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표적 단백질 분해 치료법의 개발
표적 단백질 분해 치료법의 개발 저자 지창훈 (서울대학교 의과대학 의과학과 단백질대사의학연구센터 )
등록일 2020.05.21
자료번호 BRIC VIEW 2020-R15
조회 731  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
표적 단백질 분해를 기반으로 치료학은 다음과 같은 두 가지 주요 과학적 돌파구의 수렴으로 최근에 대대적 발전과 대규모 투자가 이루어졌다: 1세대 펩타이드 계열 단백질 분해-표적 키메라(PROteolysis-TArgated Chimera; PROTAC)들의 생체 내 개념 증명을 위한 최적화 시키고 임상용 분자들이 cereblon과 DCAF15를 인식하거나 용도 변경을 통하여 분해제로 역할을 수행할 수 있도록 만드는 것 등이다. 이 발견들을 통해 일반적으로 이루어지고 있는 cereblon 계열 치료제 이용법을 임상적으로 검증하였고 치료제로써 효능이 좋을 뿐 아니라 표적 단백질의 리간드를 붙일 수 있는 E3 리가제를 인식하는 분자들을 제공하였다. 삼성분복합체(ternary complex)에 대한 생물물리학적 및 구조적 연구를 바탕으로 표적 단백질 분해 분야가 발전하고 있다. 이 리뷰에서 우리는 향후 분해 치료학을 가능케 한 기초 발견들을 요약하며, 특히 E3 리가제들을 비 기존 표적 단백질로 연결할 수 있는 저분자 화합물들의 종류에 대해서 초점을 맞춘다.
키워드: 의약화학(medicinal chemistry), 약리학(pharmacology), 저분자 화합물(small molecules), 독물학(toxicology)

본 자료는 Development of targeted protein degradation therapeutics. Nat Chem Biol 15, 937–944 (2019). 의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.
 

목 차

1. 본론
2. 표적 단백질 분해의 수렴발견들
3. 분해제에 대한 약리학적 고려 사항
4. 다양한 리가제 사용의 기회와 위기
5. 분해를 통한 차별화 된 치료법
6. 물리화학적 특성 및 설계 고려 사항
7. 약물로 치료 가능한 프로테옴의 확장에 대한 의미


1. 본론

표적 단백질 분해는 저분자 화합물-리간드를 이용해 세포 내 단백질 항상성(protein homeostasis) 조절 기전을 재지향(redirect)시키는 신규 치료법이다. 세포 내에서, 단백질들은 E3 유비퀴틴 리가제로 인해 선택적으로 선별되고 분해를 위해 유비퀴틴 사슬로 표지된다. 표적 단백질들은 이러한 유비퀴틴 사슬에 의해 프로테아좀으로 전달되고, 접힘이 풀리며 분해가 된다. 이를 통해 질병관련 단백질들 또한 선택적으로 분해시킬 수 있기 때문에, 저분자 화합물을 이용해서도 이 기전을 활성화 시킴을 통한 향후 표적 단백질 치료제 발견에 크게 기여할 가능성이 있다. 억제와 비교했을 때, 분해는 표적 단백질 및 관련된 모든 기능의 제거를 포함하여 수많은 이점을 제공한다. 분해제의 독특한 특성은 차별화된 치료법뿐만 아니라 이전에 저분자 화합물 치료법으로 접근할 수 없었던 단백질(undruggable protein)에 발병되는 질병을 해결할 수 있는 기회를 제공한다. 개념적 장점에도 불구하고, 분해 치료법은 기술적으로 복잡하며, 어떤 면에서는 저분자 화합물의 속성들에 대한 전통적인 관습과 지식이 충돌하기도 한다. 이 리뷰에서는 E3 유비퀴틴 리가제를 인식하고 재지향시키는 표적 단백질 분해제에 관련된 우리의 현재 이해 상태를 설명할 것이다.
 

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그림 1. 분해제의 향후 시장 분석.
분자접착제와 이종이기능성 분해제를 통한 약물 개발 가능한 프로테옴의 확장. 인간 프로테옴을 상대로 임상적으로 입증 된 현존하는 약물 및 단백질 분해법을 통한 신규 약물 개발을 나타내는 그래프.


