 큰 도움이 될 것이며, 생리학적 및 질병 상태 동안 고등 유기체에서 일어나는 분비 관련 기작에 대한 통찰력을 제공할 것이다.


 

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우성화(2021). 박테리아 유래 Sec 경로를 통한 단백질의 분비. BRIC View 2021-R37. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3940 (Nov 25, 2021)
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