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현미경(공초점 현미경, 전자 현미경, 정량 위상 현미경)을 활용한 최근 기술 동향
현미경(공초점 현미경, 전자 현미경, 정량 위상 현미경)을 활용한 최근 기술 동향 저자 김혜진 (Tomocube, Inc.)
등록일 2020.09.01
자료번호 BRIC VIEW 2020-T30
조회 1393  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
생명 현상의 이해를 위해서는 눈에 보이지 않는 단백질 수준의 규명이 필요하다. 그래서 많은 과학자들은 눈에 보이지 않는 미시의 세계를 관찰하기 위해 현미경 기술을 발달시켜오고 있다. 본 보고서에서는 현재 생명과학 연구 분야에 많이 이용되고 있는 공초점 현미경(Confocal microscope), 투과 전자 현미경(Transmission electron microscope)과 주사 전자 현미경(Scanning electron microscope) 그리고 정량 위상 현미경의 특징과 응용 분야에 대해서 살펴보았다. 공초점 현미경은 형광으로 표지된 시료를 정확한 초점으로 영상화 함으로써 시각적으로 아주 예쁜 이미지를 만들어 낼 수 있다. 하지만, 광원으로 가시광선을 이용하기 때문에 해상도가 120 nm 정도라는 분해능의 한계와 형광으로 표지를 해야 한다는 단점이 있다. 전자 현미경은 1 nm 이하의 분해능을 가져 아주 미세한 구조까지 시각화 할 수 있다는 장점이 있지만, 광원으로 전자빔을 사용하기 때문에 현미경의 내부를 진공으로 유지해야 하고 살아있는 시료를 관찰하는 것은 불가능하다. 최근에 상용화된 정량 위상 현미경은 살아있는 세포를 형광 물질 등의 전처리 없이 있는 그대로 관찰하고 정량화할 수 있다는 장점이 있지만, 시료를 둘러싸고 있는 매질과 시료의 투명성에 의존한다는 한계가 있다. 연구자들은 이런 광학계들의 특징과 장단점을 잘 이용하여 수행하고 있는 연구에 가장 적합한 현미경을 선택하여 실험에 이용해야 한다. 또한, 각 현미경의 단점과 한계를 극복하기 위한 연구들이 많이 진행되고 있으니 멀지 않은 시점에 시료의 한계가 없는 초고분해능 현미경의 개발을 기대해 보아도 좋겠다.
키워드: Imaging, Microscope, Confocal microscopy, SEM, TEM, QPI
분야: Biotechnology

목 차

1. 서론
2. 공초점 현미경(Confocal microscopy)
  2.1. 공초점 현미경의 원리(광학계)
  2.2. 공초점 현미경의 장점
  2.3. 공초점 현미경의 한계
  2.4. 주요 개발사와 제품
  2.5. 공초점 현미경을 이용한 연구분야
3. 전자 현미경(Electron microscopy)
  3.1. 전자 현미경의 원리
  3.2. 전자 현미경의 종류
  3.3. 전자 현미경의 장점
  3.4. 전자 현미경의 한계
  3.5. 주요 개발사와 제품
  3.6. 전자 현미경의 이용 분야
4. 정량 위상 현미경(Quantitative phase imaging)
  4.1. 정량 위상 현미경의 원리
  4.2. 정량 위상 현미경의 장점
  4.3. 정량 위상 현미경의 한계
  4.4. 주요 개발사와 제품
  4.5. 정량 위상 현미경의 이용 분야
5. 영상 분석 도구
  5.1. Image J and Fiji (Fiji Is Just ImageJ)
  5.2. CellProfiler
  5.3. Imaris
6. 결론
7. 참고문헌


1. 서론

세포의 영어 명칭인 ‘Cell’은 1665년 로버트 훅(Robert hooke, 1635-1703)이라는 영국의 과학자가 자신이 개발한 현미경을 통해 코르크의 구조를 관찰하면서 본인의 저서인 ‘마이크로그라피아(Micrographia)’에서 최초로 사용한 용어이다. 로버트 훅은 이 책에서 바늘의 끝, 비단, 유리, 모래 등과 같은 무생물과 물고기의 비늘, 곤충의 눈과 다리, 날개 등의 동물 그리고 곰팡이와 이끼 등에 이르는 생물을 관찰한 내용을 담았다. 그중 코르크를 현미경으로 관찰하여 본 모습이 벌집과 같은 작은 방이 모여 있는 구조를 가졌다고 하여 “세포(cell)”라는 이름을 붙이게 되었고, 지금까지 생물체의 기본 단위를 부르는 명칭이 되었다.

‘세포(cell)’라는 이름의 유래에서도 알 수 있듯이 현미경 기술의 발달은 생물학의 발전에 중요한 역할을 했다. 과학자들은 눈에 보이지 않는 작은 물체와 생명 현상을 보고 싶어 하는 호기심으로 현미경이라는 발명품을 만들어 냈고, 1590년경 네덜란드의 안경 제작사인 자카리아스 얀센(Zacharias Janssen, 1585-1632)은 지금의 현미경 형태의 대물렌즈와 접안렌즈가 결합되어 있는 복합현미경을 만들어 내게 되었다. 과학자들은 렌즈가 가지는 구면수차와 색수차의 한계를 극복하는 방법을 고안해 내며 해상도가 높은 현미경을 개발하게 된다. 하지만, 살아있는 생물체를 관찰할 수 있는 유일한 방법인 광학 현미경에도 어쩔 수 없는 ‘회절한계’라는 해상도의 한계가 있었다. 1873년 에른스트 아베가 광학현미경의 공간분해능의 한계는 관찰에 사용되는 빛의 절반이라고 정의하였다. 즉, 가시광선을 광원으로 이용하는 광학 현미경의 해상도는 200 nm가 한계라고 여겨졌다.

광학 현미경의 해상도의 한계를 극복하기 위해 많은 과학자들이 다양한 시도를 하였는데, 가시광선보다 더 짧은 파장을 가진 파동을 광원으로 이용한 현미경을 만들고자 하였다. 1926년 독일의 한스 브루슈(Hans Brush, 1884-1973)가 전자렌즈(Electromignetic lens)를 개발하면서 전자 현미경의 역사가 시작되었다. 1931년, 독일의 에른스트 루스카(Ernst Ruska, 1906-1988)와 막스 놀(Max Knoll, 1897-1969)이 전자를 진공 속에서 가속시킴으로써 가시광선의 파장의 10만 분의 1에 이르는 짧은 파동을 만들 수 있다는 사실을 발견하였고 이러한 전자의 성질을 이용한 전자현미경의 프로토타입을 만들게 되었다. 1931년 최초의 전자 현미경인 투과 전자 현미경(TEM, transmission electron microscope)가 개발되게 되고, 시작 시점의 해상도는 광학현미경에도 못 미치는 수준이었으나 꾸준한 기술 개발로 1939년에는 상용화된 전자 현미경을 제작하게 된다. 투과 전자 현미경은 전자를 가속한 전자빔이 얇게 자른 시료를 통과하면서 형광 스크린에 상을 맺어 보여주는 원리이다. 이 때문에 100 nm 수준의 얇은 시료만 관찰한다는 한계가 있었다. 이런 투과 전자 현미경으로 잘 관찰할 수 없는 두꺼운 시료를 관찰하고 싶었던 과학자인 벨기에의 만프레드 본 아덴(Manfred von Ardenne, 1907-1997)은 1937년 주사 전자 현미경(SEM, scanning electron microscope)을 개발한다. 주사 전자 현미경은 전자빔으로 시료의 표면을 쏘일 때 시료로부터 튕겨져 나온 전자를 측정하여 스크린에 이미지를 표현하는 방식이다. 이렇게 가시광선 대신 전자빔을 사용하는 전자 현미경의 개발로 원자 수준의 관찰이 가능하게 되었다.

하지만, 전자 현미경은 회절 한계를 극복하기 위해 광원을 전자빔으로 대신하게 되면서 진공상태에서만 시료를 관찰할 수 있다는 단점을 가지게 된다. 생체 분자들은 진공 상태에서 물이 증발하고 구조가 붕괴되기 때문에 이것은 치명적인 한계가 되었고, 살아있는 생명체 그대로를 관찰할 수 있는 해상도의 한계는 여전히 200 nm라고 여겨졌다.

