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천연물 생합성 증대와 다양화를 위한 단백질 공학
천연물 생합성 증대와 다양화를 위한 단백질 공학 저자 김태진 (Altria Group, Inc.)
등록일 2020.12.24
자료번호 BRIC VIEW 2020-R43
조회 663  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
자연으로부터 유래한 단백질들은, 상업용 화학제제에서 의약품에 이르기까지 다양하게 사용되고 있는 천연물(natural products)의 생산을 위한 생촉매(biocatalysts)로써 오랫동안 가장 빈번히 이용되어져 왔다. 단백질 공학(protein engineering)은 이러한 천연물 생합성에 촛점을 둔 대사공학 분야의 발달을 위한 효과적인 도구로써 사용되고 있다. 최근 들어서는 효소 활성의 증가, 효소의 안정성 증대 혹은 생합성 천연물의 다양화 연구 등에 단백질 공학이 유용하게 이용되었다. 본 리뷰는 단백질 공학의 전통적인 연구 기법뿐만 아니라 최신 기술을 정리하고, 앞으로의 발전 방향을 모색해 보았다.
키워드: Protein Engineering, natural product biosynthesis, catalytic activity, stability
분야: Biochemistry, Biotechnology, Molecular_Biology

본 자료는 Protein Engineering for Improving and Diversifying Natural Product Biosynthesis. Trends Biotechnol. 38(7), 729–744 (2020). 의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목 차

1. 서론
2. 단백질 공학을 통한 천연물 생합성 증가
  2.1. Rate-Limiting 효소의 촉매 활성 증가
  2.2. 효소 복합체 형성을 위한 Colocalization
  2.3. 단백질 안정성 증가
  2.4. 전사 조절체(Transcriptional regulators)를 이용한 바이오센서(Biosensor) 개발
3. 단백질 공학을 통한 천연물 생합성 다양화
4. 결론


1. 서론

지난 수십 년 간 의약품이나 미용 산업 혹은 식품 산업에서 천연물이 가지는 높은 부가가치로 인하여, 천연물 생합성을 조절하는 연구가 활발히 진행되어 왔고, 미생물이나 cell-free 시스템을 통한 생합성 연구의 발달이 두드러 졌다. 천연 효소, 모듈화된 유전자 발현(modularized gene expression), 다이나믹 조절(dynamic regulation) 등을 접목한 대사공학을 통해 지방산(fatty acids), 이소프레노이드(isoprenoids), 알칼로이드(alkaloids), 플라보노이드(flavonoids) 같은 천연물이나 천연물 파생물질(derivatives)의 생산이 가능해 졌다.

하지만, 천연물 생합성 과정에는 몇 가지 제약이 따르는데, 천연 효소를 생합성 경로(biosynthetic pathways)에 접목시킬 때 효소의 제한된 활성, 좁은 기질 반응(narrow substrate range), 낮은 안정성 혹은 이종 숙주(heterologous hosts)에서의 기능 손실 등을 예로 들 수 있고, 이들은 생합성 효율 증대나 천연물 다양화를 저해하는 요인으로 작용한다. 이러한 문제를 극복하기 위하여 천연 자원으로부터 기존의 효소를 대체할 수 있는 새로운 효소를 찾아내려는 노력이 이루어 졌으나, 이는 오랜 시간이 걸리고 노동 집약적이라는 단점이 따른다. 그렇기에 단백질 공학 기술을 이용하여 기존의 효소를 변형 및 향상 시키는 쪽으로 연구가 집중되었고, 본 리뷰에서는 이러한 연구의 최신 성공 사례를 정리하고 천연물 생합성 증가와 다양화를 위한 단백질 공학의 중요성을 다뤄보고자 한다.

2. 단백질 공학을 통한 천연물 생합성 증가

2.1. Rate-Limiting 효소의 촉매 활성 증가

천연물 생합성 과정에 있어서 주된 제약 요인 중 하나는 효소의 활성이다. 미생물 숙주로 이종 효소(heterologous enzymes)를 도입하는 과정에서 효소의 촉매 활성이 떨어지거나, 기능이 손실될 가능성이 존재하기 때문에, 효소의 활성을 더욱 증가 시켜 천연물의 생합성 과정을 촉진시키는 것이 단백질 공학의 주된 목적 중 하나이다. 단백질 공학에서 특정 기질에 대한 촉매 활성을 증가시키기 위한 대표적 방법으로는 무작위 돌연변이(random mutagenesis)가 있다. 효모에서 활성을 가지는 타이로신 수산화 효소(tyrosine hydroxylase)의 경우에는, 실수 유발 PCR(error prone PCR) 기법을 이용한 무작위 돌연변이를 통해 촉매 활성이 4.3배 증가되었다. 이 타이로신 수산화 효소(tyrosine hydroxylase)가 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) 카복실기 제거 효소(decarboxylase)와 함께 효모 숙주에서 발현(coexpression)될 경우, 새로운(de novo) 도파민(dopamine)이 합성 가능하다. 비슷한 예로, Saccharomyces cerevisiae로 부터 유래한 아이소펜테닐 이인산 이성질화 효소(isopentenyl diphosphate isomerase, IDI)의 촉매 활성이 PCR을 바탕으로 한 무작위 돌연변이를 통해 2.53배 증가되었고, 이를 라이코펜(Lycopene)에 적용하면 1.24g/L의 생산농도가 발생되는데, 이는 야생형(wild type) 효소를 사용할 경우에 비해 2.1배 높은 것으로 나타났다.

