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미생물의 염기 편집 기술(Base editing): 효과적인 미생물 게놈 편집
미생물의 염기 편집 기술(Base editing):  효과적인 미생물 게놈 편집 저자 노명현 (포항공과대학교 화학공학과)
등록일 2020.11.12
자료번호 BRIC VIEW 2020-R37
조회 654  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
게놈 편집 및 개량 기술은 기초적이나 폭넓은 활용 분야를 갖는다. 이에 관해 CRISPR/Cas 시스템을 활용한 상동 재조합(Homologous recombination, HR) 기술이 다양하게 개발되었으며, 간단하고 효율적이며 폭넓게 적용될 수 있다는 장점을 가진다. 최근에는 CRISPR/Cas 시스템과 핵산 탈아미노효소(Nucleobase deaminase)를 결합한, 염기 편집(Base editing) 기술이 개발되었고 게놈 편집 기술의 새로운 장을 열고 있다. 특히, 해당 기술은 기존 CRISPR/Cas 기반 HR 기술의 세포에 치명적인 DNA의 이중 가닥 절단, 외부 DNA의 도입과 같은 과정 없이도 핵산 변이를 진행할 수 있다는 점에 장점을 갖는다. 본 논문에서는 최근 이러한 염기 편집 기술의 개발과 미생물 내의 다양한 활용에 대해 다루고자 한다. 더불어, 해당 기술과 관련된 gRNA 디자인 및 데이터 분석을 용이하게 해 줄 생물정보학적 도구에 대해서도 요약해보고자 한다.
키워드: 염기 편집 기술(Base editing), 게놈 편집, CRISPR 시스템
분야: Bioinformatics, Biotechnology

본 자료는 Microbial Base Edit-ing: A Powerful EmergingTechnology for Microbial Genome Engineering. Trends Biotechnol. (2020) .의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목 차

1. 염기 편집 기술: CRISPR/Cas 시스템의 활용을 통한 신규 게놈 편집 기술
2. 원핵 생물 내 염기 편집 기술
   2.1. 대장균(Escherichia coli)
   2.2. 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)
   2.3. 스트렙토마이세스 종(Streptomyces Species)
   2.4. 클로스트리디움 베이예린키이(Clostridium beijerinckii)
   2.5. 슈도모나스 종(Pseudomonas Species)
   2.6. 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides)
   2.7. 슈와넬라 오나이덴시스(Shewanella oneidensis)
   2.8. 병원성 박테리아(Pathogenic Bacteria)
3. 진핵 생물 내 염기 편집 기술
   3.1. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)
   3.2. 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)
   3.3. 아스페르질루스 니게르(Aspergillus niger)
4. 염기 편집 기술의 활용을 위한 생물정보학적 보조 도구
   4.1. gRNA 디자인 도구
   4.2. 시퀀싱(Sequencing) 데이터 분석 도구
5. 결론 및 향후 기술 전망


1. 염기 편집 기술: CRISPR/Cas 시스템의 활용을 통한 신규 게놈 편집 기술

CRISPR/Cas 시스템은 간편성과 효율성 덕에 유전자 편집 기술 분야에 폭넓게 활용되고 있으며, 해당 분야의 획기적인 발전을 이루고 있다. CRISPR/Cas 시스템을 통해 이중 가닥 절단(dsDNA breaks, DSBs)이 생기면 원하는 형태로 도입된 DNA 절편의 상동성 재조합(Homologous recombination, HR)이 일어나는 원리로 유전자 편집이 진행될 수 있다. 진핵 생물 내에서는 DNA 절편의 도입 없이도 non-homologous end joining (NHEJ)를 통해 편집이 진행될 수 있으며, 이 경우에는 자체적인 효율 특성으로 삽입-결실(Indel) 돌연변이가 도입될 수 있다. 하지만, 원핵 생물의 경우에는 NHEJ의 효율이 낮기 때문에 필연적으로 DNA 절편의 도입에 의존한 HR에 의존해왔으며, 이 경우 동시 유전자 편집 시 낮은 세포 생존율이나 특정 미생물에서는 활용이 불가능하다는 점 등의 한계가 존재해왔다.

