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종양 발병 및 진화에서의 염색체 외(extrachromosomal) 종양 유전자의 증폭
종양 발병 및 진화에서의 염색체 외(extrachromosomal)  종양 유전자의 증폭 저자 임도환 (University of California, San Diego)
등록일 2020.06.25
자료번호 BRIC VIEW 2020-R19
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요약문
최근 연구 결과에 따르면 염색체 외 DNA (extrachromosomal DNA, ecDNA)상의 종양 유전자 증폭은 암에서 빈번하게 일어나며, 이는 수십 년 전에 처음으로 발견되어진 현상을 다시 연구할 수 있도록 새로운 모멘텀을 제공한다. ecDNA 증가의 직접적인 결과는 염색체 외 인자에 존재하는 종양 유전자들의 DNA 복제 수 증가이며, 2차적으로 더 중요한 영향은 부모 종양 세포에서 자식 종양 세포로 균일하지 않게 ecDNA가 분리됨으로써 종양의 이질성을 빠르게 증가시키는 것이다. 이는 미세환경 유래 또는 치료 유래 스트레스 요인에 대한 추가적인 반응들을 가지는 종양을 생성하는 것뿐만 아니라 진화적 이점을 제공할 것이다. 본 논문에서는 암에서 ecDNA상의 종양 유전자 증폭의 잠재적 영향들과 최근의 지식들을 논할 것이다.
키워드: 염색체 외 DNA (ecDNA), 종양 유전자 증폭, 이질성, 암 진화
분야: Cancer Biology/Oncology, Genomics, Molecular_Biology

본 자료는 Extrachromosomal oncogene amplification in tumour pathogenesis and evolution. Nat Rev Cancer 19, 283–288 (2019). 의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목 차

1. 서론
2. ecDNA의 역사적 기록
3. ecDNA는 암 세포에서 빈번하게 나타난다.
4. ecDNA의 발생
5. ecDN A의 영향
6. ecDNA 연구를 위한 기술 개발
7. 결론과 전망


1. 서론

종양 유전자(oncogene)의 증폭은 암에서 가장 흔한 분자 스케일의 변화 중 하나이며, 인핸서(enhancer)와 같은 기능적 부위와 종양 유전자의 과발현을 통해 선택적 성장 이점을 가지는 암 세포를 생성함으로써 종양 형성의 중요한 역할을 한다. 유전체의 증폭은 순차 중복(tandem duplication), 절단-융합-가교 사이클(breakage-fusion-bridge cycle), 크로모트립시스(chromothripsis)와 같은 기작을 통해 DNA 이중 가닥이 절단됨으로써 발생되어 질 수 있고, 이는 복잡한 염색체 재배열을 초래할 수 있다. 암에서 이렇게 종양 유전자가 매우 높은 복제 수(copy number)를 가질 수 있도록 하는 기작은 잘 알려져 있지 않다. 최근 연구에 따르면, 종양 유전자를 포함하는 염색체 외 DNA (extrachromosomal DNA, ecDNA)의 형성은 유전자 증폭의 주요한 기작 중 하나이며, 이러한 ecDNA의 생성은 종양 내 유전적 이질성을 증가시킬 수 있음을 보여주었다. 상염색체 유전체(autosomal genome) 외부에 염색체 물질의 존재는 오랫동안 인식되어져 왔으며, 이는 30 – 400 Mb의 크기로 동원체(centromere) 또는 말단소립(telomere) 서열을 포함한다고 알려진 네오크로모좀(neochromosome)과 인구의 0.5%의 생식세포 계열의 유전체에서 확인되어지는 작은 과잉마커 염색체(small supernumerary marker chromosome)를 포함한다. 이러한 네오크로모좀과 과잉마커 염색체는 종양 발병에서 중요한 역할을 할 수 있다. 본 논문에서는 ecDNA상의 종양 유전자 증폭의 역할과 이것의 중요성을 종양 발병 및 암 진화 촉진의 측면에서 논의할 것이다.