과학자들은 살아있는 투명한 시료를 관찰하기 위해 광학계의 개발을 거듭하였고, 세포 소기관의 굴절률 차이에 의해 생기는 위상의 차이를 명암으로 나타낸 위상차 현미경(Phase contrast microscope)과 이보다 조금 더 확실한 명암의 차이를 나타내 주는 차등 간섭 현미경(Differential interference contrast microscope, DIC)을 발명하였다. 이러한 광학 현미경의 거듭된 발전에도 위상차로만 세포의 내부 구조를 구별하기에는 어려움이 있었다. 그러던 중 형광 단백질의 발견이 해결책이 되었다.

일본의 과학자 시모무라 오사무(1929-2018)는 해파리의 한 종인 Aequorea Victoria의 형광 물질을 연구하던 중 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)을 처음 발견하게 되었다. 그 후 단파장을 쪼이면 녹색 형광을 내는 이 단백질의 DNA 정보가 밝혀 진 뒤, 238개의 아미노산으로 이루어진 이 단백질을 유전공학 기법으로 조작하여 많은 생명 현상들을 형광 단백질로 표지하여 관찰하게 된다. 과학자들은 여러 종류의 형광 단백질을 개발하게 되고 이는 형광 현미경을 통해 관찰되어 세포 안에서 일어나는 아주 작은 일들을 여러 색의 형광으로 표시할 수 있게 되었다.

널리 이용되던 형광 현미경(Wide field fluorescence microscope)의 한계를 극복하기 위해 1957년 마빈 미스키(Marvin Lee Minsky, 1927-2016)는 공초점 현미경(Confocal microscope)을 발명한다 [1]. 현재까지 널리 이용되고 있는 공초점 현미경은 형광 현미경과 원리는 같으나, 시료를 관찰할 때 조사범위가 좁은 레이저 광원을 사용하며 핀홀(pinhole)이 광전 증폭관(photomultiplier tube, PMT) 앞에 있어서 초점이 맞지 않는 곳의 빛을 차단하게 된다. 따라서 초점 거리에 일치하는 영상만 선택적으로 얻어내기 때문에 영상의 해상도가 증가하게 된다. 이를 응용하여, 초점 거리를 일정하게 변화시킴으로써 3차원 영상을 만들어 내는 기술도 발전하게 되어 생명과학뿐만 아니라 재료과학 및 나노과학 분야에도 사용되고 있다.

형광단백질을 이용한 광학 기술은 점차 발전하여 초고해상도 현미경(Super resolution microscope) 기술들을 개발하게 된다. 초고해상도 현미경을 이용하면 10 nm의 해상도로 생명체를 관찰할 수 있는 시대가 되었다. 하지만, 현미경마다 강점이 있다면 분명히 한계점도 존재하고 있다. 물리학자들이 개발한 이 엄청난 발명품들 속에서 우리의 목적에 맞는 현미경을 올바르게 선택하고 가치 있게 이용해야 한다. 본 리포트에서는 공초점 현미경과 전자 현미경이 현재 시점에서 가지는 기술적 위치를 살펴보고 이를 통해 어떤 분야에서 응용되고 있는지 살펴보고자 한다.

2. 공초점 현미경(Confocal microscopy)

2.1. 공초점 현미경의 원리(광학계)

공초점 현미경은 그 이름에서도 알 수 있듯이 초점을 한 곳에서 공유하여 하나의 상을 만들어 내는 현미경이다. 공초점 현미경의 광원으로는 레이저가 사용되며, 레이저가 다이크로익 미러(Dichroic mirror)를 비추면서 특정한 파장의 빛만 반사되게 되고 반사된 빛은 대물렌즈(Objective lens)를 통해 시료로 들어가게 된다. 이 때 정확한 초점의 빛만이 시료로부터 반사되어 핀홀의 구멍을 통과하게 되고 핀홀을 거친 빛만이 검출기(Detector)에 모이게 되므로 우리는 공간상에서 정확하게 초점이 맞는 한 점을 검출할 수 있게 된다. 정확한 초점을 볼 수 있게 만들어진 공초점 현미경의 장점과 기술적인 한계에 대해 살펴보고자 한다.

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그림 1. 공초점 현미경.

 

2.2. 공초점 현미경의 장점

2.2.1. 고해상도

앞서 공초점 현미경의 원리에서 설명하였듯이, 공초점 현미경은 시료에서 초점이 맞는 부분의 상을 얻어낼 수 있다. 따라서 두꺼운 시료를 관찰한다고 하더라도 초점이 정확히 맞는 점의 영상을 획득할 수 있고 초점이 맞지 않는 배경 부분의 신호는 지워서 보이지 않는다. 그래서 깨끗하고 선명한 영상을 얻을 수 있으며 실제로 해상도는 XY 평면으로 180-250 nm, Z 축으로 500-700 nm 정도이다 [2].

2.2.2. 두꺼운 시료의 관찰

공초점 현미경은 형광을 발광하는 시료의 형광 신호를 인식하기 때문에 시료의 두께에 대한 한계가 크지 않다. 실제로 100 µm 이상의 두꺼운 시료에서도 초점이 맞는 얇은 섹션을 만들어 낼 수 있게 때문에 시리얼 섹션을 통해서 두꺼운 시료로부터 정보를 입체적으로 쌓을 수 있다. 각 XY 평면들은 현미경에서 제공하는 소프트웨어를 통해서 3D 입체 영상으로 구현할 수 있어 두꺼운 배아 샘플이나 오가노이드, 스페로이드 샘플의 입체적인 모양과 내부의 구조까지 고해상도로 관찰할 수 있다는 장점이 있다.

2.2.3. 사용성 용이

위상차 현미경과 형광 현미경에서 사용하던 실험 방식을 크게 바꾸지 않아도 된다는 장점이 있어 실험자들이 공초점 현미경 관찰을 위한 프로토콜을 따로 생성하지 않아도 된다는 장점이 있다. 최상의 조건에서 영상을 얻기 위해 대물렌즈에 닿는 시료의 표면이 두께 0.17 mm의 유리로 된 커버슬립 이어야 한다는 조건을 제외하면 형광 현미경과 시료 제작의 방법이 비슷하다. 그리고 고정된 시료와 살아있는 시료 모두를 관찰할 수 있고 조직 절편 슬라이드까지 관찰할 수 있기 때문에 시료 준비의 제약이 적은 편이다.

또한 현미경 기술이 발달한 만큼 제조사에서 이미지 획득에 이용되는 소프트웨어도 사용자 편의성에 맞추어 개선해 나가면서 기계를 다루기 어려워하는 실험자들도 쉽게 접근할 수 있다는 장점 또한 공초점 현미경이 널리 사용되고 있는 이유라고 생각된다.

2.2.4. 미세 현상 관찰 가능

공초점 현미경은 형광 신호를 관찰할 수 있기 때문에 형광 물질이 달려있는 2차 항체를 이용하는 면역 염색 방법이나, 세포에 직접 형광 단백질이 발현하는 플라스미드(plasmid)를 형질 주입(transfection)하는 방법을 이용해서 시료를 준비하게 된다. 이 방법들을 이용하면 세포 내의 단백질에 형광이 표지 되고 실험자는 세포 내에서 단백질의 형상을 공초점 현미경을 이용하여 관찰할 수 있다. 현재 공초점 현미경으로 4가지 레이저 라인(Laser line)을 사용하여 6개의 다른 형광 색을 관찰할 수 있다고 알려져 있으나 [3], 많이 사용되는 색은 파란색(Excitation laser: 405 nm), 녹색(488 nm), 빨간색(633 nm)의 세 가지 색 조합이다. 연구자들은 적어도 세 가지 색의 조합을 이용하여 단백질 수준의 작은 변화를 관찰할 수 있다.

2.3. 공초점 현미경의 한계

2.3.1. 파장수의 제한

공초점 현미경은 레이저를 광원으로 사용하는데 일반적인 레이저에서 이용 가능한 흥분 파장(excitation wavelength)의 숫자는 매우 제한적이어서 제한된 수의 레이저 라인만을 이용할 수밖에 없는 단점이 있다. 앞서 6가지의 다른 형광 색을 구별할 수 있다고 언급했으나, 시료의 특성과 보고자 하는 물질의 특성에 따라서 6개의 색으로 구별하기는 어려운 실험이 많기 때문에 일반적으로 세 가지 이하의 색만 관찰할 수밖에 없다는 단점이 있다. 즉 실험자가 4가지 이상의 단백질을 구별하고 싶다면 한가지 시료에서는 보기 어렵기 때문에 두 번의 실험을 해야 한다.