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그림 1. 염기 편집 기술과 메커니즘 개요.
(A) 사이토신 염기 편집 기술과 (B) 메커니즘, (C) 아데닌 염기 편집 기술과 (D) 메커니즘

 

염기 편집(Base editing, BE) 기술은 위에서 서술한 문제를 해결 가능하다는 점에서 개발이 되었고 다양하게 활용되어 왔다. 해당 기술은 CRISPR/Cas 시스템의 목적 특이성(Targeted specificity)과 핵산 탈아미노효소(Nucleobase deaminase)의 특성을 활용한 기술로 DSBs나 DNA 절편의 도입 없이도 원하는 서열의 돌연변이를 일으킬 수 있다 (그림 1). 크게 두 가지 타입의 DNA 염기 편집 기술이 지금까지 개발되어 왔는데, 첫 번째는 사이토신 염기 편집 기술(Cytosine base editors, CBEs)로 C:G 염기 조합을 T:A로 변이할 수 있다 (그림 1A & 1B). 또 다른 한 가지는 아데닌 염기 편집 기술(Adenine base editors, ABEs)로 A:T 염기 조합을 G:C로 변이시킨다 (그림 1C & 1D). 해당 기술은 적용이 간단하다는 점, 높은 효율성, 동시 편집이 가능하다는 장점으로 유전자 비활성화, 효소 진화(Protein evolution), 조합적 돌연변이 도입(Combinatorial mutation) 등 다양한 분야에 활용될 수 있었다 (표 1). 본 리뷰에서는 최근 염기 편집 기술의 동향과 산업, 의학 분야와 밀접한 연관을 갖는 미생물 내의 활용에 대해 주로 다루고자 한다.

 

표 1. 염기 편집 기술 활용 사례.
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2. 원핵 생물 내 염기 편집 기술

2.1. 대장균(Escherichia coli)

Streptococus pyogenes 유래 이중 가닥 절단 활성을 없앤 dCas9과 Petromyzon marinus 유래 사이티딘 탈아미노효소(Activation induced cytidine deaminase, AID, PmCDA1)를 조합한 Target-AID 시스템을 대장균 내 구축한 바 있다. 원하는 염기 서열 편집이 완료되지 않은 non-edited strand를 자르는 Cas9-nickase (nCas9)의 활용이 염기 편집 효율을 보다 높이는 것으로 이전에 알려진 바 있지만, Banno 외 연구진은 대장균 내에서 nCas9과 PmCDA1을 조합한 nCas9(D10A)-PmCDA1이 낮은 트랜스포메이션(Transformation) 효율을 갖는 것을 확인하였다 (그림 2C). 이러한 경향은 이전에 다른 박테리아 내에서도 낮은 세포 생존율을 통해 확인된 바 있다. 프로토스페이서(Protospacer) 위치 기준 -16부터 -20까지의 다섯 염기 서열 범위에서 염기 편집이 이루어지는 것을 확인할 수 있었으며, guide RNAs (gRNAs)의 길이 조절을 통해 해당 범위가 조절될 수 있음을 확인할 수 있었다 (그림 2D). 보다 염기 편집 효율을 높이기 위해서, uracil DNA glycosylase (UNG) inhibitor (UGI)를 dCas9-PmCDA1과 추가로 결합해주었으며, 이 경우 사이토신 탈아민(Cytosine deamination)의 중간 생성 물질인 우라실(uracil)을 제거해주는 방법을 활용하고자 했다. 하지만, 단백질의 결합에 실패하였는데, 이는 UGI의 비특이적 돌연변이 생성 때문으로 사료되었다. 이에 대해서는 추가적으로, 결합 단백질에 LVA tag를 추가로 결합하여, 결합 단백질의 반감기(Half-life)를 줄이고 세포 내 독성을 낮추는 방법으로 개량이 진행되었으며, 그 결과 얻어진 dCas9-PmCDA1-UGI-LVA를 활용한 염기 편집에서는 41개 목표 위치(Target loci)에 대해 성공적으로 염기 편집이 이루어짐을 확인할 수 있었다. 하지만, 여전히 UGI를 활용한 염기 편집에서는 원하지 않는 돌연변이(Off-target mutation)가 얻어짐을 확인하였고, 이는 여전히 활용에 있어 한계점으로 남아있다.

 

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그림 2. 염기 편집 기술의 개량을 통한 작동 범위 조절
(A) 다양한 Cas 단백질 활용을 통한 PAM 인식 서열 확장, (B) 탈아미노 효소의 작동 범위 다양화, (C) Cas-탈아미노효소 구조 개량, (D) gRNA 길이 조절

 

CBE를 활용한 염기 편집 역시 대장균 내 구현된 바 있다. 사이티딘 탈아미노효소인 rAPOBEC1와 nCas9(D10A), UGI가 마찬가지로 활용되었으며, 박테리아 내 C-T 염기 편집 효율이 100%에 달하는 것을 확인한 바 있다. Yang 외 연구진은 다양한 사이티딘 탈아미노효소를 Zinc-finger (ZF)나 transcription activator-liker effector (TALE)-DNA binding modules와 함께 활용해보고자 했으나, 이러한 경우에는 CRISPR/Cas 시스템 기반의 염기 편집 효율에 비해 월등히 낮은 효율을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 이는 ZF나 TALE 시스템이 단일 가닥 DNA를 제대로 형성하지 못하여 사이티딘 탈아미노효소가 제대로 결합하지 못하는 것이 이유로 추정된다.