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그림 1. 일반적 단백질 공학 연구 과정.

 

무작위 돌연변이를 이용한 방법은 방대한 효소 단백질 변이체 library의 구축이 동반되고, 이렇게 만들어진 대부분의 변이 효소들은 활성이 감소되거나, 사라지게 되는 것이 일반적이기 때문에, 신속하고 효과적인 선별을 위해 고효율 스크리닝(high-throughput screening)이 필수적이게 된다. 그러므로 구조적 분석을 바탕으로, 효소의 결합 위치(binding sites)나 활성부위(active pockets)를 중심으로 위치 특이적 돌연변이(Site-directed mutagenesis)를 도입하여 효소 활성을 증가시키려는 방법이 더 효율적일 수 있다 (그림 1). 최근에는 빠르게 발달된 컴퓨터를 이용한 분자 시뮬레이션(molecular simulation)기술이 단백질 공학에 많은 기여를 하였는데, 단백질의 결정 구조를 풀거나, 동족체(homolog)를 바탕으로 예측된 구조를 시뮬레이션하여 야생형 효소로부터 효과적인 아미노산 치환 대상을 찾는 것이 가능해 졌다. Glyco-syltransferase UGT51의 경우, 구조적 분석을 바탕으로 한 합리적 설계(rational design)를 통하여, 효모 내에서 1800배 이상의 촉매 효율로 인삼에서 유래한 대표적 항암 물질인 진세노사이드 Rh2 (ginsenoside Rh2)의 생산이 가능했다. 뿐만 아니라, Rh2의 분해 경로를 차단하고 전구체인 UDP-glucose의 공급을 늘림으로써 생산 농도가 추가적으로 900배 이상 증가하여 최종적으로는 300 mg/L에 이르렀다. 택솔(taxol)의 중요 전구체 중 하나인 taxadien-5α-ol을 합성하는 taxadiene synthase의 경우, 컴퓨터 시뮬레이션을 활용한 위치 특이적 돌연변이를 통해 생산성이 2.4배 증가하였다. 비슷한 예로 Valliere와 그의 연구팀이 컴퓨터 모델링(computational modeling)을 통해 새롭게 디자인한 NphB 효소 변이체 olivetol acid 중, M23와 M31은 cannabigerolic acid (CBGA) 생산에 있어 효소의 Kcat 값을 1000배 가량 증가시키는 것으로 나타났다. M23는 흐름 제어(flow control)를 도입한 cell-free 시스템을 통해 olivetol acid (OA)와 glucose로 부터 CBGA를 최종적으로는 1.25 g/L의 농도로 합성이 가능했다. 또한, 기질 OA를 divarinic acid (DA)로 치환할 경우, 다양한 희소 cannabinoids의 전구체로 사용되는 cannabidivarinic acid (CBGVA)의 생산도 가능했다. M31은 M23에 비해 촉매 효율이 15배 이상 높기 때문에, M23 대신 M31을 사용하였을 경우, 1.74 g/L의 농도로 CBGVA가 합성 가능했지만, 생산량 증대(scaling up)가 용이하지 않은 cell-free 시스템의 특성상 추가적인 산업계 활용은 제한적이었다.

앞서 살펴 보았듯이, 생합성 경로에서 활성이 증가된 단백질 변이체의 도입은 천연물 생산을 비약적으로 증가시키고 획기적인 생합성 및 생물 약제학적 응용을 가능하게 한다. 단백질 공학을 이용하여 효소 활성을 증가시키는 연구는 그 동안 잘 발달되어 왔으나, 고효율 스크리닝이나 생물 정보학(computational biology) 같은 최근의 혁신적 기술이나 구조 생물학(structural biology), 생화학(biochemistry) 분야의 새로운 지식들의 활용이 필요한 것도 사실이다. 예를 들어, 결정 구조를 얻기가 까다로운 단백질 복합체(complex proteins)나 막 단백질(membrane proteins)에 대한 정보는 새로운 반응 기작(reaction mechanisms)을 찾는다거나, 단백질 공학 분야에 중요한 통찰력을 제공할 수 있다. 단백질 결정 구조나 컴퓨터를 활용한 분자 시뮬레이션은 효소의 특성 조절 연구를 위한 정밀한 아미노산 서열정보를 제공하는 데 필수적이 되었고, 더 많은 단백질의 구조 해석과 시뮬레이션 최적화는 단백질 공학을 위한 더욱 정확한 예측을 가능하게 할 것이다.


표 1. 천연물 생합성 증가와 다양화를 위해 단백질 공학을 접목한 사례.
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2.2. 효소 복합체 형성을 위한 Colocalization