2.3.2. 광독성과 광표백(Phototoxicity and photobleaching)

형광 신호를 관찰하기 위해서는 형광 염색을 하거나 형질전환이나 형질 주입 방법을 이용하여 세포에 형광이 달린 유전자를 발현 시켜 관찰하여야 한다. 이 과정에서 살아있는 세포에는 전처리 과정에 따른 세포 독성이 발생할 수 있다. 또한 관찰하는 과정에서 레이저에 노출된 세포는 레이저에 의한 열 발생, 광산화(photo oxidative)에 의한 세포 손상 등 광독성에 의해 손상을 입을 수 있고, 이로 인한 예상치 못한 부작용의 위험을 항상 감수해야 한다. 그리고 레이저에 오래 노출되게 되면 형광물질이 빛에 의하여 광화학적 변성을 일으켜 형광 신호를 잃어버리게 되는 광표백 현상이 일어날 수 있다. 고정된 시료의 형광을 관찰할 때 레이저의 세기를 높이거나, 노출 시간을 길게 하면 광표백 현상에 따른 형광 신호 감소가 관찰된다. 따라서 공초점 현미경으로 형광 신호를 관찰할 때에는 레이저의 세기와 노출 시간을 잘 조절하여 세포가 최대한 손상을 적게 받을 수 있게 실험해야 한다.

2.3.3. 정량 분석이 어려움

형광 염색과 형질 주입을 통한 형광 신호의 세기는 실험할 때 마다 변동의 폭이 크다. 또 촬영 조건과 시료의 상태가 항상 같게 유지될 수 없기 때문에 실험 간의 정량적인 비교를 하기가 힘들다. 최근에는 형광 신호를 렌더링(rendering)하여 면적과 신호세기 등의 정량 정보를 얻을 수 있는 소프트웨어들이 많이 개발되었지만, 대조군이 잘 정립된 상태에서 실험군 간의 비교를 하여야 한다. 그리고 형광 신호 증폭으로 만들어진 수치들과 실제 값은 차이가 있을 수 있다는 것을 염두 해 두어야 한다.

2.4. 주요 개발사와 제품

1987년에 Bio-Rad laboratories 사에서 처음 상업화 공초점 현미경인 MRC 500을 출시한 이래로 2020년까지 공초점 현미경 시장은 점차 확장되고 있다. 현재까지 많이 이용되고 있는 공초점 현미경 제작사와 주요 제품을 소개하고자 한다. 주요 회사는 Olympus, Nikon Instruments, Leica Microsystems and Carl Zeiss MicroImaging 네 곳이며 주요 제품과 세부 특징을 표 1에서 소개하고자 한다.

 

표 1. 공초점 현미경의 주요 개발사와 제품.
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2.5. 공초점 현미경을 이용한 연구분야

2.5.1. 암 연구

암은 인류가 가장 정복하고자 하는 질병이다. 그만큼 전 세계의 많은 연구자들이 연구하고 있는 분야이다. 특히 이미징은 암 연구의 핵심 도구 중의 하나이다. 형광 염색을 통한 이미징은 여러 다른 종류들로 이루어진(heterogeneous) 암세포의 특징을 관찰하기에 아주 적합한 방법이다. 그리고 공초점 현미경의 높은 분해능으로 암세포의 증식과 이동, 전이에 관계되는 단백질을 형광 표지로 구별할 수 있게 되었고 분자적 특성을 알아낼 수 있게 되었다. 최근에는 라이브 이미징의 기술이 발달하게 되면서 안정된 상태에서 살아있는 세포에서 일어나는 변화를 관찰하는 방법이 널리 응용되면서 암 연구의 발전에 크게 기여하고 있다. 형광을 이용한 면역염색법이 발달함에 따라 발표되고 있는 많은 논문에 공초점 현미경을 이용한 연구 결과들이 실리고 있다. 최근에 발표된 연구로 폐암세포(non-small cell lung cancer, NSCLC)에서 발현하는 nuclear protein kinase Cδ (nuclear PKCδ)의 위치를 공초점 현미경을 이용해서 확인하였고, 신호 세기를 비교하여 항생제 저항성을 획득한 세포 클론들의 특성을 분석하였다 [4]. 암 연구에서 공초점 현미경은 세포뿐만 아니라 조직 관찰에도 많이 이용되고 있는데 최근에 교모세포종(glioblastoma)의 계층화 분석을 통해 세포 혈통 하위 유형에 따라 약에 대한 민감성이 달라진다는 보고가 있었다. 이 연구에서도 쥐의 교모세포종에 발현하는 유전자 마커들을 확인하기 위해 면역염색법이 사용되었고, 염색된 조직을 공초점 현미경으로 관찰하여 교모세포종의 하위 유형을 분류하였다 [5].

2.5.2. 오가노이드(organoids)와 스페로이드(spheroids)

연구자들은 실험실의 시험관 안에서 수행하는 연구들이 실제와 유사한 환경에서 일어나기를 원한다. 그래서 끊임없이 생체환경을 모방하는 세포를 만들어 왔고 오늘날 많은 실험실에서 오가노이드와 3차원 세포 배양법을 이용하여 약물 스크리닝, 생장 실험, 조직 재생, 분자의 특성 분석 등의 다방면의 실험에 이용하고 있다. 이런 입체적인 세포 덩어리를 관찰하기 위해 공초점 현미경이 많이 사용되고 있다. 오가노이드나 스페로이드 샘플은 부피가 크지만 샘플을 고정할 수 있고 면역 염색이 가능하다. 때로는 더 잘 보기 위하여 투명화 작업을 거치거나 절편으로 제작하여 해상도를 높이는 방법도 가능하다. 하지만, 공초점 현미경의 장점에서 앞서 설명하였듯이 초점이 맞는 부분의 단면을 영상을 얻어낼 수 있고 이것을 z 축 방향으로 연속된 이미징을 하여 3차원 영상을 배경을 제거하고 얻을 수 있기 때문에 공초점 현미경은 오가노이드와 스페로이드의 관찰에 많이 이용된다. 올해 전 세계인을 감염병의 공포로 몰아넣은 코로나바이러스를 연구하는 연구팀이 장 오가노이드를 이용하여 SARS-CoV-2의 감염 모델을 만들어 발표했다. 장 오가노이드의 형광 염색을 통해 코로나바이러스가 장 벽의 enterocytes에 증식된다는 것을 공초점 현미경을 통해 밝혀내었다 [6].

2.5.3. 신경과학

신경계는 매우 복잡한 구조로 얽혀 있어 신경계를 이해하기 위해서는 고해상도의 이미징이 가능한 공초점 현미경이 한 가지 해결책이 될 수 있다. 알츠하이머나 파킨슨병과 같은 신경계 질환의 치료법을 찾기 위해서 세포 수준과 세포 소기관의 영상을 얻을 수 있는 공초점 현미경을 이용한 이미징이 많이 이용되고 있다. 특히 광유전학(optogenetics) 기법이 신경계의 연구에 활발히 이용되고 있다. 광유전학은 광학과 유전학이 접목된 실험 기법으로 빛으로 생체 내의 유전자 발현을 조절하는 방법이다. 특히 유전자 조작으로 빛에 의해 반응하는 ion channel을 가진 신경 세포를 발현하는 쥐를 만들고 살아있는 상태의 신경계를 연구하는 방법이 대표적이다.

최근에도 광유전학을 이용하여 살아있는 쥐의 gonadotropin-releasing hormone (GnRH) 신경에 luteinizing hormone (LH)이 유입되는 것을 막는 실험을 수행한 연구 결과가 있었다 [7].

2.5.4. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM)

형광의 수명은 형광 광자(fluorescence photon)를 방출하여 기저상태(ground state)로 돌아가기 전에 발형 광단(fluorophore)이 흥분된 상태로 얼마나 오래 머무는가를 나타내는 척도이다. 이 시간 분포는 지수 붕괴 함수로 설명할 수 있는데 형광 수명은 몇 피코 초에서 수십 나노 초 사이의 범위에 있다. 형광 수명은 각 형광 염료가 가지는 특징적인 매개 변수로, 형광 염료 주위의 미세환경과 구조적 상태에 따라 변할 수 있다. 수명 정보는 이온 농도, pH, 지방질, 다른 분자와의 결합과 같은 나노 환경의 지표가 된다. FLIM은 형광의 수명 측정과 공초점 현미경 영상을 결합한 방법으로 각 형광 염료의 수명이 픽셀 레벨에서 얻어지고 이것이 색상 영상으로 도출된다 [8].