대부분의 염기 편집 기술이 동물 세포(Mammalian cell)에서 처음 구현된 것과는 달리, 아데닌 염기 편집 기술은 대장균 내에서 처음 구현되었다. 아데닌의 아민기를 떼어내는 효소가 알려진 바 없기 때문에, Gaudelli 외 연구진은 tRNA 아데닌 탈아미노효소(tRNA adenosine deaminase, TadA)를 DNA 서열의 A-G 전환이 가능하도록 개량했다. 하지만, 그 자체의 효율은 굉장히 낮았고, 이후 원하는 염기 편집이 이루어지지 않은 세포에 대해 Cas9을 활용하여 선택압(Selective pressure)을 줄 수 있는 double-check 전략을 도입하여 A-G 전환 효율을 99%까지 끌어올릴 수 있었다.

2.2. 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)

산업적으로 활용되는 균주로 대표되는 C. glutamicum에서도 염기 편집 기술이 시도되어 왔다. CRISPR/Cas 기반 게놈 편집 기술이 최근 C. glutamicum 내 구축된 바 있지만, DSBs의 높은 세포 독성과 일렉트로트랜스포메이션(Electrotransformation) 그리고 HR의 낮은 효율로 게놈 편집에는 여전히 어려움이 존재해왔다. 이러한 문제를 해결 하기 위해, Wang 외 연구진은 Target-AID 시스템을 적용하고자 했고, multiplex automated C. glutamicum base-editing method (MACBETH)를 구축할 수 있었다. nCas9(D10A)-PmCDA1이 다른 버전의 염기 편집 기술보다 높은 효율로 적용 가능함을 보였는데, 특히, UGI의 활용이나 세포 생존율에 저해없이 100%에 가까운 편집 효율을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 해당 효율은 DSB 기반 선행 기술 대비 70배 가량 향상된 수치에 해당한다. 해당 기술을 활용하여 3개의 목표 유전자를 종결 코돈의 도입을 통해 한 번에 비활성화시키는 데 성공하였는데, 이는 기존 CRISPR/Cas 시스템이나 suicide plasmid 기반 시스템으로는 구현 불가능한 기술이었다. 더불어, 염기 편집에 필요한 다양한 모듈들을 한 플라스미드 내에 구축하여, gRNA만을 바꾸는 방법으로 폭 넓게 활용할 수 있다는 것이 장점이다. 이렇듯, 간편성과 효율성을 장점으로 로봇 기반 자동화가 구현될 수 있었으며 94개의 전사 인자(Transcription factor) 비활성화 라이브러리를 구축한 바 있다.

연구진은 추가적으로, NGG PAM 서열로 제한되는 MACBETH 활용을 완화하고자 다양한 nCas9 (VQR-Cas9, VRER-Cas9, xCas9 3.7, Cas9-NG)를 도입하여 PAM 특이성을 넓히고자 하였다 (그림 2A). 그 결과, PAM 인식 서열은 NGG가 아닌 NG로 완화될 수 있었고, 이는 3.9배 많은 목표 염기 서열에 대해 적용될 수 있다. TadA 돌연변이를 활용한 ABE 시스템도 C. glutamicum 내 구축될 수 있었는데, 효율은 1%부터 66%까지 다양하게 확인되었으나, 전반적으로 사이토신 편집 기술에 비해 낮은 효율을 갖는 것으로 확인되었다. 앞선 경우와 비슷하게, double-check 전략이 효율을 향상시키기 위해 적용될 수 있을 것으로 사료되며, 모듈의 발현 최적화나 TadA 효소 활성 증대가 대안으로 활용될 수 있을 것이다.

2.3. 스트렙토마이세스 종(Streptomyces Species)