박스 1. 암 세포 외에서의 ecDNA

원핵유전학에서 ecDNA와 흥미로운 유사성이 존재한다. 박테리아 유전체는 원형이며, 박테리아는 종종 추가로 작은 원형 DNA 분자 또는 에피솜(episome)을 가지고 있다. 각각의 플라스미드는 복제 원점을 가지고 있고, 이는 박테리아 염색체와 독립적으로 복제를 일어나게 한다. 하나의 박테리아 안에는 수백 개의 플라스미드가 존재할 수 있고, 플라스미드는 항생제 내성과 같은 기능적으로 중요한 유전자들을 포함한다. 플라스미드에서 확인된 복제 원점은 인간 ecDNA에서는 발견되지 않았으며, 이는 ecDNA가 다른 복제 원리를 이용한다는 것을 의미한다.

진핵생물에서는 세포 분열시 염색체가 적절하게 딸세포로 분리되어 질 수 있도록 동원체가 필요하다. 그러나 ecDNA는 동원체가 없기 때문에 무작위로 분리되어 질 수 있다 (그림 2). 이전에 효모와 인간과 같은 진핵 생물에서 작은 원형 DNA는 언급되어져 왔지만, 이것들은 크기가 작고 유전자를 포함하지 않으며, 대부분 200-500 bp의 반복적인 DNA로 이루어져 있다. 또한 이것들은 1 Mb 이상으로 유전자 및 조절 부위를 포함하는 비암호화 DNA를 가지고 있는 암 관련 ecDNA와는 다르다.


2. ecDNA의 역사적 기록

진핵 세포에서 유전자가 DNA 염색체 외 입자에서 발견되어 질 수 있다는 것은 새로운 개념은 아니지만, 그 규모와 잠재적 중요성은 상당히 놀라울 만한 것으로 밝혀졌다. DNA 염색체 외 입자는 효모, 초파리(Drosophila melanogaster), 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans), 인간과 같은 많은 진핵생물에서 발견되어진다 (박스 1). 염색체 외 원형 DNA (extrachromosomal circular DNA, eccDNA)라고도 언급되어지는 이러한 입자들은 생물 물리학적인 방법들과 DNA 시퀀싱에 기초하여 원형의 형태를 가진다고 보고되었으며, 보통 1 kb 보다 작아 광학 현미경으로는 확인이 어렵다. 이는 텔로머릭 서클(telomeric circle), 작은 다분산 DNA 인자(small polydispersed DNA element), 마이크로디엔에이(microDNA)를 포함한 다양한 유형으로 언급되어져 왔다. 이러한 작은 DNA 입자들은 완전한 유전자를 가지지 않고, 정상 및 암 세포 모두에서 발견된다. 그렇지만 이들은 말단 소립의 연장을 촉진하고 유전체 안정성을 악화시킴으로써 암 발병에 영향을 미칠 수 있다.

이러한 eccDNA와 더불어 또 다른 유형도 발견되었다. 신경아세포종(neuroblastoma)의 세포분열 중기(metaphase)를 조사하는 동안 Spriggs와 동료들은 작은 염색질체(chromatin body)를 발견하였다. 이것들은 종종 짝을 이루기 때문에 “double minute”라고 언급하였고, 후속 연구를 통해 이러한 DNA 염색체 외 입자들은 여러 유형의 암 세포에서 추가적으로 확인되어 졌다.

초반에는 짝을 이루는 염색질체에 집중하였으나, 현재는 이러한 염색질체 중 단지 약 30%만이 짝을 이루는 double minute라고 알려져 있다. 유전자를 포함하는 커다란 염색체 외 입자들을 포함하기 위해 “ecDNA”라는 용어를 사용하였으며, 이는 double minute와 단일 몸체의 형태, 동원체 또는 말단 소립이 없는 형태도 포함한다. 텔로머릭 서클, 작은 다분산 DNA 인자, 마이크로디엔에이와 달리 ecDNA는 다음과 같은 중요한 특징을 가진다.
  1) ecDNA의 크기는 종종 1-3 Mb 또는 이 보다 크다.
  2) 하나 또는 여러 개의 완전한 유전자 및 조절 부위(regulatory region)를 포함한다.
  3) 광학 현미경으로 확인이 가능하다.