2. 표적 단백질 분해의 수렴발견들

최근 몇 년간 학계와 산업계의 노력으로 인해 표적 단백질 분해 치료법에 대한 관심과 투자가 전 세계적으로 급증했다. 이러한 관심은 주요 과학적 돌파구들의 수렴을 통한 분해 치료법의 편리함과 신뢰성을 바탕으로 증가하기 시작했다. 표적 단백질 분해를 촉진시킬 수 있는 이종이작용성 리간드(heterobifunctional ligand)에 대한 학계의 최초 기술은 2001년에 “프로텍(PROTAC)”이라는 용어와 함께 등장했다. 초기 원리 증명 실험으로부터, 연구자들은 저산소증-유도성 인자 1α (HIF1α)의 펩타이드 계열 데그론(peptidic degron, 아래에 추가 설명)을 사용하여 안드로겐 수용체 또는 에스트로겐 수용체 단백질들을 Cul2-Rbx1-EloB/ C-VHL E3 리가제의 일부분인 Von Hippel Lindau 인자(VHL)에 전달할 수 있었다. 이러한 초기 실험은 in vitro 검증 및 화학 생물학 도구 생성에 유용하였으나, 생체 내 활용도가 제한되었다.

따라서 비 펩타이드 계열 이종이작용성 리간드의 개발은 이 분야의 발전에 결정적인 돌파구가 되었다. 이는 polyethylene glycol (PEG) 링커를 통해 안드로겐 수용체에 결합하는 부분에 융합된 nutlin 저분자 화합물을 이용하여 안드로겐 수용체를 MDM2 E3 리가제에 바인딩하는 것이 가능하다는 것으로 입증되었다. 다른 E3 리가제인 cIAP1 (세포사멸 억제 단백질)에 대한 저분자 화합물 결합제 또한 유용한 것으로 입증되었다. IAP-결합 이종이작용성 분자는 핵 수용체(nuclear receptors)를 포함하는 다수의 단백질의 분해를 촉진하기 위해 사용되어왔다. 이후 생체 내 단백질 녹다운을 달성할 수 있는 보다 약물-유사한 스캐폴드(scaffold)에 VHL-결합하는 부분을 최적화하는 것이 가능하다고 밝혀졌다. 생체 내 녹다운은 또한 IAP-표적된 이종이작용성 리간드로 달성될 수 있는 것으로 나타났으며, 이러한 분해제를 SNIPER (specific and nongenetic IAP-dependent protein erasers)로 명명하였다.

이종이기능성 분해제의 상당한 화학적 진보에도 불구하고, 이 분해제들이 실제 치료제로 사용 가능할지에 대해서는 회의적이였다. 이하에서 자세히 다루겠지만, 동일한 분자 내에 2개의 별개 결합 부분을 포함하기에 적합한 구조와 물리화학적 특성(physicochemical properties)을 갖는 분자를 합성하는 것에 대한 어려움에 대한 우려들이 있었기 때문이다. 확실히, 보고된 이종이작용성 리간드는 약물-유사 분자 특성에 대해 통상적으로 작용하는 ‘5의 규칙(rule-of-five)’ 가이드라인에서 크게 벗어난다. 놀랍게도, 분해치료법에 대한 임상적 검증은 이러한 통상적인 가이드라인과 완전히 평행한 발견 경로로부터 발견되었다.

역사적으로, 많은 약물들은 분자 작용 기전 및 경로에 대한 제한된 지식과 직접적인 분자 표적에 대한 지식 부족에도 불구하고 규제 승인을 얻어왔다. 지난 10년 동안, 승인된 약물들 중 두 종류는 CRL4 E3 유비퀴틴 리가제의 각각 다른 부분에 결합함으로써 실제 분자 작용 기전 및 경로가 표적 단백질 분해 치료법이었다는 것을 최근 발견하였다.