Streptomyces는 고부가가치 화합물을 자연적으로 만드는데 주목받고 있는 균주로, 게놈 상 GC 염기가 70% 이상을 이루고 있어 유전적으로 불안정하고 성장 속도가 낮으며 유전자 조작 또한 제한적이라는 한계점이 존재한다. 특히, CRISPR/Cas로 야기되는 DSBs는 게놈 안정성을 더욱이 낮춰 상당한 세포 독성을 가지며, 대규모 게놈 서열 삭제나 재배열(Rearrangements)을 일으키는 것으로 알려져 있다. Tong 외 연구진은 BE, ABE를 각각 기반으로 한 CRISPR-cBEST, CRISPR-aBEST를 구축하였는데, 특이한 점은 Cys4 (Type I-F Cas6)을 활용하여 gRNA array가 다양한 mature gRNAs로 gRNA self-processing 될 수 있다는 점이며, 이는 동시적 염기 편집을 가능케 한다. CRISPR-cBEST가 CRISPR-aBEST에 비해 높은 효율과 넓은 작동 범위(Wider editing window)로 적용될 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, CRISPR-cBEST는 TC>CC>AC>GC 순으로, CRISPR-aBEST는 TA>GA>AA>CA 순의 염기 편집 효율 및 기질 선호도(Substrate preference)를 갖는 것을 확인하였다. 해당 기술은 Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces collinus에서 구현할 수 있었다.

Zhong 외 연구진은 비슷하게 BE, ABE 기반 염기 편집 기술을 각각 구현하였다. Streptomyces avermitilis에서 9개 polyketide 합성 유전자들의 제거를 통해 avermectin 생산을 구현할 수 있었다. 또한, 돌연변이 nCas9의 활용을 통해 기질 정확성을 높이고 off-target 돌연변이를 측정되지 않는 수준으로 줄인 바 있다. Zhao 외 연구진은 Target-AID 기술을 활용해 구아노신(Guanosine)과 인접한 사이토신을 70-100%에 달하는 높은 효율로 편집할 수 있음을 몇 가지 Streptomyces 균주들에서 보인 바 있다. 또한, Target-AID, BE 시스템을 활용해 다양한 범위의 편집 효율을 갖는 것을 확인할 수 있었고, 이는 Streptomyces 내 염기 편집 기술 활용도를 높일 수 있다.

2.4. 클로스트리디움 베이예린키이(Clostridium beijerinckii)

C. beijerinckii는 solventogenic한 특성을 갖고 있기 때문에, 바이오 화합물 및 연료 생산에 활용될 수 있다. 하지만, 굉장히 낮은 일렉트로트랜스포메이션과 HR 효율을 가지는 것으로 알려져 있어 그 활용이 제한되어 왔다. 이러한 점에서 rAPOBEC1-nCas9(D10A)-UGI를 활용한 BE 시스템이 적용된 바 있으며, 해당 모듈의 코돈 최적화(Codon optimization)를 통해, 염기 편집 효율을 100%까지 향상시킬 수 있었다. 해당 시스템의 경우, 플라스미드의 트랜스포메이션 과정만으로 염기 서열 편집이 관찰되기도 하여, 다양한 Clostridia에 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 사료된다.

2.5. 슈도모나스 종(Pseudomonas Species)

Pseudomonas는 여러 분야에 걸쳐 중요성을 갖는 균이며, 인간에게 주요 항원으로 작용하는 Pseudomonas aeruginosa, lignin을 생분해하여 다양한 부가가치 화합물 생산에 활용될 수 있는 Pseudomonas putida로 대표된다. Chen 외 연구진은 CRISPR/Cas9 기반 게놈 서열 편집이 P. aeruginosa에서는 가능하나, 다른 Pseudomonas 종들에서는 그렇지 못함을 보인 바 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 같은 연구진은 rAPOBEC1-nCas9(D10A)를 활용한 사이토신 편집 시스템을 구축하였다. 다양한 종에서 활용 가능하도록 광범위한 host-range를 갖는 mSF 레플리콘(Replicon)을 플라스미드 복제를 위해 활용하였고, 염기 편집 이후 플라스미드 제거(Curing)를 위해 sacB 유전자를 counter-selection marker로 활용하였다. 해당 시스템은 P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens, P. syringae를 포함한 다양한 종에 활용 가능하였으며, 높게는 100%의 효율을 갖는 것으로 확인되어, 염기 편집 기술이 Pseudomonas 종에 효율적으로 활용될 수 있음을 보였다.

2.6. 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides)

광합성 미생물인 R. sphaeroides는 광합성 분석에 있어 주요 모델이며, 수소, 테르펜(Terpene)의 잠재적 생산 균주다. 해당 균주의 유전적 개량을 보다 손쉽게 하기 위해, Luo 외 연구진은 Target-AID, ABE 시스템을 적용하고 효율을 측정하였다. Target-AID 시스템은 C-T 변이를 단일 목표 서열부터 삼중 목표 서열까지 각각 97%, 47%에 달하는 효율로 가능케 하였으며, 앞선 C. beijerinckii 사례와 유사하게 일렉트로트랜스포메이션 과정 직후 얻어진 콜로니에서도 nCas9(D10A)-PmCDA1-UGI의 인덕션(Induction) 및 발현을 통해 염기 편집이 이루어짐을 확인했다. 하지만, 아데닌 편집의 경우 사이토신 편집에 비해 굉장히 낮은 효율을 갖는 것을 확인하였고, 이에 추가적인 두 번째 인덕션 과정이 요구되었다. 이후, 최적화된 방법을 통해 coenzyme Q10 생합성 필수 유전자의 빠른 비활성화가 가능함을 보일 수 있었고, 이를 통해 염기 편집 기술의 편리함을 다시금 증명했다.