종양 세포가 DHFR 유전자의 증폭을 통해 메토트렉세이트(methotrexate) 내성을 가진다는 Schimke의 연구는 단순하게 현상학적 기술만 하던 ecDNA 생물학 분야를 한층 진보시켰다. 또한, 추가 연구를 통해 DHFR 증폭은 “ecDNA의 double minute 형태” 또는 “균일 염색 부위(homogeneously staining region, HSR)”이라고 불리는 비이상적 염색체 부위에서 발생될 수 있다고 밝혀졌으며, Schimke와 동료들은 ecDNA는 불안정한 형태의 유전자 증폭을 나타내는 반면, HSR은 안정한 형태의 증폭이라고 가정하였다.

종양 유전자가 ecDNA에 존재할 수 있다는 첫 번째 보고는 Alt와 동료들이 IMR-32 신경아세포종 세포주에서 MYCN 유사 서열이 HSR과 double minute에 존재할 수 있다는 것을 입증한 1980년대로 돌아간다. Bishop과 동료들 또한 결직장 암(colorectal carcinoma) 유래 신경 내분비 세포에서 비슷한 관찰을 하였다. 후속 연구들을 통해 종양 유전자 증폭이 ecDNA상에서 발생되어 질 수 있고, 종양 유전자의 빈도와 증폭은 히드록시유레아(hydroxyurea) 화학요법과 같은 다양한 자극에 의해 변할 수 있다는 것도 증명하였다. Wahl과 동료들은 ecDNA 복제 동역학(kinetics) 연구를 통해 “ecDNA는 일반 염색체와 동일한 복제 기작을 따른다”라고 제안하였다.

이러한 앞선 연구들은 인간 유전체 서열이 완성되기 전에 수행되었다. Fluorescence in situ hybridization (FISH)과 complementary PCR 방법은 암 세포에서 증폭된 ecDNA를 확인하는데 이용되어 왔으며, DNA/RNA 마이크로 어레이(microarray)의 출현, 특히 high-throughput 시퀀싱은 암 유전체 조사에 영향을 미쳤다. 시퀀싱 데이터의 전산학적 분석(computational analysis)은 암 유전체를 연구하는 새로운 관점을 제공하였지만, 이러한 접근방식은 체세포 변형을 탐지하는데 매우 유용해서 이 분야의 초점을 염색체 외 증폭보다는 유전체 전반에 걸친 체세포 변형을 확인하는 방향으로 옮겨가도록 하였다. 사실, 암 염색체 이상(chromosome aberration)과 유전자 결합(gene fusion)을 위한 Mitelman Database에 따르면 단지 1.4%의 종양에서만 ecDNA가 발생한다고 하며, ecDNA는 암 종양에서 쉽게 발생하지 않는다고 생각되어져 왔다.

3. ecDNA는 암 세포에서 빈번하게 나타난다.

매우 낮은 확률로 ecDNA가 종양에서 발생한다는 연구 결과는 2014년 ecDNA와 암 종양과의 관점에서 터닝포인트를 가지게 되었다. Mischel 연구실에서 치사율 높은 교모세포종(glioblastoma)의 epidermal growth factor receptor (EGFR) 억제제에 대한 내성이 ecDNA상의 EGFRvIII의 gain-of function 돌연변이의 가역적 손실(reversible loss)에 의해 발생한다는 것을 발견하면서 ecDNA에 대한 새로운 전환점을 가지게 되었다. 교모세포종에서 EGFRvIII 증폭은 종양 내 유전적 이질성(heterogeneity)의 원천으로서 널리 받아들여졌지만, EGFR 타이로신 키나아제 억제제 내성에서의 영향은 이 연구 이전에는 받아들여지지 않았다. EGFR 억제제는 in vitro, 쥐 그리고 환자 내에서 높은 수준의 EGFRvIII를 갖는 종양 세포의 분율(fraction)을 크게 줄였지만, 약물을 제거함에 따라 EGFRvIII의 복제 수는 다시 증가하였다. 또한 종양에서 얻은 단일 세포는 EGFRvIII의 검출 혹은 높은 발현성 여부와 상관없이 쥐와 in vitro에서 동일하게 종양을 생성하였고, 이는 부모 종양(parent tumour)의 이질적 조성을 반영하는 것이었다. 아마도 이 관찰은 고전적인 유전학으로는 설명하기가 어려웠을 것이다. 이러한 결과를 설명할 수 있는 열쇠는 종양 유전체를 조사하는 예전 방식, 즉 세포분열 중기의 세포를 관찰하는 것이었다. EGFRvIII는 거의 ecDNA상에서 증폭되어지는 것으로 드러났고, EG-FRvIII를 포함하는 ecDNA의 수는 EGFR 억제제에 반응하여 급격히 줄어들었다가 약물 제거 후 1-2주 이내에 다시 높은 복제 수로 되돌아가는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Schimke와 동료들이 메토트렉세이트 내성에서 보여준 것보다 ecDNA의 불안정적인 특성은 더 널리 적용될 수 있다는 것을 뒷받침하였다.