다수의 효소를 이용하여 대사경로를 구축하고자 할 때, 특정 효소에 의해 전체 대사 경로의 전환 효율이 제약을 받게 되는 플럭스 불균형(flux imbalance)가 종종 일어나게 된다. 이러한 병목 현상(bottlenecks)은 중간 물질(intermediate)의 축적을 가져오고, 이는 전체 전환 효율을 낮출 뿐만 아니라, 숙주에게 독성 효과를 가져올 수 있다. 전체적인 합성 효율을 증가시키기 위한 방법으로, 개별 효소의 내재적 특성에 집중하여 좀 더 효율적인 변이체를 찾는 방법과 더불어, 인공효소 복합체(artificial enzyme complexes)의 공간적 배치를 디자인하는 방법이 효과적인 것으로 밝혀졌다. 어떤 경우에는 효소 간의 공간적 거리가 중요하게 여겨지게 되는데, S. cerevisiae에서 모르핀(morphine) 생합성 경로를 최적화하기 위해 codeinone 환원 효소(reductase) 효모 숙주의 조직에 결합시키도 하였다. 이는 codeinone 환원 효소를 그 이전 단계의 효소 반응과 분리시킴으로써 neopinone으로부터 codeinone으로의 자발적 반응(spontaneous reaction)을 촉진시키는 결과를 가져왔다. 하지만, 실제로는 효소 복합체를 만들어 내는 연구가 더 많이 이루어졌는데, 이러한 복합체가 기질 확산(substrate diffusion)을 줄이고, 중간 물질의 독성을 최소화하며, 경쟁하는 합성 경로(competing pathways)를 제거하지 않고도 탄소 flux를 늘릴 수 있기 때문이다. 한 가지 예로, diterpene 생산을 늘리기 위해 효모의 farnesyl diphosphate 합성효소(Erg20p)와 geranylgeranyl diphosphate (GGPP) 합성효소(Bts1p)를 결합한 퓨전 효소(fusion enzyme)를 만드는 것이 일반적인데, 이는 geranylgeraniol, sclareol, cis-abienol 혹은 abietadiene 같은 diterpene 계통의 합성물을 만드는데 기질로 이용되는 dimethylallyl diphosphate (DMAPP)과 isopentenyl diphosphate (IPP)의 사용을 비약적으로 증가시키는 것으로 알려졌다. Erg20p-Bts1p 퓨전 효소와 alabdadienyl/ copalyl diphosphate 합성효소(SmCPS)와 akaurene 합성효소(SmKSL)를 결합한 SmCPS-SmKSL 퓨전 효소의 경우에는, 기질인 GGPP의 사용 효율을 높혀 15L 생물 반응 장치(bioreactor)에서 365 mg/L의 수율로 diterpenoid miltiradiene를 생산하는 것으로 밝혀졌다. 다른 예로, 3,3-β-carotene 수산화효소(CrtZ)와 4,4-β-carotene 산소화효소(CrtW)를 결합한 퓨전 효소는 Escherichia coli 숙주에서 astaxanthin의 생산이 610.4 µg/g DCW(dry cell weight)로 기존보다 1.4배 증가한 것으로 보고되었다. 최근에는 β-carotene 합성 경로를 모두 포함하는 3개(CrtB, CrtI, CrtY)의 도메인(domain)을 가진 퓨전 효소가 S. cerevisiae 숙주에서 퓨전 이전의 원래 형태보다 전구체의 축적을 줄이고 β-carotene의 생산을 두 배(2.5 mg/g DCW) 늘리는 것으로 알려졌다. 퓨전 효소는 기존의 효소와 퓨전된 그의 파트너 효소(partner enzyme)간의 생화학적 반응을 증가시키기도 하는데, 산화환원 파트너가 필수적인 싸이토크롬 P450 효소의 경우가 대표적이다. 이러한 연구는 여러 효소들을 동시에 연결하여 만든 퓨전 효소가 천연 생합성 시스템의 효율성을 증가시킬 수 있는 가능성을 보여주었다.

합성 효소 복합체의 형성은 퓨전 효소들의 순차적인 배열뿐 아니라, 중간 물질의 제한적인 확산이나, 부분적 고립문제가 일으키는 독성 효과를 감소시키는 장점도 있다. 한 가지 방법으로, 연속적인 촉매 작용을 일으키는 효소들을 물리적으로 가까운 곳에 위치시키는 것이다. 이러한 합성 효소의 scaffold 구조를 만들기 위해서는 자연계에 존재하는 단백질 결합 도메인들이 단서를 제공할 수 있다. 예를 들어, E. coli 숙주에서 합성 경로의 효소들을 개별적으로 leucine-zipper 펩타이드에 결합시키고 이를 다 함께 cellulose 결합 도메인(CBD) 복합체에 접목시키는 방법이 있다. 자발적으로 구조를 형성하는(self-assembly) 효소를 메탄올에서 fructose-6-phosphate (F6P)로 변환시키기 위한 decameric 메탄올 탈수소효소(Mdh)를 기반으로 디자인한 경우도 있다. 연속적인 반응을 일으키는 효소인 3-hexulose-6-phosphate 합성효소(Hps)와 6-phospho-3-hexuloseisomerase (Phi)를 Mdh에 Src 상동 3 도메인(SH3)을 연결체로 이용해 퓨전시킨 경우, 메탄올 소비와 F6P의 생산을 크게 증가시켰다. 복수 결합 도메인(multiple binding domains)들은 좀 더 복잡한 효과를 가져오기 위한 연구 대상이 된다. SH3뿐 아니라 PSD95/DlgA/Zo-1 (PDZ)과 GTPase binding domain (GBD) 역시 연결체로 사용이 되었는데, 이 방법은 고발현(high expression)된 acetoacetyl-CoA thiolase (AtoB)와 hydroxy-methylglutaryl-CoA 합성효소(HMGS) 그리고 저발현(low expression)된 hydroxymethylglutaryl-CoA 환원효소(HMGR)를 포함하는 mevalonate (MVA) 합성 경로에 최초로 시도되었다. SH3를 이용해 다수의 HMGR을 HMGS에 결합시켰을 경우, MVA의 생산이 10배 까지 증가되었고, 6개 이상의 연결체를 사용하였을 때는 감소하는 결과를 가져왔다. AtoB, HMGS와 HMGR을 GBD, SH3 그리고 PDZ에 각각 결합하여 1:2:2의 비율로 구성되었을 때 최종 합성 농도가 77배 까지 폭발적으로 증가하였다. 같은 방법을 사용하여, 1:4:2의 비율로 구성되었을 경우 glucaric acid 생합성이 5배 증가하였고, 1:2:4의 비율로는 S. cerevisiae 숙주에서 resveratrol의 생산이 5배 증가하였다.