2.7. 슈와넬라 오나이덴시스(Shewanella oneidensis)

S. oneidensis는 exoelectrogenic 박테리아로 알려져 있으며, 바이오레메디에이션(Bioremediation), 바이오에너지 생산, 금속의 biogeochemical cycling에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. BE 시스템은 Cheng 외 연구진에 의해 처음 S. oneidensis 내 구축되었으며, 다른 시스템과는 달리 rAPOBEC1-nCas9(D10A) 모듈과 gRNA가 함께 항시적(Constitutive)으로 발현된다는 것이 특징이다. 따라서, 해당 시스템은 BE 모듈들의 트랜스포메이션 이후에 점진적으로 염기 편집이 이루어진다는 것이 특징이며, 단일, 이중 타겟에 대해 각각 100%, 87.5% 효율을 갖는 것으로 확인되었다. 편집 이후에 플라스미드 제거는 I-SceI 제한 효소를 활용한 counter-selection을 통해 진행될 수 있다. 이러한 시스템을 기반으로, N-acetyl-glucosamine과 글루코스 대사 경로가 규명, 오염 물질 분해를 위한 기질 활용 증대에 활용된 바 있다.

2.8. 병원성 박테리아(Pathogenic Bacteria)

산업적 활용도가 높은 박테리아와 마찬가지로, 몇 가지 병원성 박테리아의 유전자 조작이 진행되어 왔는데 이는 굉장히 많은 시간이 소요되고 노동집약적이었다. 이러한 관점에서, 염기 편집 기술은 게놈 편집을 용이하게 하고 생리학 연구, 치료 전략 개발을 촉진할 것으로 기대된다. Ji 그룹은 Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, P. aeruginosa를 포함한 몇 가지 병원성 박테리아에서 BE 시스템을 적용하고자 했으며, BE 시스템을 활용한 C-T 변이가 최대 100% 효율로 진행할 수 있음을 확인하였다. 또한, Zheng 외 연구진은 브루셀라병을 유발하는 Brucella melitensis 균주에 BE 시스템을 적용한 바 있는데, 3가지 목표 유전자에 대해 테스트를 진행하였으나, 실제 염기 편집은 한 가지 유전자에 대해서만 100% 효율로 진행되는 것을 확인할 수 있었다. 다양한 시스템이 박테리아 내 효과적으로 구현되고 있기 때문에, 앞으로도 폭 넓은 종에 효율적인 염기 편집 기술이 적용될 수 있을 것으로 사료된다.

3. 진핵 생물 내 염기 편집 기술

DSBs가 치명적으로 원핵 생물에 작용하였던 데 반해, 진핵 생물은 DSBs에 대한 복구 과정(Repair process)이 존재하기 때문에 DSBs가 치명적이지는 않으나, 복구 과정에서 NHEJ를 통한 비특이적 돌연변이가 발생하곤 한다. 따라서, HR과 외부 DNA의 도입이 정확하게 원하는 게놈 돌연변이를 얻기 위해서는 필수적이다. 이러한 점을 고려할 때, 염기 편집 기술은 DSB 복구 과정에서 생기는 비특이적 돌연변이를 줄이고 정확하고 예측 가능한 게놈 편집을 가능케 한다.

3.1. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)