FLIM은 영상 데이터를 측정하고 정량화 하는데 중요한 응용법이다. 수명 정보는 발형광단의 농도와는 무관하기 때문에 기능적 영상(functional imaging)에 매우 적합하다. FLIM은 전통적으로 이용되고 있는 분자의 위치와 농도 등의 기록을 넘어 분자 간의 상호작용, 기능 그리고 나노 환경의 측정을 가능하게 한다.

FLIM의 기술을 이용하여 ER-Golgi 네트워크에 존재하는 분자들을 규명한 연구가 최근에 발표되었다 [9]. 연구팀은 ER과 trans-Golgi 네트워크의 접촉 부위를 보기 위하여 전자 현미경 방법이 이용되어 왔으나, 이 구조가 핵 주위에 많이 뭉쳐서 존재하기 때문에 광학 현미경으로 분석하는 것뿐만 아니라, 메커니즘을 규명하는 것도 어려웠다. 그래서 FRET 방식을 기초로 FRET-FLIM 복합 분석법을 이용해 ER과 trans-Golgi 네트워크를 관찰하였다. 또한 자연 상태의 ER-trans-Golgi 네트워크의 접촉 부위의 분자들을 관찰함으로써 분자들의 특성을 규명하고 결과를 보고했다.

2.5.5. Fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS)

연구자들은 두 가지 단백질이 세포 내에서 서로 결합하는지 확인하기 위해 면역염색 방법을 이용하여 형광 색이 세포 내에서 겹쳐지는 부분을 찾고 co-localization 상수를 구하는 방법을 사용한다. 하지만, 이것은 물질이 서로 결합하는 직접적인 확인 방법은 되지 않는다. 세포 내에서 두 개의 분자가 서로 결합하는지 확인하는 방법 중 하나로 Fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) 방법이 사용되고 있다. 결합을 확인하고자 하는 두 유전자를 다른 형광으로 표지하여 발현하게 한 다음 녹색과 빨간색으로 표지된 두 분자의 상관관계를 계산함으로써 두 분자의 결합력을 계산하는 방법이다. 이 방법은 살아있는 세포에서 위치의 정보까지 얻을 수 있다는 장점이 있으며 주로 수용체(receptor)와 리간드(ligand)의 결합을 확인하는데 이용된다. 간암세포에서 막 단백질인 TM4SF5와 EGFR 그리고 Integrin의 결합을 확인하기 위해 FCCS 방법을 이용한 논문이 발표되었고, 연구팀은 살아있는 세포에서 세포의 이동 방향에 따라 결합 정도가 달라진다는 연구 결과를 보고하였다 [10].

3. 전자 현미경(Electron microscopy)

3.1. 전자 현미경의 원리(광학계)

전자 현미경이 일반 광학 현미경(공초점 현미경 포함)과 가장 다른 차이점은 광원으로 전자선(electron beam)을 사용한다는 점이다. 전자선을 사용하기 때문에 유리 렌즈 대신 전자렌즈를 사용하여 물체의 확대상을 만들게 된다. 작동원리는 광학현미경과 동일하지만, 전자선을 사용하기 때문에 전자의 에너지 손실과 예상치 못한 굴절을 막기 위하여 현미경의 내부는 진공상태로 유지되어야 하고 전자선의 필라멘트에서 방출된 일련의 전자들이 시료를 향하여 가속된다. 전자총으로부터 방사된 전자선은 집속렌즈(condenser lens)를 통해 시료의 면에 모아진다. 이 전자빔이 다시 자기장을 이용한 대물렌즈에 의해 시료에 초점을 형성한다. 투과 전자 현미경의 경우 시료를 통과한 상이 대물렌즈(objective lens)를 거쳐 투사 렌즈(projection lens)를 통해 한 번 더 확대되고 확대된 상은 형광스크린이나 필름을 통해 모이고 이것을 영상으로 출력하게 된다. 주사 전자 현미경의 경우는 집속렌즈와 대물렌즈가 차례로 전자선을 통과시키고 시료에 전달된다. 시료의 표면에서 반사되거나 반응하여 방출되는 2차 전자를 검출기로 모아서 상을 만들게 된다.

 

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그림 2. 투과 전자 현미경과 주사 전자 현미경.

 

3.2. 전자 현미경의 종류

전자 현미경은 광원으로 전자빔을 사용하는 현미경으로 검출 방식에 따라 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy, TEM), 주사 전자 현미경(Scanning electron microscopy, SEM), 반사 전자 현미경(Reflection electron microscope, REM), 투사 주사 전자 현미경(STEM), 저전압 전자 현미경(LVEM), 저온 전자 현미경(cryo-EM) 등이 있다. 전자 현미경은 뛰어난 분해능을 강점으로 생명과학 분야뿐 아니라 산업체에서도 이용이 늘어나면서 다양한 방식으로 진화되고 있다. 그 중 많이 이용되는 투과 전자 현미경과 주사 전자 현미경의 특징을 소개하고자 한다.

3.2.1. 투과 전자 현미경(TEM)

투과 전자 현미경은 이름에서 알 수 있듯이 시료를 투과시킨 전자선을 광학계 안의 세 가지 전자 렌즈(집속, 대물, 투사렌즈)를 통해 확대하여 관찰하는 현미경이다. 투과 전자 현미경의 배율은 범위가 100배에서 100만 배 정도 되며 해상도는 광학 현미경에 비해 1,000배 정도 향상된 약 0.2 nm이다. 뛰어난 해상도로 세포 내의 소기관까지 아주 자세히 관찰할 수 있지만, 전자는 가시광선에 비해 투과성이 떨어지기 때문에 세포의 관찰을 위해서는 시료를 아주 얇게 절편으로 제작하여야 한다. 보통 20-60 nm의 두께로 절편을 제작하게 된다. 또한 얇은 시료를 투과 전자 현미경으로 영상화하기 위해서는 시료의 안정화가 필요하기 때문에 오스믹산(osmic acid), 과망간산(permanganate), 우라늄(uranium) 등의 염료를 이용해 표면 처리를 해야 한다. 이 염료들은 원자량이 큰 원자들로 구성되어 있어 전자를 산란시키게 되고 보다 대비가 뛰어난 영상을 얻을 수 있게 된다. 아주 얇은 절편의 시료를 관찰하기 때문에 평면적인 영상만 얻을 수 있으며 내부의 구조를 자세히 알고 싶을 때 주로 이용된다.

3.2.2. 주사 전자 현미경(SEM)

투과 전자 현미경이 평면의 영상을 얻을 수 있는 반면 주사 전자 현미경은 시료의 입체적인 3차원 영상을 관찰하기 위해 이용된다. 전자총(Electron gun)으로부터 1-100 nm 정도의 미세한 전자선이 나와서 시료의 표면을 x-y 방향으로 주사하여 시료의 표면에 2차 전자를 발생시킨다. 2차 전자의 양은 표면의 물질과 표면의 굴곡에 비례하기 때문에 2차 전자를 검출하여 시료의 표면에 대한 미세한 확대상을 얻을 수 있다. 주사 전자 현미경은 최소 15배부터 최대 10만 배의 넓은 범위의 배율을 가지고 있고 렌즈를 교환하지 않고 코일에 흐르는 전류를 변화시켜 배율을 조절할 수 있다는 장점이 있다. 보통은 저 배율부터 점차 상을 확대하여 원하는 부분을 가장 확대된 영상으로 얻는 방법을 사용한다. 분해능 또한 최대 1 nm까지로 알려져 있어 확대한 영상을 매우 깨끗하게 볼 수 있다. 주사 전자 현미경 관찰을 위해서는 시료에 금과 같은 중금속 막으로 얇게 코팅을 해야 한다. 금으로 코팅한 시료를 관찰 시 2차 전자의 발생 효율이 높아져서 선명한 상을 관찰 할 수 있다. 또한 전자빔이 시료에 직접 닿는 것을 방지하여 시료의 축소와 팽창을 막고 시료가 열에 견딜 수 있게 도와줄 수 있다. 그리고 시료의 표면만 관찰할 수 있지만, 입체적인 외부의 영상을 얻을 수 있다. 그래서 세포의 표면 정보나 복잡한 결합구조의 3차원 정보를 얻고 싶을 때 많이 이용되며 재료의 표면 정보가 중요한 산업체에서 검사 장비로 이용 범위가 확대되고 있다.