합성 핵산(synthetic nucleic acid) 또한 천연물 생변환을 위한 scaffold로 사용될 수 있다(그림 2C). Resveratrol 생합성 효소들을 Zif268과 PBSII zinc-finger (ZF) 도메인에 퓨전시켰을 경우, 4개의 반복된(four repeats) DNA scaffold를 사용하면 resveratrol의 생산이 5배 증가하였다. 이 방법은 MVA 생합성 경로에 있는 다른 3가지 효소에 대해서도 적용되었는데, 1:4:2 ZF 도메인을 포함한 16개의 반복된 DNA scaffold를 사용하였을 때, 3배의 생산량 증가를 가져왔다. 이와 비슷하게, transcription activator-like effector (TALE)와 DNA의 결합이 효소 colocalization을 위해 시도되기도 하였다. TALE을 바탕으로 한 scaffold를 이용하여 tryptophan-2-monooxygenase와 indole-3-acetimide 가수분해 효소 복합체를 형성하였을 때, indole 3-acetic acid (IAA)의 생산이 9.6배 증가하였다. 천연물 생합성을 위해 앱타머를 기반으로 한 RNA scaffold나 바이러스 구조 단백질을 기반으로 한 지질(lipid) scaffold도 연구되었으나, 그 사용이 제한적이었다. 비록 DNA scaffold의 사용이 천연물 생합성을 증가시키는 효과를 보였지만, 최적화를 위한 추가적인 연구가 필요하고, RNA나 지질을 이용한 scaffold 또한 계속적인 연구 대상이라고 할 수 있다.

 

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그림 2. 단백질 colocalization을 위한 일반적 방법.

 

효소 복합체를 만들 때 scaffold를 이용하는 방법 이외에도, 박테리아 미세 구획(bacterial microcompartments, BMCs)과 흡사한 구조로 효소를 세포 내 공간(subcellular space)으로 배치하는 방법도 있다 (그림 2D). BMC는 거대한 단백질 복합체로써 shell subunit을 구성하는 주요 구성체 중 하나인데, 축적이 힘들거나 독성을 띄는 중간 물질의 생산을 향상시키기 위해 대사 경로의 효소들을 사용하는 carboxysome이 전형적인 BMC의 좋은 예로, 이산화 탄소 고정(CO2 fixation)과 1,2-propanediol 분해에 관한 연구에 사용되었다. Carboxysome에서의 이종 효소 발현(heterologous expression of enzymes)은, pyruvate 카복실기 제거 효소(pyruvate decarboxylase)와 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)에 carboxysome-targeting sequence가 도입된 E. coli 숙주 내에서 확인되었다. 또 다른 BMC의 예로는 좀 더 작은 polyhedral 단백질 복합체나 vaults를 들 수 있다. 천연물 생합성을 위한 BMC의 활용을 위해 해결해야 할 과제로는, 복합체 형성(assembly)이나 기능화(functionalization) 메커니즘에 관한 이해 부족, 구조적 단백질 발현으로 인한 세포 부담, BMC가 세포 내에서 실제로 차지하는 공간 문제, 중간 물질의 선택적 투수성(selective permeability), 외부 효소와 shell 단백질 간의 반응 등을 들 수 있다. 하지만, 효소 encapsulation은 세포 내에서 상대적으로 크고 단단한 공간을 제공하여, 숙주 세포로의 부담을 최소화하면서 대사 물질의 고농도 축적을 가능하게 한다는 점에서 잠재적 연구 가치가 크다. 효소 colocalization을 위해 위에서 살펴본 퓨전 효소 설계, scaffold를 이용한 복합체 구성이나 encapsulation에 대한 추가적인 연구는 천연물 생합성을 증가시키기 위한 좀 더 정밀한 단백질 공학적 접근을 가능하게 할 것이다.