S. cerevisiae는 진핵 생물의 대표 모델로 기초적인 연구와 산업적인 활용이 활발히 진행되어 왔고, 염기 편집 기술의 개발은 유전자 조작 폭을 넓혀왔다. Nishida 외 연구진은 Target-AID 시스템을 처음 구축하였는데, dCas9, nCas9 (D10A), nCas9 (H840A) 각각을 PmCDA1과 결합하여 S. cerevisiae 내 사이토신 편집을 확인하고자 했다. 그 중 nCas9 (D10A)-PmCDA1의 경우 가장 높은 효율을 보였는데, 이는 목표 타겟 DNA의 상호 가닥의 탈아미노 과정을 통해 변이 효율을 높일 수 있었던 것이 이유로 사료된다. 해당 전략은 다양한 종의 염기 편집 기술 개발에도 넓게 적용될 수 있었다. Poly-C 부근의 영역을 목표로 할 때에, Target-AID 시스템은 -18 위치에서 가장 높은 편집 효율을 보였고, 주위로 갈수록 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. Poly-C 영역 주위에서 변이의 다양한 스펙트럼을 확인하기도 했는데, 5’ 말단에서는 C-T로의 변이가 우세하게 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 3’ 말단에서는 C-G 변이가 우세하게 일어나는 것을 확인했다. 비슷한 현상은 C. glutamicum에서도 확인될 수 있었는데, 사이토신이 가장 높은 변이율을 보였고, 이후 아데노신과 티아민이 비슷한 효율로 그 뒤를 이었다. 이렇듯, 비교적 고르게 변이가 나타나는 것은 Target-AID를 통해 다양한 변이를 도입할 수 있다는 점에 장점이 될 수 있다. Tan 외 연구진은 사이티딘 탈아미노효소의 개량 및 링커(Linker)최적화를 통해 -18 혹은 -15/-16 위치의 사이티딘을 특이적으로 변이시키는 염기 편집 기술을 선보인 바 있다. 높은 정확도를 갖는 해당 기술은 추가로 nCas9 개체들의 활용을 통해 non-NGG PAM 서열을 인식하여 폭 넓게 S. cerevisiae에서 적용될 수 있도록 추가 개량될 수 있었다.

3.2. 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)

Y. lipolytica는 아세틸 조효소(Acetyl-CoA) 기반 화합물을 생산하는 데 두루 활용되고 있다. 특히, Y. lipolytica는 DSB 복구 기작에 대해 HR보다 NHEJ가 우세하게 일어나는데, 이로 인해 정확하게 원하는 돌연변이를 도입하는 데 어려움이 따른다. Bae 외 연구진은 Target-AID 시스템을 활용해보고자 했으며, 구체적으로 종결 코돈의 도입을 통해 유전자의 비활성화를 시도하고자 했다. NHEJ 담당 효소를 코딩하는 ku70 유전자의 제거를 통해 DNA 복구 과정에서 일어나는 삽입-결실 변이를 차단해주었으며, 해당 시스템을 통해 C-T 변이 효율을 높였다. 추가적으로 편집 효율을 향상시키기 위해, 프로모터(Promoter) 최적화를 진행하였으며, 그 결과, nCas9(D10A)-PmCDA1-UGI의 발현은 다소 감소되었지만 편집 효율은 단일, 이중 유전자 비활성화 목표 서열에 대해 94%, 31%의 효율까지 향상될 수 있었다. 해당 결과는 염기 편집 모듈의 적정 발현량의 필요에 대해 시사한다.

3.3. 아스페르질루스 니게르(Aspergillus niger)

A. niger는 사상성 진균(Filamentous fungi) 생물학 연구나 단백질, 유기산을 포함한 다양한 화합물 생산의 모델 균주다. CRISPR/Cas 시스템의 개발은 해당 균주의 유전자 조작을 가속화시킬 수 있었으나, 동시에 2개의 유전자만을 조작할 수 있다는 점이나 트랜스포메이션 후 얻어지는 콜로니(Colony) 수가 제한적이라는 한계점을 가졌다. 따라서, 보다 편리하고 다중 유전자 편집이 가능한 방법이 절실히 요구되었다. Huang 외 연구진은 BE 기반 사이토신 편집 기술을 구축하였다. Aspergillus nidulans 유래의 Ptef 프로모터를 rAPOBEC1-nCas9(D10A)-UGI의 발현을 위해 활용하였고, Aspergillus oryzae 유래 U6 프로모터를 gRNA 전사를 위해 활용했다. 몇 가지 목표 서열에 대해 47%, 100%의 염기 편집 효율을 갖음을 확인할 수 있었다. 흥미로운 점 중 하나는, 해당 시스템이 기존 동물 세포나 진핵 세포에서 5 염기 서열 정도의 작동 범위를 가지는 것과는 대조적으로, A. niger 내에서 8 염기 서열의 넓은 작동 범위를 가지는 것을 확인할 수 있었다는 점이다. 저자들은 이 차이가 종과 프로토스페이서에 따라 달라질 수 있기 때문이라 언급하였다.

4. 염기 편집 기술의 활용을 위한 생물정보학적 보조 도구

염기 편집 기술은 다른 미생물의 게놈 편집 기술들보다 손쉽게 이용되고 있지만, 아직까지 gRNA 디자인 및 시퀀싱 데이터 분석 과정은 많은 노력이 필요하다. 이에 염기 편집 기술을 보다 용이하게 만들어 줄 다양한 생물정보학적 보조 도구에 대해 정리해보고자 한다 (표 2).