종양 유전체와 생식세포 유전체 사이의 염기서열 리드 밀도를 비교하여 종양 DNA 복제 수를 추론하는 데 high-throughput short-read DNA 시퀀싱을 이용할 수 있다. 이 분석 방법은 암 세포에서 증폭된 유전자들을 정상 상태에서의 그들이 위치하는 염색체 위치에 배치하는데, 이는 실제로 확인 되어지지 않았었다. 따라서 Mischel, Bafna 및 동료들은 이러한 시퀀싱에 일반적인 분석 방법으로는 ecDNA를 검출하기는 어렵다고 생각하였다. 그들은 전체 유전체 시퀀싱(whole genome sequencing), 전산 및 세포 유전학적 이미지(cytogenetic image) 분석을 통합하여 ecDNA 확인을 위한 편향 되지 않은(unbiased) 방법을 개발하였고, 이를 통해 염색체 부위에서는 종양 유전자의 증폭이 상대적으로 드물지만, ecDNA상에서의 종양 유전자의 증폭은 암에서 빈번하게 발생한다는 것을 확인하였다. 그들은 또한 ecDNA에 기반한 유전자 증폭이 복제 수를 증가시키고 종양 내 유전적 이질성을 촉진함을 입증하였으며, 이는 ecDNA가 암 진화에 있어서 중추적인 역할을 한다는 것을 시사한다. 그들은 앰플리콘(amplicon)의 미세한 구조 매핑을 위한 AmpliconArchitect 방법을 개발하였다 (그림 1). 그리고 일부 ecDNA가 다시 염색체 HSR로 이동할 수 있다는 것을 보여 주었고, 이는 ecDNA에서 발견된 종양 유전체가 종종 염색체에서 HSR로써 발견된다는 이전의 결과와 일치하는 것이었다. 그러나 이 과정의 기작은 아직까지 증명되진 않았다.

 

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그림 1. Short-read 시퀀싱 데이터를 이용한 ecDNA 구조 재구성.
샘플에서 얻어진 short-read 서열은 참고 유전체에 매핑되고, ecDNA 분절(유색 박스)에 매핑되는 리드의 복제 수는 세포당 ecDNA의 평균 복제 수에 비례한다. 인접한 분절의 접점을 걸치는 리드는 분할하여 참고 유전체에 매핑하고, 이를 통해 절단 부위를 찾는다. 그러나, 이러한 ecDNA 유래 복합체 재배열의 매핑 시그니처는 염색체 구조적 변형과 쉽게 구별하기 어렵고, 따라서 ecDNA의 수를 적게 판단할 수 있다. ecDNA 재구성 알고리즘은 노드(node, 증폭된 분절)와 엣지(edge, 절단 부분)가 있는 앰플리콘 그래프를 탐색하고, 그래프를 가로질러 재구성된 순환 경로(cyclic path)는 ecDNA를 나타낸다. 또한 ecDNA가 크고 반복적인 분절을 포함한 경우에는 좀 더 명확한 재구성을 위해 긴 리드가 필요되어 질 수 있다는 것을 유념해야 한다.