2.3. 단백질 안정성 증가

단백질 공학을 통하여 효소의 촉매 활성을 증가시키는 노력이 가능해지긴 하였으나, 여전히 효소의 특징적 구조와 기능을 예측하여 그 특성을 변화시키는 것은 쉽지 않은 일이다. 효소에 대한 단백질 공학적 접근의 또 다른 목적 중 하나는 효소의 안정성을 증가시킴으로써 수명을 늘려 회전율(turnover rate)을 높이는데 있다. 안정성이 증가된 효소의 경우에는 높은 온도나 강산성/강염기성 조건을 필요로 하는 산업 현장에서 활용될 수 있다. 단백질의 안정성은 온도 안정성, pH 내성, 용해도, salt나 유기 용매에 대한 내성 등을 포함한다. 온도 안정성을 지닌 효소는 고온에서 작용할 수 있기 때문에 천연물 생합성 분야에서 새롭게 이용되고 있다. 돌연변이 스크리닝(mutagenesis-based screening)을 3차례 걸쳐 만들어낸 Tryptophan 7-chlorination halogenase RebH의 변이체 같은 경우에는, 8개의 변이(mutation)를 포함하여 녹는점이 18°C 만큼 증가하였고 그 원인으로 단백질 표면의 전하량(charge) 증가와 구조적 유연성이 줄어든 탓으로 밝혀졌다. 구조적 동일성(structure-guided consensus)을 바탕으로 한 접근을 통하여 만들어낸 glucose 1-탈수소효소(GDH) 변이체 같은 경우에는 비교적 고온인 65°C에서의 반감기(3.5 일)가 크게 증가하였고, 높은 농도의 salts와 유기 용매에도 내성을 지니는 것으로 알려졌다. 이 효소가 포함하는 변이들은 일정한 아미노산 서열(consensus amino acid)의 동일성과 단일 대체(single substitution)들을 결합하여 만든 것으로 보고되었다. 이 밖에도, 온도에 대한 내성을 지니지 못한 효소들도 그들과 흡사한 기능이나 구조를 지녔지만, 자연적으로 온도 내성을 타고난 효소들을 본 따 흡사하게 만드는 접근법도 있다. 예를 들어, τ-murol 합성 효소를 78°C에서도 여전히 활성을 띄는 두 개의 sesquiterpene 합성 효소와 염기 서열 분석을 한 결과, τ-murol 합성 효소의 C-terminal 아미노산들을 제거할 경우, 온도 안정성이 44.9에서 45.8°C로 증가하였다.

효소가 주변의 pH에 높은 안정성, 내성을 지니도록 변형되기도 한다. 예를 들어, lignin 분해에 필수적인 laccase의 경우에는 높은 온도와 pH를 필요로 하는데, 미생물의 lignin 소비를 가장 먼저 촉진하고 aromatic이 많은 기질을 높은 부가가치 물질로 변형시킨다는 점에서 매우 중요하게 여겨진다. 그러므로 laccase의 촉매 특성은 lignin의 valorization을 위한 다른 효소들과의 조화에 촛점이 맞추어 진다. Botrytis aclada로 부터 유래한 균류 laccase는 높은 pH로의 방향성 진화(directed evolution)를 거쳐 중성 pH에서도 활성이 다섯 배 증가하였다. 효소의 적정 pH를 변화시키는 것은 다수의 변이를 필요로 하는데, laccase 변이체의 경우에는 구리(copper) 결합 잔기들이 촉매 활성과 redox potential을 유지하는데 중요한 아미노산들이었다. 최근의 단백질의 안정성을 높이려는 연구들은 천연물 생합성 과정에서 까다롭게 작용하는 효소들이 혹독한 주변 환경에서도 활성을 유지하고 심지어 증가시킬 수 있도록 변화시켰다.

2.4. 전사 조절체(Transcriptional regulators)를 이용한 바이오센서(Biosensor) 개발

생합성 효소들을 변형시키는 것 뿐만 아니라, 유전적으로 인코딩 된 바이오 센서같은 악세서리(accessory) 단백질에 대한 공학적 접근도 천연물 생합성에 도움이 될 수 있다. 대부분의 바이오 센서들은 고유의 유도제(inducers)를 가지고 유전자의 발현이나 억제를 위해 특정 promoter 서열을 인식하는 allosteric 전사인자(allosteric transcription factors, aTFs)이다. aTFs는 중간 물질의 실시간 모니터링에 사용되는 것 이외에도, 합성 생물학(synthetic biology)을 천연물의 생산을 늘리기 위한 활성 경로 조절이나 바이오 센서를 기반으로 한 효소나 생물종의 고효율 스크리닝에도 적용 가능하게 한다. 하지만, 현재 매우 제한적인 천연 aTFs만이 이용 가능하고, 그것마저도 경우에 따라서는 역동적인 조절이나 바이오 센서를 기반으로 한 스크리닝에는 적합하지 않을 때도 있다. 비록 새로운 센서를 찾아내거나 특성을 밝히는 연구가 좋은 결과를 가져오기는 했지만, 천연 aTFs를 발굴 속도는 새로운 화합물(compounds)이나 복잡한 조절의 새로운 발견이나 스크리닝 요구에 부합하지 못하고 있다. 그러므로 현재 알려진 센서 조절체를 단백질 공학적으로 변형하여, 활성 범위(dynamic range)나, 반응 ligand의 종류를 확장시킴으로써 바이오 센서를 이용한 스크리닝의 효율성을 증가시키는 연구가 필요하다.

 

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그림 3. 유전적으로 인코딩 된 바이오 센서의 최적화를 돕는 단백질 공학.