 

표 2. 염기 편집을 위한 생물정보학 보조 도구.
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4.1. gRNA 디자인 도구

gRNA 디자인은 염기 편집 기술을 포함한 CRISPR 기반 게놈 편집 과정의 성패를 좌우하는 주요한 이슈가 되고 있다. gRNA 디자인에 따른 on-/off- target 변이 효율의 컴퓨터 기반 예측 도구들이 활용가능하지만, 염기 편집 기술에 직접적으로 적용 가능하기에는 어려움이 따른다. 이는, 염기 편집 기술의 종류나 작동 범위, 목표 서열의 위치와 같은 다양한 변수들이 고려되어야 하기 때문이다. Hwang 외 연구진은 ‘BE-Designer’라고 하는 BE를 위한 웹 기반 gRNA 디자인 툴을 제작하였는데, 다양한 PAM 특이성을 갖는 Cas 효소나 목표 게놈, 염기 편집 기술의 종류에 따라 이용할 수 있다. 또한, BE-Designer는 대체 가능한 gRNA를 정해진 범위 내에서 지정해주는 가하면 예측되는 off-target 영역 등의 다양한 유용한 정보를 제공해준다. Dandage 외 연구진은 유연하게 gRNA 라이브러리를 제작할 수 있게 해주는 ‘Beditor’라는 도구를 소개한 바 있다. 해당 도구는 다양한 종에 따라 원하는 핵산, 아미노산 변이와 위치를 위해 gRNA를 디자인해준다. 특히, Beditor는 ‘priori’라고 하는 지수를 도입하여 off-target을 낮추고 가장 높은 효율의 작동 범위를 가지게끔 gRNA를 디자인하는데 참고할 수 있게 하였다.

일부 생물정보학 도구는 염기 편집의 특이적 활용을 위해 개발되었다. 사이토신 편집의 경우, 지금까지 종결 코돈의 도입을 통한 특정 유전자의 비활성화를 위해 가장 많이 활용되어 왔는데, 이 과정에서 비활성화를 위한 종결 코돈의 종류를 포함한 gRNA의 디자인 및 선택이 굉장히 까다로운 일이었다. Wang 외 연구진은 이 과정에서 손쉽게 이용 가능한 ‘gRNAs for Base Editor-Mediated Inactivation of Genes (gBIG)’이라는 도구를 제작하였다. 이용자는 PAM 서열과 염기 편집 기술의 종류, 원하는 편집 게놈 서열을 선택가능한데, FASTA 형식의 파일만이 분석을 위해 이용될 수 있다. Non-sense 돌연변이의 도입을 통한 진핵 생물 종 내 유전자 비활성화(CRISPR-STOP, iSTOP의 경우에도 선보인 바 있다. Billon 외 연구진은 S. cerevisiae를 포함한 8가지 진핵 생물 종에 대해 iSTOP을 위한 gRNA 온라인 데이터베이스를 제공한다.

4.2. 시퀀싱(Sequencing) 데이터 분석 도구

Sanger sequencing, next-generation sequencing (NGS)을 포함한 DNA 시퀀싱 기술은 염기 편집 효율을 결정하는 데 필수적이다. 염기 편집 효율을 결정하는 한 가지 방법은 평면 한천(Agar plate)에 콜로니를 얻고 그 중 일부 개별 서열을 분석하는 것인데, 이는 굉장히 시간과 돈이 많이 들 뿐더러, 부정확하다. 이에 대해, 염기 편집 과정 이후 얻어진 세포 군집의 유전자를 직접적으로 증폭하여 Sanger sequencing을 진행하고 컴퓨터 기반의 효율을 계산하는 방법이 대안으로 생각될 수 있다. 최근에 개발된 ‘EditR’이라는 프로그램은 fluorescence Sanger sequencing 결과를 기반으로 빠르고 쉽게 분석해주는데, 이 때 AB1 파일과 목표 유전자의 일부 서열(15-24 bp) 정보가 필요하며, gRNA 프로토스페이서 크로마토그램(chromatogram)과 위치당 예상되는 변이 효율을 포함한 다양한 정보를 얻을 수 있다. 이러한 방법은 가장 빠르게 결과를 분석할 수 있다는 점은 장점이지만, 정확도가 아주 높지는 않다. 비슷하게, ‘Base Editing Evaluation Program (BEEP)’이나 ‘Base Editing Analysis Tool (BEAT)’이라고 하는 도구를 활용할 수 있다.

여러 한계점을 고려할 때, NGS가 가장 정확하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다. Hwang 외 연구진은 BE-Analyzer를 개발하였는데, 이는 다양한 NGS 데이터 파일을 변이 효율, 패턴을 포함한 정보들을 한 눈에 확인 가능한 결과로 변환 시켜 준다. 비슷하게, Clement 외 연구진은 CRISPResso2를, Bruyneel 외 연구진은 AlleleProfileR을 개발한 바 있다.