반도체/디스플레이 산업체에서 검사 장비로의 이용이 급증함에 따라 비파괴적 검사로 시료의 미세 단위 정보를 분석하고자 하는 수요가 늘고 있다. 이에 따라 수요가 늘고 있는 장비가 에너지 분산형 X선 분광분석기(Energy Disperse X-ray Spectrometer, EDS)이다. 에너지 분산형 X선 분광분석기는 주사 전자 현미경과 결합하여 사용하기 때문에 ‘SEM-EDS’라고 불린다. 주사 전자 현미경으로 시료를 관찰 시 전자빔이 시료에 쪼여지면 2차 전자 외에 후방 산란전자, 투과 전자, X선 등이 발생하게 된다. 에너지 분산형 분광분석법은 전자빔에 의해 시료 표면에서 발생되는 특성 X선의 신호를 검출하여 전자 신호로 바꾸어 주고, 이 전자 신호를 측정하고 X선 데이터를 해석하여 물질을 이루는 성분을 분석하는 기법이다. 에너지 분산형 X선 분광 분석기를 이용하면 측정 한계 이상의 농도로 시료를 구성하는 성분 중 수소 등 일부 원소를 제외한 화학 성분의 조성을 확인할 수 있고 그 구성 성분의 정량 분석을 할 수 있기 때문에 시료의 비파괴적 검사 방법으로 많이 사용되고 있다.

3.3. 전자 현미경의 장점

3.3.1. 높은 해상도

전자 현미경은 광원으로 전자빔을 사용함으로써 아베가 말한 공간 분해능의 한계인 200 nm가 깨어졌다. 가시광선을 사용하면 절대 불가능할 것 같았던 수 nm 단위의 해상도로 시료를 관찰할 수 있게 된 것이다. 투과 전자 현미경에서 설명하였듯이 전자 현미경은 최대 0.2 nm의 해상도를 가지고 아주 미세한 구조라도 구분할 수 있는 강력한 도구가 되었다.

3.3.2. 고품질의 영상

전자 현미경은 지금까지 발명된 어떤 광학계로도 흉내 내지 못할 고품질의 섬세한 영상을 만들어 낼 수 있다. 물론 숙련된 기술자가 영상을 획득해야 한다는 점이 있지만 역설하면 고도의 숙련된 기술자는 전자 현미경 시스템을 이용해 다른 현미경으로는 따라올 수 없는 차별화된 영상을 얻을 수 있다.

3.3.3. 다양한 분야에 적용

전자 현미경은 광학 현미경, 특히 공초점 현미경에 비해서 응용 분야가 다양하다는 장점이 있다. 공초점 현미경이 생명 현상을 연구하는 실험실에서 주로 이용되는 반면에 전자 현미경은 의약학뿐만 아니라 기술, 산업, 화학 분야로 그 적용 범위가 확대되고 있다. 응용 사례로는 반도체 검사, 컴퓨터 칩 제조, 품질 관리 및 보증, 원자 구조 분석에 이르기까지 다양하다 [11].

3.4. 전자 현미경의 한계

3.4.1. 진공 상태로 인한 시료의 변형

전자 현미경의 가장 큰 단점은 높은 해상도를 유지하기 위해 전자빔을 이용하기 때문에 현미경의 내부를 진공으로 유지해야 한다는 것이다. 현미경 내부가 진공 상태여야 하기 때문에 살아있는 세포는 당연히 관찰할 수 없고, 고정과 탈수 그리고 표면의 전처리 과정까지 거쳐야 한다. 그리고 주사 전자 현미경으로 관찰할 경우 시료를 얇게 잘라야 하는 어려움도 있다. 이러한 시료의 제약은 생물학적 상호작용을 제대로 관찰할 수 없게 하며 생물학적 연구에 있어 전자 현미경의 사용을 제한하게 된다.

3.4.2. Artefact

생물학 연구자들의 가장 큰 걱정은 실험 시 artefact를 최소화하는 것이다. 하지만 전자 현미경을 이용해 세포를 관찰하기 위해서는 복잡한 전처리 과정이 필요하고 artefact가 발생할 수 있는 가능성이 많아지게 된다. 따라서 전자 현미경을 위한 시료를 준비할 때에는 전문적인 지식으로 시료를 제대로 준비해야만 한다.

3.4.3. 흑백 영상

전자 현미경은 색상이 없는 회색조 영상을 제공하므로 다채로운 구별을 할 수 없다는 단점이 있다. 시각적 효과를 위해 소프트웨어를 이용하여 색을 입혀 보여주는 경우도 있다.

3.4.4. 낮은 접근성

전자 현미경은 현미경 중에서도 매우 고가에 속하는 장비이다. 물론 전자 현미경이 비교할 수 없는 뛰어난 해상도를 가지고 있지만, 개인 연구실에서 구비할 수 있는 예산의 수준을 벗어나는 것은 사실이다. 가격뿐만 아니라 장비의 부피도 매우 커서 접근성을 어렵게 하는 원인이 된다. 큰 크기 때문에 장비를 비치할 공간이 많이 필요하며, 매우 민감한 장비이기 때문에 주변에 장비가 있다면 그로 인한 자기장과 진동이 발생하여 전자 현미경의 작동을 방해할 수 있다. 그래서 독립된 공간까지 필요하기 때문에 ‘현미경 센터’, ‘이미징 코어’라고 불리는 전문적인 실험실에서 전자 현미경을 만날 수 있다. 또한, 전자 현미경을 이용해 영상을 잘 얻기 위해서는 수년간의 전문적인 훈련이 필요하기 때문에 접근성을 낮추는 요인이 된다.

3.5. 주요 개발사와 제품

국내 최초로 도입된 전자 현미경은 1958년 Hitachi가 경북대 안영필 교수에게 기증한 HM-3 모델이었다고 한다. 그 이후 1970년대부터 국내에서도 널리 사용되기 시작했으며 전자 현미경 시장은 세계적으로 매년 그 규모가 확장되고 있다. 특히 첨단 산업의 발달로 나노 융합기술, 반도체, 디스플레이, 신소재 산업까지 이용이 확대되고 있어 꾸준한 성장이 예상된다. 2008년 1조 8천억원의 규모를 가지던 전자 현미경 시장은 2017년에 3조 8천억원 규모의 시장으로 성장했다 [12]. 특히 주사 전자 현미경이 전자 현미경 시장의 성장을 주도하고 있는 것으로 분석되며 연 평균 성장률은 7.4%이다. 기술의 진보와 더불어 시료 준비 기법과 같은 편의성 증가가 전자 현미경에 대한 수요를 증가시키고 있으며 더불어 인공지능(AI)을 이용하여 영상으로부터 질병을 예측하는 기술이 발전함에 따라 시장의 발전은 앞으로 지속될 것으로 예상된다. Nikon Metrology Inc., Thermo Fisher Scientific, ZEISS, JEOL Ltd, Angstrom Advanced Inc., Hirox Europe Ltd., Hitachi High-Technologies Europe GmbH 등 많은 회사에서 전자현미경을 상용화하고 있다. 본문에서는 우리나라에서 많이 사용되고 있는 Hitachi, JEOL, ZEISS, FEI 사의 주요 제품을 표 2에서 소개하고자 한다.

 

표 2. 전자 현미경의 주요 개발사와 제품.
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3.6. 전자 현미경의 이용 분야

3.6.1. 재료 과학

재료 과학 분야에서 전자 현미경의 이용에 대한 중요성은 1970년에 국제 학회가 열릴 만큼 대두되었다. 2020년 대에 가장 주목받고 있는 분야 중 하나로 나노 공학이 있는데 나노 물질을 관찰하기 위해서는 전자 현미경을 이용해야 하기 때문에 재료 과학 분야에서 전자 현미경의 이용은 자연스러운 결과라고 할 수 있다. 실제로 재료 공학과 나노 기술 분야를 합치면 전자 현미경 이용 시장의 절반 정도를 차지한다. 주로 기능성 표면을 위한 전구 재료인 폴리스티렌(polystyrene) 구체의 금 나노 입자 관찰에 이용되고, 실리카로 이루어진 코발트 촉매를 고배율로 관찰한다거나 실리콘 표면의 나노 구조를 관찰하는데 이용된다. 금속이나 자석의 표면도 관찰할 수 있어서 자석의 표면 파열 조사나 리튬 이온 배터리 손상 조사 등에도 이용된다.