이와 동시에 독립적으로 Verhaak 연구실은 교모세포종에서 ecDNA에서의 종양 유전자 증폭의 중요한 역할을 확인하였다. 2013년, 그들은 교모세포종이 ecDNA의 빈번한 존재를 나타내는 반복적인 초점 증폭(focal amplification)의 밀집된 패턴을 가진다고 처음 보고하였다. 이 연구는 교모세포종에서 종양 유전자 증폭 대부분은 사실 염색체 외에서 일어나고, ecDNA 증폭은 종양 내 이질성을 빠르게 증가시키는 능력을 갖는 교모세포종을 생성하게 한다는 가설을 만들게 하였다. 그 이후, Verhaak 그룹은 교모세포종 종양 샘플, 여기서 파생된 glioma-neurosphere 그리고 초기 neurosphere의 이종이식(orthotopic xenograft) 모델을 이용하여 ecDNA의 존재를 추적했다. 염색체 12q14-15상의 MECOM–PIK3CA–SOX2 유전자 클러스터, CDK4–MDM2 유전자 클러스터뿐만 아니라, MYC, MYCN, EGFR, PDGFRA, MET과 같은 유전자의 ecDNA 증폭은 in vitro 와 in vivo에서 종양의 성장 동안 보존되어 졌으며, 이는 ecDNA 증폭이 종양 증식의 중요한 인자임을 의미한다. 그들은 한 쌍의 1차 종양과 재발한 신경종 종양을 이용하여 ecDNA 증폭이 환자의 종양에서 종적으로 보존되어 있음을 보여주었고, 이는 질병 진행에서의 ecDNA의 중요성을 입증하는 것이었다. 그들의 연구에서 가장 중요한 발견은 환자의 종양과 모델 시스템 모두에서 체세포 단일 뉴클레오타이드 변형(somatic single nucleotide variant)으로 표지되어지는 종양 서브클론의 진화가 ecDNA에 의해 특징 되어지는 것들과 다르다는 것이었다. 이 결과는 ecDNA가 염색체와는 다르게 유전된다는 직접적인 증거를 제공하였다 (그림 2). 종합적으로, 이러한 발견들은 종양들이 종양 내 이질성을 빠르게 증가시키기 위해 ecDNA 증폭을 이용하고, 이는 암이 배양 및 치료로부터의 선택적 압력에서 적응할 수 있도록 한다는 가설을 뒷받침한다.
 

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그림 2. ecDNA와 염색체 DNA의 유전.
a. 세포분열 동안 염색체 DNA는 두 개의 딸세포로 균일하게 분리된다. b. ecDNA는 동원체가 없어서 균일하지 않게 분리되어 질 수 있다.


 

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그림 3. 종양에서 ecDNA의 제안된 형성과 전파 과정.
유전체의 불안정은 염색체의 절단을 일으키고, 그 DNA 분절은 비 상동 재조합(non-homologous recombination)을 통해 원형 DNA를 형성한다. 형성된 ecDNA는 동원체가 존재하지 않음으로 부모 세포로부터 딸세포로 균일하지 않게 유전될 것이다. ecDNA를 포함하고 있는 세포들(오른쪽 패널에 붉은색으로 표시됨)은 종양 유전자의 발현을 통해 경쟁적 이점을 확보할 수 있다. 이러한 향상된 적합성은 ecDNA의 수와 비례적으로 상관관계가 있으며, 증식율의 증가를 통해 ecDNA 양성 암 세포의 급속한 축적을 초래한다. (*DSB: 이중나선 절단.)


이러한 연구들은 암 세포에서 ecDNA가 염색체 증폭으로는 달성하기 어려운 종양 유전자 복제 수를 증가시킬 수 있는 강력한 기작이라고 제안한다. 또한, 이 연구들은 ecDNA 기반 증폭이 종양 내 유전적 이질성을 빠르게 획득하고 유지할 수 있게 한다고 입증하였으며, 이는 암 진화 촉진에 있어서 중요한 역할을 가짐을 의미한다.