 

단백질 공학을 이용해 조절 인자를 변형해 보려는 연구 분야에서는, 현재 알려진 aTFs를 이용해 바이오 센서가 반응할 수 있는 ligand의 범위를 넓혀 새로운 화학 물질을 인식할 수 있도록 하는 연구가 활발하다 (그림 3A). 예를 들어, 전형적인 L-arabinose 바이오 센서인 AraC의 경우에는 D-arabinose, MVA, triacetic acid lactone이나 ectoine 같은 ligand들과 반응할 수 있도록 변형되었다. 단백질 공학의 연구 기법 중 하나인, 특정 위치에 다른 아미노산 잔기들을 치환시킨 돌연변이를 만드는 site-saturated mutagenesis를 이용하여 ectoine에 반응하는 AraC 변이체들이 만들어 졌고, 그 중에 가장 높은 용량 반응(dose-responsive)을 가지는 변이체가 선별되었다. 바이오 센서를 이용한 고효율 스크리닝을 통해 속도 결정 효소인 L-2,4-diaminobutyric acid (DABA) aminotransferase (EctB)의 활성이 최대 4.1배 까지 증가되기도 하였다. 비슷한 방법으로, 잘 알려진 lac operon 억제제인 LacI 또한 컴퓨터를 이용한 단백질 디자인과 site saturated mutagenesis 기법을 접목하여 새로운 4가지 유도제: fucose (Q291T), gentiobiose (H70D, H74S), lactitol (I79T, R101H)와 sucralose (D149G, I160V, H163Y, S193E)에 반응하도록 변형되었다(각 유도제 별 해당 돌연변이 표시). 이 밖에도, 특정 천연물과 반응하여 해당 천연물의 생합성 조절이나 증진에 사용되는 바이오 센서들도 존재한다. Pseudomonas putida로부터 유래한 TtgR의 경우에는, 원래는 다양한 항생제나 식물의 2차 대사물질에 반응하지만, resveratrol에 특이적으로 반응하도록 변형되기도 하였다. 오직 하나의 아미노산이 치환으로 만들어진 TtgR A38T 변이체는 resveratrol을 인식할 수 있고, 높은 활성을 가지는 p-coumarate:CoA ligase 변이체 선별에 이용되었다. 한 가지 제약은 crosstalk 효과가 바이오 센서의 사용을 복잡하게 만들 수 있다는 점이다. 변형된 바이오 센서와 ligand의 결합 원리가 명확히 밝혀지지 않은 경우에는 조절 인자가 ligand와 구조적으로 흡사한 영향 인자(effectors)에 의해 유도될 수 있기 때문에 해당 바이오 센서의 사용에 제약이 따른다. 그러므로 ligand 결합 특이성이 변형된 바이오 센서는 crosstalk 효과에 대한 철저한 검증이 필수적이다.

바이오 센서의 활성 범위를 확장시키는 것은 바이오 센서를 기반으로 한 스크리닝이나 활성 조절의 활용도를 높일 수 있다 (그림 3B). Cis,cis-muconic acid (CCM)와 반응하는 원핵 생물 전사 인자인 BenM의 경우에는, 영향 인자 결합 부위를 중심으로 PCR을 이용한 무작위 돌연변이를 도입해 S. cerevisiae 숙주에서도 활성을 가질 수 있도록 변형되었다. 3가지 아미노산이 치환된 경우인 H110R/F211V/Y286N 변이체는 CCM 유도에 따른 GFP 발현을 두 배로 증가시켰고, 이 변이체는 CCM 합성 과정에서 속도 조절 효소인 protocatechuic acid decarboxylase와 가장 좋은 짝을 이루는 효소를 찾아내는데 사용되기도 하였다. 하지만, 바이오 센서의 활성 범위는 주로 DNA와의 결합 친화도(binding affinity)와 해당 promoter의 활성에 영향을 받게 된다. 유도제가 없을 경우, 억제제가 특정 promoter에 결합하여 전사를 억제하는데, 유도제에 의해서 억제제의 DNA 결합이 이뤄지지 않으면 promoter는 조절 인자에 영향을 받지 않는 가장 큰 활성을 띄게 된다. 그러므로, 활성 범위를 넓히기 위해, promoter의 변형과 ribosome binding site (RBS)의 변형 조합이 필요할 수도 있다. Promoter 변형과 Caulobacter crescentus로 부터 유래한 vanillate 센서인 VanR을 유도 진화한 변이체의 조합은 조절 인자의 활성 범위를 14배 증가시켰다. 이 바이오 센서는 천연 catechol O-methyltransferases의 선별에 쓰였고, 3개의 활성을 가지는 O-methyltransferases가 성공적으로 발견되었다. 단백질 공학적 접근으로 변형된 바이오 센서들은 측정 가능한 화합물의 수를 빠르게 증가시켰고, 이러한 조절 인자들의 반응 시그널을 최적화 시켰다. 천연물 생합성은 복잡한 조건이 동반되기도 하기 때문에, 바이오 센서는 매우 낮거나 아예 없는 crosstalk 효과, 유도제에 대한 민감성, 확실한 on-off 스위치 같은 까다로운 조건을 만족시켜야만 한다. 천연물 합성을 위한 바이오 센서-조절 인자에 대한 단백질 공학적 접근은 앞서 서술한 까다로운 조건을 우선 만족하는 것에 우선순위를 두고 진행되어야 한다.

3. 단백질 공학을 통한 천연물 생합성 다양화

효소의 활성을 증가 시켜 생산 효율을 높이는 방법 이외에도, 효소를 혼합하거나, 새로운 효소를 이용하여 천연물의 종류를 다양화하는 연구도 진행되었으나, 아직 여러 필수적인 반응들은 효소 촉매 반응이 불가능한 것도 사실이다. 천연 효소에 단백질 공학을 이용하여 기질 다양성을 확장하는 것은 이전에 존재하지 않던 생화학 반응을 만들어 내기 때문에, 천연물이나 높은 부가 가치를 지니는 천연물 유사물질의 미생물 생산을 위한 비천연 대사 경로를 새롭게 형성하기도 한다 (그림 4).