3.6.2. 생명 과학

2019년 중국 우한에서 시작되어 2020년에 대한민국을 비롯하여 전 세계가 COVID-19 바이러스로 인하여 전염병과의 전쟁 중이다. 코로나19 바이러스에 대한 백신, 항체를 만들기 위해 많은 연구팀들이 매진하고 있다. 바이러스는 그 크기가 광학 현미경으로 관찰할 수 없을 정도로 작기 때문에(직경 80-100 nm) 전자 현미경으로 박테리오 파지를 관찰하게 된다. 한국에서도 코로나 19가 유행하기 시작할 때 신문 기사의 자료 화면으로 감염자의 폐 세포 안에 있는 코로나 19 바이러스를 전자 현미경으로 관찰한 영상이 많이 사용되었다. 바이러스는 크기가 매우 작아 현재까지는 중합효소 연쇄반응으로 진단하고 있는데 전자 현미경이 바이러스로 인한 질병의 조기 진단과 바이러스 감염의 분석 도구로 이용될 수 있다는 연구가 진행 중이다 [13].

바이러스 외에도 뇌 조직의 절편이나 오가노이드의 단면 등 광학 현미경으로 볼 수 없는 해상도의 미세 구조를 관찰하기 위해 전자 현미경이 많이 이용되고 있다. 특히 저온 전자 현미경(Cryo-EM)은 세포나 수용액에 존재하는 고분자를 초저온 상태로 유지하고 전자 현미경으로 관찰하는 기술로 2017년 노벨 화학상 수상의 주인공이기도 하다. 저온 전자 현미경 기술은 구조 생물학에 많이 이용되며 구조 생물학 분야의 발전을 돕고 있다.

3.6.3. 반도체

반도체 생산 공정에서 회로 선폭의 두께는 기술의 발전으로 점점 얇아지고 있다. 삼성 전자의 경우 2019년 4월에 7나노 파운드리 제품을 출하하였고 5나노 공정을 개발하고 있다고 밝혔다. 그리고 2020년에는 3나노 공정까지 설계하고 있다고 한다. 파운드리란 반도체 설계를 전문적으로 하는 공장 없는 반도체 기업(팹리스; 퀄컴, 엔비디아, 애플 등)에서 설계도면을 받아 도면대로 대량 생산을 하는 사업이다. 파운드리의 핵심은 의뢰받은 설계 도면대로 얼마나 더 빨리 양질의 상품을 생산해 내는 가이며 이것은 회로 선폭의 미세함이 좌우한다. 회로 선폭이 미세할 수록 같은 크기의 웨이퍼(반도체 원재료)에서 더 많은 반도체를 생산할 수 있기 때문이다. 뿐만 아니라 미세 공정을 통해 생산된 칩은 작동할 때 저항으로 인해 발생하는 열을 줄일 수 있고 밀집도를 올릴 수 있어 고성능의 반도체를 만들 수 있다. 하지만, 회로 선폭이 미세해질수록 품질 검사 과정에서 미세한 회로를 검사해야 한다. 따라서 나노미터 단위의 검사를 위해서 전자 현미경은 반도체 산업에 필수적인 장비가 되었으며 검사에는 주사 전자 현미경이 많이 이용되고 있다.

3.6.4. 산업 분야

생명 과학 연구 분야에 집중되어 있는 공초점 현미경과는 달리 전자 현미경의 이용은 다방면이고 새로 생겨나는 산업 분야에 적용되면서 그 이용 분야는 점점 확대되고 있다. 자기 데이터 저장 매체인 하드 디스크 플래터의 자기 입자는 수 나노미터 크기를 가지고 있는데 이것이 비트 밀도와 데이터 용량에 영향을 미치기 때문에 나노미터 단위의 자기 입자 관측에 이용되기도 한다.

3.6.5. Correlative light-electron microscopy (CLEM)

형광, 공초점 현미경은 형광으로 보고 싶은 부분만 특이적으로 표지 할 수 있기 때문에 기능적인 연구와 분석이 용이하다는 장점이 있지만, 해상도가 수 나노미터 수준까지는 볼 수 없는 아쉬움이 있다. 그리고 전자 현미경은 해상도가 아주 좋아서 나노미터 수준의 세부 구조를 확인할 수 있는 장점이 있지만, 표지를 할 수 없어 기능적인 분석에 약점을 가지고 있다. 이런 두 현미경의 장점을 살려 개발된 기술이 Correlative light-electron microscopy (CLEM)이다. 형광으로 표지한 샘플을 관찰한 후에 같은 자리를 정확히 전자 현미경으로 다시 관찰한 후 두 가지 영상을 합치는 방식이다. 하지만 실제로 CLEM을 수행하기 위해서는 샘플 제작 방법이 다른 두 가지 현미경 관찰을 위한 시료 준비의 어려움과 형광으로 관찰한 부분을 정확히 전자 현미경으로 찾아내는 데에 어려움이 따르기 때문에 전문적인 훈련이 필요하다. 그래서 통합된 CLEM(integrated CLEM) 현미경이 개발되기도 하여 시료를 로딩하여 전자 현미경과 공초점 현미경을 한 장비에서 관찰할 수 있게 되었다. CLEM 방법을 이용하면 공초점 현미경으로는 해상도의 한계로 정확히 분석할 수 없었던 Mitochondria-lysosome contact site 같은 세포 내의 미세한 구조도 분석할 수 있다 [14]. 최근에는 형광 현미경이 초고해상도 현미경(Super resolution microscope)으로 발전하면서 CLEM 기술도 함께 발전하고 있다.

4. 정량 위상 현미경(Quantitative phase imaging)

살아있는 세포의 관찰(Live cell imaging) 기술 분야는 고령화로 인한 만성 질환의 증가와 이로 인한 진단 시장의 확대 그리고 신약 개발 시장의 발달로 연 평균 성장률 8.5%로 성장하고 있다 [15]. 그래서 연구자들은 살아있는 상태의 세포를 관찰할 수 있는 현미경을 개발해 왔다. 하지만, 공초점 현미경은 형광 물질을 관찰하기 위해 플라스미드를 주입한다거나 형질 전환을 해야 하고 전자 현미경은 진공을 만들어야 하는 구조의 특이점으로 살아있는 세포를 관찰할 수 없다. 그래서 개발되고 있는 방법 중 하나가 정량 위상 현미경이다. 정량 위상 현미경은 레이저 광원을 사용하여 세포에 빛을 조사하였을 때 나타나는 굴절률(Refractive index, RI)을 측정함으로써 매질(Medium) 대비 밀도의 변화를 관찰하는 현미경이다. 즉, 매질의 굴절률 정보를 미리 알고 있다면 관찰하는 시료의 정량적인 정보를 직접 얻을 수 있다. 또한 약한 레이저를 사용하기 때문에 살아있는 세포에 손상이 없어서 20세기 중반 이후부터 개발되고 있는 분야이다.

4.1. 정량 위상 현미경의 원리(광학계)

정량 위상 현미경의 원리는 1891년, 1892년에 발표된 마하-젠더 간섭계(Mach-Zehnder interferometer)에 기초하고 있다. 광원 레이저가 더 밀도가 높은 물체를 통과할 때 위상 변화가 발생하게 되고 이를 정량화 하는 현미경을 “정량 위상 현미경”이라고 부른다. 레이저가 시료를 통과하면 파장을 가지는 전송광선(transmitted beam)이 나오게 되고 이 광선들이 작은 거울들로 구성된 광학계를 통해 나와 빔스플리터를 거쳐 상을 만들게 된다. 이때 빔스플리터를 거친 광선은 참조빔(reference beam)과 만나게 되어 간섭 현상이 일어나게 되고 이 정보를 통해 최종 영상을 만들게 된다 [16]. 세포, 조직 등 가시광선에서는 투명하기 때문에 Bright-field 현미경에서 얻어지는 진폭 정보만으로는 시각적으로 구별되는 영상을 얻기 힘들다. Bright-field 현미경이 시료로부터 진폭만을 측정하여 시각화하는 반면에 정량 위상 현미경은 참조빔을 함께 받아들여 시각화함으로써 진폭과 위상의 정보를 동시에 측정하여 시각화 한다. 또한 세포와 같이 투명한 시료들은 상당한 광상 지연(optical delay)을 일으키기 때문에 정량 위상 현미경에서 더 좋은 대비를 제공하여 이미징을 유리하게 한다. 구조적으로 2차원의 XY 단면의 정보를 얻을 수 있는 2차원 정량 위상 현미경과 시료를 관찰 시 빛을 360도로 회전시켜서 시료의 3차원 정보를 얻을 수 있는 3차원 정량 위상 현미경으로 나누어 진다.