4. ecDNA의 발생

현재, ecDNA 형성 원인은 잘 알지 못하지만, 가능한 단계별 모델은 다음과 같다 (그림 3). 먼저 이중 가닥의 절단, 염색체 재배열 또는 크로모트립시스가 발생되어질 수 있고, 이는 원형화 되어질 수 있는 DNA 분절(segment)을 생성한다. 두 번째로 손상된 DNA에 대한 세포 노화(senescence) 반응을 회피할 수 있도록 하는 종양 억제자(tumour suppressor)의 손실은 ecDNA 인자의 복제가 가능하게 만들어 준다. 세 번째로, ecDNA 입자는 동원체가 손실되어 있기 때문에 딸세포(daughter cell)로 균일하지 않게 전달되며, 이는 종양 세포에서 빠르게 ecDNA의 수적 이질성을 유발하고 모세포(mother cell)보다 딸세포가 더 많은 ecDNA 복제 수를 갖게 할 수 있다. 마지막으로, 종양 유전자 또는 다른 증식 인자들의 존재는 환경 조건에 의해 형성된 세포에 선택적 이점을 제공할 수 있고, 이는 ecDNA를 포함한 세포의 적합성(fitness)을 향상 시키고 종양 내 ecDNA와 종양 유전자의 복제 수를 빠르게 증가시킬 수 있다는 것이 현재까지 ecDNA가 형성되는 것으로 추정되는 메커니즘이다.

ecDNA가 생성될 수 있는 여러 경로가 있을 가능성이 크지는 않더라도 형식적으로 가능하다. 서로 다른 암 유형에서 ecDNA의 유전체 구성 간의 현저한 차이는 원형 DNA를 만들기 위해, ecDNA 인자들이 단일 분절 구조(single-segment structure)에서 복잡한 다중 분절 구조(multi-segment structure)로 진화하는 다단계 과정을 포함하는 다수의 형성 과정이 있을 수 있음을 암시한다. 그러나 우리가 제안하는 ecDNA 모델은 단일 무작위 절단(single random breakage)과 같은 것을 포함한 비교적 타당하고 단순한 일들만 필요로 하며, 절단 부분에서의 취약성을 요구하지는 않는다. 그렇지만, 종양 유전자 또는 다른 증식 인자가 존재할 때, 해당 인자의 발현은 일관성 없는 ecDNA 복제의 특성 때문에 빠르게 ecDNA의 복제 수가 축적될 수 있는 적합성 이점을 제공할 수도 있다. 추가적인 DNA 분절은 ecDNA 인자에 삽입되어 질 수도 있으며, 이는 유사분열 잠재성(mitotic potential)을 증가시킬 수 있다. 이는 점진적으로 또는 종종 발생하는 파열에 의해 발생할 수도 있으며, 매우 복잡한 DNA 서열을 초래할 수 있다.

환자 유래 종양 세포를 배양할 때, ecDNA 인자가 시간이 지남에 따라 손실되어 질 수 있다는 점은 흥미로우며, 이는 ecDNA의 유지를 위한 세포에 대한 적합성 비용(fitness cost)을 의미한다. 또한 진단 및 재발 시 신경교종 샘플 분석을 통해 ecDNA 종양 유전자 증폭은 시간이 지나도 유지되어 질 수 있다는 것을 보여 주었으며, 이는 종양에 있어 적합성 비용을 줄일 수 있는 가능성을 제공한다. 동일한 종양 유전자를 가지고 있는 고유의 ecDNA를 포함하는 경쟁하는 서브 클론들이 서로 다른 시점에서 다른 빈도를 가지고 있음이 보고되었고, 이는 지속적인 수렴 진화의 과정을 의미한다. 또한 다른 종양 유전자(MYC와 EGFR)를 운반하는 다수의 서로 다른 ecDNA들도 확인되었으나, 이러한 관찰이 개개의 세포가 다양한 ecDNA를 포함함을 의미하는지 또는 공존하는 서브클론들을 반영하는 것인지는 아직 불확실하다.