5. 결론 및 향후 기술 전망

염기 편집과 관련하여 다양한 기술이 소개되었고 여러 종의 미생물에서 적용 가능했지만, 아직까지 몇 가지 한계점이 존재한다. 첫 번째는 정확도 관련 이슈다. 아데닌 편집은 높은 정확도를 갖는 반면 사이토신 편집의 경우 티아민이 아닌 다른 염기를 갖는 사례가 상당수 관찰되었다. 또한, 작동 범위 역시 3-5 bp 정도로 보고 되고 있다. 이러한 정확도를 높이기 위해, UGI 발현을 높이거나 탈아미노효소의 개량을 통해 작동 범위를 줄이는 방법이 활용될 수 있다 (그림 2B). 한편, 정확도가 낮다는 점 자체는 다양한 유전자 변이를 얻는 데나 다양한 유전자의 비활성화에는 유용히 활용될 수 있다. 최근 개발된 이중 염기 편집 기술(Dual base editor)의 경우, C-T, A-G의 동시 변이가 가능하여 다양한 변이를 만드는 데 적용되고 있다.

두 번째 한계점은 CRISPR/Cas 시스템 및 탈아미노효소에 의한 off-target 변이에 대한 이슈다. 물론, off-target RNA 돌연변이의 경우 후세대에 전해지지 않는다는 점에 크게 중요치 않을 수 있지만, DNA의 경우 후세대에 그 형질이 보존되어 전해질 수 있기 때문에 되도록 off-target 변이를 줄이는 것이 필요하다. gRNA 디자인 도구를 활용한 off-target 변이의 저감과 높은 정확도의 Cas 효소를 활용하는 것은 이러한 측면에서 해결책이 될 수 있다.

세 번째는 Cas 효소의 PAM 인식 서열에 의해 편집 목표 서열에 제한이 있다는 점이다. 해당 문제에 대해서는 Cas 효소의 개량을 통해 어느 정도 해결 가능함을 보인 바 있다. 더욱이, 최근에는 두 연구진에서 거의 PAM 서열에 의존하지 않는 Cas9 효소들(near-PAMless Cas9 variants)을 보고 한 바 있고 이는 염기 편집 기술의 폭 넓은 활용을 가능케 할 수 있을 것이다.

네 번째는 퓨린(Purine)과 피리미딘(Pyrimidine) 사이 상호 변이를 포함하는 transversion 기능을 수행하는 새로운 염기 편집 기술의 개발이 필요하다는 점이다. Gajula는 C-G transversion을 위한 염기 편집 기술 모델을 제시하였는데, 해당 모델에서는 UDG가 CBE와 합쳐져 사이토신 탈아미노과정에서 생기는 우라실을 제거한다. 그 결과 만들어진, apurinic/apyrimidinic (AP) site는 translesion synthesis polymerase인 Rev1에 의해 복구되는 과정에서 C-G transversion이 일어나게 되는 원리다. 하지만, 이러한 모델은 아직 실험적으로 검증되지 않았다.

마지막으로, 외부 DNA 절편의 도입에 관한 문제다. 화학적, 전기적 트랜스포메이션 방법은 광범위하게 이용되지만, 높은 효율을 갖는 수용성 셀(Competent cell)이 필요하다는 점에 몇 미생물에서는 이용되기 힘들다. Brophy 외 연구진은 최근 Bacillus subtilis 유래 컨주게이션(Conjugation) 관련 효소, ICEBs1를 활용한 컨주게이션 방법을 제시한 바 있고, 잘 알려지지 않은 박테리아 종들에 대해 효율적인 DNA 전달을 보여, 컨주게이션의 잠재성을 보인 바 있다.

이러한 한계를 극복한다면, 염기 편집 기술은 종과 변이 위치에 큰 구애를 받지 않고 다양한 핵산 변이에 활용될 수 있을 것이다. 다른 게놈 편집 기술과 달리 염기 편집 기술은 용이하게 활용될 수 있다는 점에 high-throughput 혹은 자동화 게놈 편집(Automatic genome engineering)에도 활발히 활용될 수 있을 것이다. 실제로 high-throughput, 자동화 게놈 편집과 관련하여 C. glutamicum의 유전자 비활성화 라이브러리 구축이 이루어진 바 있다.

 

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노명현(2020). 미생물의 염기 편집 기술(Base editing): 효과적인 미생물 게놈 편집. BRIC View 2020-R37. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3634 (Nov 12, 2020)
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