 

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그림 3. 정량 위상 현미경.

 

4.2. 정량 위상 현미경의 장점

4.2.1. 처리하지 않은 세포의 관찰

정량 위상 현미경은 시료의 밀도에 따른 위상 정보를 시각화 하기 때문에 형광을 보기 위해 플라스미드를 주입한다거나, 색을 내기 위한 염색을 할 필요가 없다. 그래서 배양하고 있는 세포를 그대로 관찰할 수 있기 때문에 전처리 과정이 필요 없고 변형되지 않은 세포를 관찰할 수 있다는 장점이 있다. 이런 장점이 있기 때문에 작은 크기의 정량 위상 현미경을 세포 배양기에 넣거나, 배양기와 현미경을 일체형으로 만들어서 자라고 있는 세포를 실시간으로 관찰하는 현미경이 개발되었다. 또한 시료 준비가 간편하기 때문에 적혈구로 인한 질병의 진단이나 암세포의 성장 연구 등에 이용되고 있다.

4.2.2. 정량 분석

정량 위상 현미경을 이용하면 시료의 형태 정보뿐만 아니라 시료의 두께, 굴절률 정보, 건조 질량, 단백질의 농도, 부피, 면적의 정보를 알 수 있다. 세포 하나의 질량 정보를 분석할 수 있다는 장점이 있기 때문에 세포의 변화를 모양으로만 관찰하는 것이 아니라 수치 정보도 얻을 수 있다. 그리고 최근에 인공 지능(AI)기술이 이미지 분석에 많이 이용되고 있는 추세인데 정량 위상 현미경의 소프트웨어에서도 인공 지능 기술이 많이 이용되고 있다. 인공 지능 기술을 이용해 세포의 모양대로 세분화(segmentation)가 가능하고 많은 양의 정보를 보다 정확하게 분석하는 것이 가능하다.

4.2.3. 세포 독성의 최소화

형광을 관찰하는 것이 아니기 때문에 광표백화와 광독성에 의한 세포의 손상과 데이터의 유효성을 걱정하지 않아도 된다. 전자 현미경처럼 진공 상태의 시료를 관찰할 필요도 없기 때문에 전처리나 고정 과정을 꼭 하지 않아도 된다. 그리고 정량 위상 현미경에 사용하는 레이저의 세기는 대부분 매우 약하며 관찰 속도가 굉장히 빠르기 때문에(1프레임 당 1초 이하) 다른 광학계에 비하여 세포 독성이 최소화된다고 볼 수 있다.

4.2.4. 다양한 분야에 적용

정량 위상 현미경은 세포 관찰에 주로 사용되고 있지만, 시료의 종류에 제약이 없기 때문에 전자 현미경처럼 산업 분야에서도 이용되고 있다. 생명과학 분야에서는 동물세포 배양뿐만 아니라 미생물의 동정, 곰팡이나 기생충 감염 연구에도 이용되고 산업 분야에서는 유리의 표면 균일도를 검사하거나 얇은 섬유의 결함 조사 등 품질 검사 단계에서 사용되고 있다.

4.3. 정량 위상 현미경의 한계

4.3.1. 시료의 투명도에 의존

정량 위상 현미경은 시료에 빛이 투과되어 나오는 빛의 정보를 관측하여 굴절률을 계산할 수 있다. 그런데 시료가 너무 밀도가 높아서 불투명하거나, 시료를 싸고 있는 매질이 투명하지 않은 상태라면 빛이 투과할 수 없게 되고 아무런 정보도 얻을 수 없어 이미징이 불가능하다. 이런 경우 시료를 얇게 절편으로 만들거나 매질로부터 시료만 분리해서 이미징 해야 한다.

4.3.2. 흑백영상

시료를 시각화할 때 굴절률 기반으로 단색의 이미지를 얻을 수 있다. 명암의 차이를 통해 굴절률이 높고 낮은 것을 표현하기 때문에 형광 이미지와 같이 여러 가지 색으로 표시되지는 않는다. 그래서 일부 현미경은 굴절률 값의 범위마다 다른 색으로 표현하는 소프트웨어를 구현함으로써 연구자들이 영상에 색을 넣을 수 있게 하기도 한다. 하지만, 형광 염색과 같이 분자적 수준의 표지를 하는 데에는 한계가 있기 때문에 전자 현미경과 형광 현미경을 합친 CLEM 방식처럼 정량 위상 현미경도 형광 모듈과 함께 사용하기도 한다.

4.3.3. 생소한 기술

형광 현미경이나 전자 현미경만큼 오래된 역사를 가지고 있지는 않기 때문에 보편화된 현미경은 아니다. 그래서 연구자들이 쉽게 접근하거나 실험에 사용하지 못하고 있는 것은 사실이다. 하지만, 이용 범위가 점차 확대됨에 따라 사용하기 편한 현미경 장비들이 개발되고 있기 때문에 많은 연구에 이용될 것이라고 기대해 본다.

4.4. 주요 개발사와 제품

정량 위상 현미경을 개발하는 회사는 10개 정도를 꼽을 수 있다 [17]. 각 회사마다 내세우는 타겟 시장이 조금씩 다르기 때문에 현미경들도 다른 특성을 가지고 있다. 현미경 기술들이 대부분 유럽권에서 강세를 보이고 있으며 정량위상 현미경 또한 유럽에 위치한 회사들에서 많이 개발하고 있다. 정량 위상 현미경은 플러그인 형태로 다른 현미경에 붙여서 사용하는지 또는 완전한 현미경의 형태를 가지는지에 따른 형태적 두 분류와 2차원적인 정보를 수집하는지와 3차원 영상을 만드는지에 대한 차원적 분류로 크게 나누어 진다. 정량 위상 현미경의 대표 개발사와 제품의 특징에 대해서 표 3에서 소개하고자 한다.

 

표3. 정량 위상 현미경의 주요 개발사와 제품.
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4.5. 정량 위상 현미경의 이용 분야

4.5.1. 세포 내 소기관 분석

세포를 구성하고 있는 구조물들은 모두 다른 밀도와 두께를 가지고 있다. 이런 차이점들은 빛에 의한 굴절률 차이를 만들게 되고 정량 위상 현미경은 굴절률 차이로 나타나는 세포의 형태와 소기관들의 위치와 모양 그리고 소기관들이 가지는 물리적 특성을 측정한다. 세포의 소기관 중에서도 굴절률이 높은 기관들이 좀 더 정확히 구별될 수 있으며 대표적으로 굴절률 값이 높은 지방 방울(lipid droplet)에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 최근에는 동맥 내의 대식세포가 과도하게 분화되어 지방 방울이 많이 커진 거품 세포(form cell)로 분화되는 과정을 정량 위상 현미경으로 24시간 동안 실시간으로 관찰한 연구 결과가 발표되었다. 연구자들은 살아있는 세포가 분화하는 과정을 어떠한 염색 없이 3차원에서 단일세포 수준으로 관찰하였고 거품 세포의 굴절률, 부피, 지방 방울의 개수 등을 분석하여 보고하였다 [18].

4.5.2. 기생충 감염 질병 진단

정량 위상 현미경은 특별한 배양 조건과 전처리가 필요 없다는 장점이 있기 때문에 2개 이상의 다른 종류의 세포 공동 배양(co-culture)에도 유리하다. 특히 서로 굴절률과 모양 차이가 많이 나는 시료들을 관찰하여 공동 배양 시 일어나는 변화를 관찰할 수 있고 두 시료를 구별하여 분석할 수 있다. 적혈구에서 기생하여 번식하는 말라리아 유충의 관찰이 대표적인 예이다 [19]. 말라리아 감염이 의심될 때에는 말초 혈액을 도말하여 혈액의 모양을 관찰하고 중합효소 연쇄반응으로 검사하고 있다. 하지만, 이런 방법들은 시간도 오래 걸리며 실시간 감염 상태를 추적하기는 힘들다. 정량 위상 현미경으로 환자의 말초 혈액을 관찰 시 실시간으로 적혈구 내의 말라리아 감염 여부를 판별할 수 있고 정확한 진단이 가능하기 때문에 진단 검사의 대안으로 이용될 수 있다.