이러한 연구들을 종합해 볼 때 ecDNA 생물학의 공통된 주제가 떠오른다. ecDNA를 보유하고 있는 암은 치료와 같은 환경 변화에 더 빠르게 대응할 수 있다. 종양 세포는 경쟁적인 미세환경(microenvironment)에서 끊임없이 변화하는 환경 스트레스로부터 영향을 받는다. 그들은 영양소를 얻기 위해 경쟁하며, 면역 감시를 피하려 하고, 다수의 화학요법, 표적 요법, 방사선 요법의 대상이 된다. ecDNA의 다른 유전 기작과 종양 내 유전적 이질성 유지를 위한 그들의 효율성은 빠른 유전적 다양성을 촉진하고 환경 변화에 적합한 세포의 선택 가능성을 향상시킨다. 그러나, “ecDNA 포함한 암이 치료를 더 잘 회피할 수 있는지?”, 그렇다면 “어떤 기작에 의해 가능한지?”는 향후 추가 연구가 필요할 것이다.

5. ecDNA의 영향

ecDNA 기반 종양 유전자 증폭은 그들 고유의 유전 기작을 통해 암 진화 촉진에 중요한 역할을 하며, 이는 암이 변화하는 환경에서 빠르게 변화할 수 있도록 도와준다. 그런데 “ecDNA는 염색체 DNA와 다르게 기능하는가?”에 대한 답과 관련하여 유전체의 공간적 구성은 그것의 기능을 결정하는데 중요하다. 인간 세포에서 DNA는 23쌍의 염색체로 나뉘며, 핵에서 구별된 영역으로 세분화 되어지고, 계층적으로 조직화 되어진다. DNA는 히스톤 옥타머 주위에 감겨 뉴클레오솜(nucleosome)으로서 조직화되며, 뉴클레오솜의 위치는 세포의 전사 및 조절 시스템에 대한 크로마틴 접근성(chromatin accessibility)을 결정한다. 이러한 역동적인 과정은 크로마틴 루프(chromatin loop)로 더 조직화되어, 이는 전사 및 조절 인자의 상호작용이 어떤 유전자를 발현시킬지 결정하는 insulated domain을 만든다. 암에서 위상적으로 연관되어 있는 도메인(topologically associating domain, TAD)의 경계가 붕괴되는 것과 같은 공간적 구조의 변형은 종양 발병과 관련되어 있으며, 최근 연구는 암에서의 크로마틴 구조의 주요한 변형을 확인하였다. 따라서 ecDNA의 형태, 후생 유전학적 조절에서의 영향, 크로마틴 접근성, 유전자 전사에 대한 이해는 반드시 필요하다.

위에서 언급한 작은 원형 eccDNA와 유사하지만 좀 더 작은 원형 DNA 조각에 초점을 맞춘 최근 연구는 CRISPR-Cas9 편집에 의해 만들어진 킬로 베이스 크기의 원형 DNA상의 enhanced green fluorescent (eGFP)을 암호화하고 있는 유전자의 전사가 억제됨을 보여준다. 그러나 이 모델은 커다란(105-107 bp) 크기의 종양 유전자 및 조절 인자를 포함하는 ecDNA와는 매우 다르며, 이미 종양 유전자의 높은 발현 수준은 확인되었다. 암에서 크로마틴 구조, 전사 수준, ecDNA의 기능적 기여를 조사하기 위한 새로운 방법들을 개발하고 있고, 이는 암 발병에서의 역할에 대한 이해를 크게 향상 시킬 것이며, 염색체 또는 염색체 외 DNA가 종양 발달과 진행 및 약물 내성에 미치는 영향을 알 수 있도록 해 줄 것이다.