탈리도마이드(thalidomide)는 1950년대 후반 임산부의 입덧 치료제로 판매되었지만, 강력한 테라토젠(teratogen)임이 밝혀진 뒤 후에 판매가 금지되었다. 몇 년 후, thalidomide는 나병결절홍반(erythema nodosum leprosum), 나병 합병증 및 다발성 골수종을 포함한 여러 징후의 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이러한 발견에 따라 탈리도마이드는 임신 중 노출을 엄격히 금지한다는 규제 하에 임상적으로 다시 사용되게 되었다. 레날리도마이드(lenalidomide), 포말리도마이드(pomalidomide), 아바도마이드(avadomide), 이베르도마이드(iberdomide)를 포함하여 탈리도마이드보다 더 효율적인 유사체들이 Celgene에서 발견되고 개발되었다. 탈리도마이드는 2010년 탈리도마이드가 결합된 친화성 구슬(affinity beads)과 다른 실험을 통해 Cereblon과 DNA-damage-binding protein 1 (DDB1)이 직접적 분자 표적으로 증명되기 전 까지 분자 메커니즘에 대한 지식 없이 전임상 및 임상 개발에 사용되었다. DDB1은 CRL4 E3 유비퀴틴 리가제의 어댑터 단백질이며, cereblon은 이전에 DDB1 및 CUL4 관련 인자(DCAF)로 확인되었다. 후속 연구를 통해서 탈리도마이드 유사체들이 억제제 역할을 하는 대신, cereblon의 표면에 결합하여 단백질-단백질 상호 작용을 위해 핫스팟을 생성하며 Ikaros와 Aiolos같은 전사인자를 유비퀴틴화 및 분해를 위해 모집하는 신형 moiety 역할을 수행한다는 사실이 밝혀졌다.

Thalidomide와 같은 cereblon E3 리가제 조적 약물(cereblon E3 ligase modulating drugs; CELMoDs)에 대한 메커니즘 연구는 이들이 이종이기능성 분해제로서 작동하지 않음을 확인 하였다. 실제로, thalidomide, lenalidomide 및 pomalidomide(모두 <300 da)의 분자량을 갖는 분자가 2개의 개별 단백질들의 결합 포켓과 동시에 맞물릴 수 있다면 놀라울 일이다. 대신, 이 분자들은 단백질-단백질 상호 작용을 스캐폴드(scaffold) 하는 능력 면에서 여러 천연 제품과 메커니즘이 더욱 유사하다. 식물 신호 호르몬 옥신(auxin) 및 자스모네이트(jasmonate)가 보여주는 전형적인 예와 함께, 저분자량 분자에 의한 리가제-기질 스캐폴딩을 위한 식물 E3 유비퀴틴 리가제 중에 이미 선례가 존재하였다. 이 호르몬들은 동족 리가제-기질 복합체의 단백질-단백질 상호 작용을 스캐폴드 하는 것으로 나타났으며, 저자들은 이러한 작용 방식을 설명하기 위해 ‘분자 접착제(molecular glue)’라는 용어를 만들었다. 이 용어는 이종이기능성 분해제와 상이한 1) 단백질 표적에 적용할 수 있고, 2) 최적화 전략이 적용되며, 3) 밑에 기술된 바와 같이 약리학적 차이를 보이는 저분자량 단백질-단백질 유도제 사이의 구별을 포착하는 관련 용어로 남아 있다.