4.5.3. 단일 세포의 특징 분석

정량 위상 현미경을 이용하면 실시간으로 세포를 관찰할 수 있기 때문에 세포 배양기와 일체형으로 나오는 제품도 있고 소형 현미경으로 제작하여 세포 배양기 안에 넣어서 배양과 관찰을 동시에 하는 제품도 있다. 또한 다른 제품들도 각자 세포 배양 챔버 시스템을 갖추고 있는 경우가 많다. 배양이 가능한 장점과 세포를 세분화할 수 있는 인공지능 기술이 접목되어 세포 배양 과정을 모니터링하는 실험에 이용되고 있다. 세포의 성장과 사멸을 분석하는 것은 기본이고 개수를 세고 세포의 밀도를 계산하고 세포막을 인식하여 모양 별 분류를 해 주는 소프트웨어 기능도 있다.

동물 세포에만 적용되는 기술이 아니기 때문에 박테리아의 성장률과 밀도를 계산할 수 있고, 인공지능 기술을 이용하여 정량 위상 현미경으로 관찰한 미생물의 종류를 동정하는 것이 가능하다는 연구 결과가 발표되기도 했다 [20].

5. 영상 분석 도구

최근에 발표되는 연구 논문들을 살펴보면 현미경 기술이 한 번도 사용되지 않은 논문을 찾아보기 힘들다. 그만큼 실험실에 현미경 기술이 보편화가 된 것이다. 또 다른 특징은 논문에서 현미경으로 관찰한 이미지만을 보여주고 논리를 주장하는 경우가 없다는 것이다. 대게 대표 영상 옆에 수치화된 그래프를 보여주고 반복 실험을 통한 통계 결과까지 보여주고 있다. 현미경 사용이 보편화 됨에 따라 영상을 수치화하고 분석하는 소프트웨어들도 많이 발전하고 있다. 대부분의 현미경들이 영상의 획득을 주요 목적으로 하는 소프트웨어를 제공하고 있다. 보통은 이미지 획득 소프트웨어에서 영상의 밝기와 대비 조절, 합병, 스케일 바(scale bar) 삽입 등의 간단한 후처리가 가능하다. 하지만, 심화된 분석을 하기 위해서는 영상 분석 소프트웨어를 이용해야 한다. 다음 본문에서 생물학 연구에 많이 사용되는 영상 분석 도구에 대한 소개를 하고자 한다.

5.1. Image J and Fiji (Fiji Is Just ImageJ)

ImageJ는 연구자들이 가장 많이 사용하는 무료 이미지 소프트웨어이다. ImageJ는 국립 보건 연구소(NIH)와 광학 및 전산 계측 연구소에서 함께 개발한 Java 기반의 이미지 처리 프로그램이다. 좀 더 다양하고 심화된 분석과 영상화를 Fiji로 많이 하는 추세이다(https://fiji.sc/). ImageJ는 아주 다양한 플러그인을 가지고 있는 장점이 있다. 사용자가 그 기능을 모두 찾아서 수행해야 하는 어려움이 있지만, 아주 다양한 기능을 무료로 이용할 수 있는 장점이 있다. 또한 거의 모든 이미지 형식을 열 수 있고 채널 별 이미지 분석이나 3차원 영상화도 가능하다.

5.2. CellProfiler

CellProfiler도 ImageJ 처럼 무료로 이용 가능한 프로그램이다. 특히 세포의 형태에 따른 정량화에 특화되어 있는 분석 도구이다(https://cellprofiler.org/). 이 프로그램은 사용자가 원하는 분석 방법을 파이프라인 형태로 저장하여 일괄 수행하는 기능을 제공하고 있다. 그래서 연구자들이 전체 실험 결과를 같은 분석 방법으로 분석할 수 있기 때문에 약물 스크리닝 등에 많이 이용되고 있다.

5.3. Imaris

Imaris는 ‘Bitplane’이라는 회사에서 제공하는 3차원 4차원 이미지 분석용 소프트웨어이다(https://imaris.oxinst.com/). ImageJ와 CellProfiler와는 다르게 유료로 판매되는 소프트웨어이다. 무료 소프트웨어들 보다 편리한 사용성과 여러 가지 시료 들에서 다양한 분석 결과를 제공받을 수 있다. 특히 vesicle tracking 정보나 신경세포의 filament tracing, 전자 현미경 이미지 분석, 조직 이미지를 위한 스티칭 기능 등의 심화된 기능을 쉽게 이용할 수 있다. 또한 영상의 시각화 기술이 뛰어나서 형광 이미지로부터 3차원 영상을 입체적으로 만들어 주기도 한다. 하지만 비용이 비싸다는 점이 아쉬웠는데 최근에 무료 viewer를 제공하고 있다.

6. 결론

1665년에 현미경의 역사가 시작되었으니 현미경 기술은 350년 정도의 기간 동안 발전되어 왔다. 처음에는 미생물이나 세포의 형태를 구분하는 것으로 시작하여 지금은 형광 단백질을 이용해 분자 수준의 이미징이 가능해졌고 전자 현미경을 이용하면 수 나노미터의 미세구조를 구별할 수 있게 되었다. 공초점 현미경은 보고 싶은 물질을 형광으로 표지하여 세포 내에서 기능적 연구를 하기에 아주 좋고 시각적으로도 예쁜 영상을 만들 수 있지만, 광원으로 가시광선을 이용하기 때문에 해상도의 한계가 있다. 하지만, 요즘은 super-resolution microscopy 기술이 많이 발달하여 XY 해상도가 10-15 nm가 되는 현미경도 나오고 있다(Single-molecule localization microscopy, SMLM). 전자 현미경은 굉장히 좋은 해상도를 가지고 있지만, 진공 상태를 유지해야 하고 세포의 기능 연구를 하기 힘들다는 단점이 있지만, 이 점을 극복하기 위하여 형광 현미경으로 관찰한 후에 전자 현미경으로 같은 위치를 관찰하는 CLEM 기법이 나오면서 고 해상도로 형광 표지가 된 영상을 얻는 것이 가능해졌다. 그리고 비표지로 살아있는 세포를 실시간으로 관찰할 수 있는 정량 위상 현미경이 개발되었고 이 보고서에서는 다루지 못했지만 다른 방식의 현미경들도 아주 많이 개발되고 있다.

눈에 보이는 것은 매우 강력한 힘을 가지고 있다. 그래서 많은 과학자들은 눈에 보이지 않는 미시의 세계를 확대하여 눈으로 보기를 원했고 형광으로 표지를 하던지 고배율로 확대하여 생명 현상의 비밀을 풀어가고 있다. 실제로 광학계의 발전이 생명 과학과 의학의 발전에 큰 공헌을 했다고 해도 과언이 아닐 것이다. 본문에서 기술하였듯이 빛을 통해서 시료를 관찰하는 것에는 해상도의 한계라는 것이 존재하였지만, 과학자들은 포기하지 않고 다른 방법으로 아주 작은 세계를 관찰하는 방법을 개발하였다. 그리고 각 광학계가 가지는 한계를 뛰어넘기 위해 지금도 계속 한 단계씩 발전하는 중이다.

생명 과학을 연구하는 한 연구자로서 현미경의 엄청난 발전은 참으로 기쁜 일이다. 하지만, 너무 많은 선택지 앞에서 어떤 현미경을 선택해야 할 지 결정하는 것은 쉽지 않다. 본문에서 설명하였지만, 현미경은 그 방식마다 가지는 장점이 있다면 극복할 수 없는 한계도 분명히 있기 때문에 나의 실험에 가장 적합한 현미경이 무엇인지 잘 판단하여 선택해야 하겠다. 각자의 장점만을 취합하여 결합한 현미경 기술들도 개발되고 있으니 언젠가는 실험적 한계가 없는 초 고해상도 현미경이 개발되리라고 기대해 본다. 또한, 생물학을 하는 연구자들이 현미경 사용을 너무 어렵게 생각하지 않도록 사용하기 쉬운 사용자 친화적인 분석 도구의 발전도 기대해 본다.

7. 참고문헌

==>첨부파일(PDF) 참조

 

 
저자 김혜진 (Tomocube, Inc.)
저자는 종양 미세환경에서 막단백질의 역할을 규명하는 연구로 서울대 약학과에서 박사학위를 받았으며 현재 토모큐브에서 연구원으로 재직중이다. 주 연구분야는 Cancer biology와 Bioimaging이다.

 

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김혜진(2020). 현미경(공초점 현미경, 전자 현미경, 정량 위상 현미경)을 활용한 최근 기술 동향. BRIC View 2020-T30. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3589 (Sep 01, 2020)
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