6. ecDNA 연구를 위한 기술 개발

ecDNA는 그들의 위치(location) 및 위상(topology) 측면에서 염색체 DNA와 다르다. 따라서 암 발병에 있어서 ecDNA상 종양 유전자 증폭의 역할을 더 잘 이해하기 위해서는 새로운 방법이 개발되어져야 한다. 현재, 컴퓨터 분석에 의한 ecDNA의 뉴클레오타이드 서열을 정의하는 것은 short-read 시퀀싱 때문에 쉽지 않으며, 이는 한 번에 하나 이상의 절단 부분을 포착하기 어렵게 만든다. 주어진 샘플에서 동일한 위치에서 다수의 ecDNA가 나오거나, 유전체 분쇄(genome-shattering event)가 발생한 경우, 근거리 내에서 다중의 절단 부위가 확인되어질 수 있고 현재 short-read 시퀀싱 데이터의 표준 염색체 재배열 분석 파이프라인은 이러한 가능성들을 인식하도록 설계되어지지 않았다. 따라서 Cancer Genome Atlas에서 도출된 것과 같이 암 염색체의 구조적 재배열에 대한 현재의 분류는 ecDNA의 일부분으로서의 구조적 변형들을 표기하지 않는다. 다른 연구자들과 우리는 ecDNA의 구조를 더 잘 이해하기 위해 long-read 시퀀싱 방법을 적극적으로 이용하고자 한다. Nanopore, Pacific Bioscience 시퀀싱 플랫폼 또는 optical map technology (예를 들면 BioNano)를 이용하여 판독되어질 수 있는 5-10 kb의 long-read 서열들을 통해 다중의 절단 부위를 포착할 수 있고, ecDNA 빈도 및 구조에 대한 보다 결정적인 증거를 제공할 수 있다. 궁극적으로, 개개의 원형 DNA 분자를 완벽하게 설명하기 위해 ecDNA 시퀀싱을 위한 라이브러리 강화 방법 또는 하나의 리드에서 전체 ecDNA 구조를 결정할 수 있는 방법들이 필요하다. 또한 우리는 high-throughput short-read DNA 시퀀싱 데이터로부터 ecDNA에 대한 더 나은 해상도(resolution)를 얻을 수 있는 방법을 개발 중에 있다. 이를 통해 암에서 ecDNA의 규모, 범위, 내용과 그들의 임상적 특성과의 연관성을 더 깊이 이해할 수 있을 것이다.

이러한 전산학적 방법 개발과 더불어, 직접적으로 ecDNA와 관련된 복제, 전사, 복구 시스템의 주요 구성 인자들의 활성을 조사하기 위한 세포 생물학적 방법의 확장이 필요하다. 세부적인 수준에서 세포를 연구하기 위한 방법들은 계속 개발되고 있다. 예를 들면, CRISPR-Cas와 같은 유전체 편집 기술들의 개발과 진보된 세포 이미징 기술은 ecDNA를 생성하고 유지하는 기본적인 생물학에 대한 우리의 이해를 증진 시킬 것이다.

7. 결론과 전망

종양 유전자가 ecDNA상에서 증폭되어 질 수 있다는 재발견과 더불어 암에서 새롭게 확인된 ecDNA의 중요성은 현재 암 유전체 지도에 포함된 공간적 정보를 재고하도록 하였고, 또한 현대 암 유전체학에 흥미로운 관점을 제공한다. “유전자가 증폭되어진 곳은 어디인가?”, “어떻게 우리는 이 정보를 합리적이고 새로운 암 치료법의 설계를 위해 사용할 수 있을까?” 와 같은 기초적인 질문은 표적 ecDNA를 억제하여 암을 치료하기 위한 답으로 사용되어져야 할 것이다. “ecDNA의 형성과 유지를 위한 기본적인 기작은 무엇인가?”, “무엇이 ecDNA를 염색체 안으로 들어가게 하고, 또한 어디로 들어가게 결정하는가?”, “암에서 보여지는 절단-융합-가교, 크로모트립시스, 크로모플렉시(chromoplexy), 네오크로모좀 형성과 같은 다른 형태의 유전자 재배열은 어떻게 ecDNA와 조화될 수 있는가?”, “염색체 외 증폭은 암 치료를 위해 활용되어 질 수 있을 만큼 충분하게 고유한 암 세포 특이적인 특성을 제공하는가?”, “우리는 자연의 다른 곳에서 발견되는 원형 DNA의 행동으로부터 배울 수 있는가?” 등의 질문들로부터 종양 유전자 증폭에 대한 대화는 증폭된 유전자의 핵 내 위치와 공간적 구성이 암 발달과 진행 그리고 궁극적으로 암의 치료에 중요한 결과를 초래할 수 있다는 것을 인식하면서 재논의가 시작되고 있다.

 

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임도환(2020). 종양 발병 및 진화에서의 염색체 외(extrachromosomal) 종양 유전자의 증폭. BRIC View 2020-R19. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3537 (Jun 25, 2020)
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