 

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그림 4. 천연물 생합성 다양화를 위한 단백질 공학.

 

새로운 천연물은 변형된 효소의 폭넓은 기질 반응성에 의해 생겨날 수 있는데, 좋은 예로, 대장균의 내생 thioesterase TesA 효소가 있다. TseA 효소에서 N-terminal의 세포질 신호 펩타이드(periplasmic signal peptide) 혹은 leader 펩타이드를 제거한 변이체는 ‘TesA’라 불리는데, 이는 기질 중합체의 길이에 대한 선호도가 long-chain (C14.C18) acyl-ACP 에서 medium-chain (C8.C12) acyl-ACP로 바뀌었다. 구조 분석을 바탕으로 한 추가적인 변형을 통해 ‘TesA는 C12나 C8에 대한 기질 특이성과 활성이 증가하였다. Aspergillus terreus로부터 유래한 aromatic prenyltransferase AtaPT의 경우에는, 기질 결합 부위에 대한 위치 특이적 돌연변이 기법을 이용해 증여체 선택성(donor selectivity)과 prenylation 특이성이 변하였고, 그에 따라 genistein, sophoricoside나 7-hydroxycoumarin (7-HC)같은 기질과의 반응이 가능해져 새로운 prenylated 물질을 생성할 수 있게 되었다. Aspergillus nidulans로부터 유래한 FeII/α-ketoglutarate-의존적 dioxygenase AsqJ의 반응 기작은 컴퓨터를 이용한 분자 시뮬레이션을 통해 밝혀졌다. 원래 AsqJ 효소는 생의학적으로 중요한 quinolone alkaloid인 4’-methoxycyclopeption의 4’-methoxyviridicatin로의 변환 과정에서 desaturation과 epoxidation을 촉매작용 하는데, 이의 변이체인 AsqJ V72I는 메틸화 되지 않은 기질과도 반응하여 생물 제약 산업에서의 큰 응용 가능성을 보여주었다.

효소를 변화 시켜 전례 없는 생화학 반응을 유도하는 데에는, 성공적인 변형을 위한 정보가 제한적이라는 한계가 따른다. 일반적으로는 비슷한 기질/생성물 혹은 반응 기작을 가지는 이미 알려진 효소로부터 정보를 얻을 수 있지만, 그러한 비슷한 효소를 찾기가 쉽지 않거나, 단백질 공학을 통해 원하는 변이체를 만들어 낼 수 있을지 확신하기 어려울 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 단백질 공학적 접근은 촉매 작용 증가를 통해 생합성 천연물 및 그 유사 물질의 범위를 크게 확장시켰을 뿐 아니라, 기존의 천연물 생합성 경로를 다양화 하는 데에도 기여했다. 예를 들어, 항산화 작용 및 다양한 약학 특성을 지닌 천연 페놀릭 물질인 hydroxytyrosol의 생합성이 대장균 내에서 이루어졌다. 최근에는 flavin 의존적인 monooxygenase인 HpaBC가 방향성 발산 진화(directed divergent evolution)를 통하여 변형되었다. 3개 연속 아미노산의 돌연변이(S210T, A211M, Q212G)를 지닌 변이체는 tyrosol과 tyramine 수산화효소의 기능을 동시에 가져 82%의 수율과 1.89 g/L 농도로 hydroxytyrosol을 만들 수 있었다. 추가적인 분석을 통해 M211과 G212 돌연변이가 단백질의 유연성을 증가 시켜 tyrosol이나 tyramine의 단백질로의 유입을 가능하게 할 수 있다고 보고되었다. 더욱 흥미로운 것은, 활성 부위나 결합 위치의 미세환경을 변화시키는 것이, 기능적으로 중요한 잔기들을 직접 바꾸는 것 보다 기질 특이성을 확장시킬 가능성이 높다는 것이다. 결정 구조를 바탕으로 싸이토크롬 산화효소 CYP199A2의 S247잔기를 대상으로 한 위치 특이적 돌연변이를 통해 만들어진 S247D 변이체는 p-methylbenzyl alcohol과 페놀에 대한 새로운 기질 특이성을 가지는 것이 밝혀졌다. 이 돌연변이는 p-methylbenzyl alcohol, p-cresol 과 페놀을 위치 특이적으로(regioselectively) 산화시켜 각각 1,4-benzenedimethanol, p-hydroxybenzyl alcohol과 hydroquinone을 형성하는데, 자연형(wild-type) 효소는 이들 기질에 대한 반응성이 존재하지 않는다. 추가적인 돌연변이 S97D는 p-cresol을 p-hydroxybenzyl alcohol로 변환시키는 것도 가능하다. 그러므로 단백질 공학은 효소의 기질 특이성을 확장시켜 새로운 천연물이나 대사 경로를 만들어 내는 것이 가능하다고 할 수 있다.

4. 결론

생촉매와 천연물 생변환의 계속적이고 신속한 발달을 위해서는 새로운 효소의 발굴, 특성 규명, 및 변형이 필수적이다. 단백질 공학은 생촉매의 본질적인 특성에 촛점을 맞추어 효소의 촉매적 물리적 특성을 영구하게 변환시키고 생제조(biomanufacturing) 가능성을 크게 증가시킬 수 있기 때문에, 천연물 생합성이 가능한 산업 시스템을 개발하는데 큰 역할을 하였다. 본 리뷰에서 소개한 단백질 공학적 접근법들은 다양한 도구를 제공하고 천연물 생합성에 필요한 중요 효소들을 변형하는데 필요한 지침으로 사용될 수 있다.

하지만, 여전히 효소나 조절 인자를 변형시키는 데에는 여러 가지 어려움이 따른다. 무작위 돌연변이는 단백질 공학에서 전통적인 기법이지만, 방대한 변이체 libraries를 만들어 내고 효율적인 스크리닝 방법을 요구한다. 좀 더 정제된 방법으로는 방향성 진화가 있는데, 특정한 선택적 압력이나 기준을 이용하여 여러 번의 반복적인 돌연변이를 거쳐 상대적으로 적은 수의 변이체 library를 만들 수 있고, 무작위 돌연변이보다 효율적일 경우가 많다. 추가적으로 바이오센서를 바탕으로 한 선택은 원하는 특성을 가지는 단백질 변이체를 쉽게 찾아낼 수 있고, 그러한 과정의 효율성을 추가로 증가시키기 위한 고효율 스크리닝을 가능하게 한다. 그렇더라도, 각각의 연구에 쓰이는 분석이나 스크리닝 방법은 주로 어떤 특정한 성질에 특이적이기 때문에 항상 다른 경우에 쓰일 수 있는 것은 아니다. 그렇기에 합리적 디자인을 이용한 방법이 단백질 공학에서 앞으로 중요한 추세이고, 이는 단백질 구조와 컴퓨터 시뮬에이션에 관한 지식을 바탕으로 촉매 기작에 대한 이해를 필요로 한다. 단백질의 합리적 디자인을 위해 컴퓨터를 이용한 다양한 도구들이 개발되었는데, 단백질의 가능 구조를 예상하기 위한 상동성 모델링(homology modeling)이나, 단백질과 기질 간의 상호 작용을 분석하기 위한 molecular docking, 자유 에너지와 시스템의 state function을 추정하기 위한 metadynamics, 단백질의 구조적 역학이나 분자 역학 시뮬레이션을 양적으로 분석하기 위한 Markov state model 등이 있다. 그러나 이러한 시뮬레이션들은 입력 매개 변수에 크게 영향을 받는다. 예를 들어, 상동성 모델링과 metadynamics는 각각 선택된 상동 단백질들과 입력값에 크게 좌우된다. 그렇기 때문에 컴퓨터를 이용한 모델링은 여러 경우에 유용하게 사용될 수 있지만, 언제나 효소 공학을 위한 정확한 지침을 제공하는 것은 아니다. 단백질 구조나 반응 기작이 완벽히 밝혀진 경우에도, 각각의 아미노산 치환이 가져올 변화를 예측하는 것은 여전히 쉽지 않다.

단백질 공학의 더욱 발전하기 위해서는 구조 생물학, 생화학, 전산 생물학의 도움이 필요하다. 아직도 복잡한 단백질이나 막 단백질의 결정 구조를 얻기는 쉽지 않지만, 그들의 구조가 밝혀진다면 새로운 반응 기작이나 단백질 machinery를 추가로 이해하는데 도움이 될 것이다. 구조나 반응 기작에 대한 자세한 정보는 단백질 공학에서 합리적 디자인과 좀 더 정확한 예측을 위해 필수적이다. 단백질과 ligands의 상호 작용을 모델링하기 위한 알고리즘은 더 크고 복잡한 단백질을 더 잘 시뮬레이션하기 위해 간결해지고 최적화되어야 한다. 바이오 센서는 특정 물질 뿐 아니라 pH, 온도나 빛 등의 다양한 환경적 signal도 측정할 수 있게 되었다. 바이오 센서는 세포내 특성을 측정이 용이한 결과값으로 변환 시킬 수 있기 때문에, 고효율 스크리닝을 위해 필수적이 되었다. 현재 알려진 단백질을 변형시키는 것뿐 아니라, de novo 단백질 디자인은 천연물 생합성이 가지는 문제를 해결할 수 있는 중요한 도구가 되었는데 천연 단백질에 의한 구조적 공간이 제한적이기 때문이다. 단백질 접힘에 관한 물리 화학적 원리에 따라서 컴퓨터를 이용한 분자 시뮬레이션의 도움으로 수소 결합 네트워크나 나선형 단백질 필라멘트 같은 다양한 구조들이 처음부터 분자 level로 디자인이 가능해 졌다. 이러한 상당한 발전에도 불구하고, 현재 컴퓨터 시뮬레이션이 가지는 정확성에 대한 한계로 인해 복잡한 기능을 가진 새로운 단백질을 완벽하게 디자인하는 것은 아직 어렵다. 그럼에도 불구하고, 컴퓨터를 통해 de novo 단백질 구조나 기능을 예측하는 것이 시퀀스 변화를 동반하는 단백질 구조적 변화를 분석하는 것보다는 쉽다. De novo 단백질 디자인은 거대한 구조적 변화나 시스템의 state function 상의 중요한 변화를 주로 다루는 반면, 몇몇 아미노산에 제한된 치환은 측정하거나, 예측하기 힘든 작은 변동 만을 일으킬 수 있다. De novo 단백질 디자인은 미래 단백질 공학의 새로운 연구 방향을 제시하고 천연물 생합성의 추가적인 개선과 다양화에 기여할 수 있다.

 

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김태진(2020). 천연물 생합성 증대와 다양화를 위한 단백질 공학. BRIC View 2020-R43. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3657 (Dec 24, 2020)
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