이후 Ikaros, GSPT1 및 CK1α와 같은 외인성 리간드에 의해 모집된 비 고유적기질(non-native substrates)인 ‘네오기질(neosubstrates)’이 모두 구조적으로 공통된 특징을 통해 모집되는 것으로 나타났다. E3 리가제로 모집되기 위한 기질적 특이점은 ‘데그론(degron)’ 이라고 명명되며 cereblon 네오기질의 경우에는 글라이신 잔기가 포함된 β-헤어핀 구조로(β-hairpin) 구성되어 있다. 이 degron은 결합된 CELMoD에 인접한 cereblon 표면과 직접 결합한다. CK1α, GSPT1 및 Ikaros/ Aiolos는 각각 구조부터 기능까지 서로 전혀 관계가 없으며, 상호 작용 도메인과 그 안의 중요 글라이신 잔가까지도 서열 동성(sequence homology)이 없다. 이러한 서열 특이성의 결여는 상호 작용 영역이 ‘’구조적 데그론’ 임을 확인하게 되었으며, 대부분의 연구된 데그론들은 펩타이드 서열의 형태를 취한다. CELMoD의 잠재적 다양성에 대한 입증으로, GSPT1 모집은 lenalidomide 또는 pomalidomide에 의해 매개되지 않는다. 이와 유사하게, CK1α는 lenalidomide의 기질이지만 pomalidomide의 기질은 아니다. 이 발견들은 리간드-결합 부위가 완전히 결핍된 단백질을 분해를 위해 표적화하는 메커니즘을 제공하기 때문에 약물 발견 분야에 매우 중요하다. 또한, 추가적인 CELMoD 네오기질의 발견을 목록화하는 작업이 계속되어 약물 발견의 새로운 장을 열고 있다.

Thalidomide 유사체에 대한 중요한 발견들에 이어, 골수종에서 임상 시험중인 저분자 인디슐람(indisulam) 또한 표적 단백질 분해를 유도하는 것으로 나타났다. 이 경우 indisulam은 CRL4 구성 요소인 DCAF15에 결합하고 CRL4DCAF15 E3 리가제를 재지향함으로써 RBM39 (RNA Binding Motif Protein 39)의 분해를 일으켰다. CELMoD와 비교하여, indisulam은 두 가지 다른 기능을 하는 분자 구조나 약리학적 특성을 가지지 않는 ‘분자 접착제’ 계열의 저분자량 화합물이다.

CELMoD에 대한 메커니즘 연구 결과는 여러 가지 방법으로 표적 단백질 분해 분야를 발전시키는 데 도움이 되었다: 효율적인 약물들이 이미 위와 같은 메커니즘으로 작용한다는 것을 보여줌으로써 표적 단백질 분해를 임상적으로 검증하였고, 저분자량 치료제가 리가제-기질-리간드 삼성분복합체(ligase-substrate-ligand ternary complex)의 조립을 효율적으로 유발할 수 있으며 우수한 약물 유사 특성을 가진다는 것을 입증하였고, 적절한 결합 부위의 결핍으로 인해 약물이나 심지어 리간드 개발이 불가능하다고 생각된 단백질 계열들을 분해할 수 있음을 보여주었을 뿐만 아니라 차세대 이종이작용성 리간드에 사용될 수 있는 매우 효율적인 화학적 스캐폴드를 제공했다. 실제로, 적절한 링커를 사용하여 표적-결합 부분을 thalidomide 부분에 연결하면 CRL4CRBN E3 리가제가 동원되어 빠르고 강력하게 BRD4 및 FKBP12 단백질을 분해할 수 있음이 입증되었다. 이후의 노력을 통해 위와 같은 접근법이 BTK, BCR-Abl, FKBP12, BRD9 및 CDK6를 포함한 다양한 단백질을 분해 할 수 있음을 입증했다.

이렇게 이종이기능성 분해제에 대한 연구는 표적 단백질 분해 분야의 발전을 위한 개념적 검증과 화학적 도구를 제공할 수 있는 임상 작용 메커니즘 연구와 함께 진행되었다. 우리는 추후 분자 접착제와 이종이기능성 분해제의 각 분야에서 많은 임상적 성공을 기대한다. 아래 섹션들은 단백질 분해 분야에서 약물 발견 노력을 촉진시키기 위한 특정 고려 사항 중 일부를 간략하게 설명하고, 특히 비천연 기질의 분해를 위해 E3 유비퀴틴 리가제를 결합시키고 재지향시키는 메커니즘에 중점을 둘 것이다.

3. 분해제에 대한 약리학적 고려 사항

단백질 분해제들은 표적 단백질을 고갈시키기 위해서 촉매 방식으로 작용하는 세포에서 효소 복합체(enzymatic complex)를 형성한다. 이와 같이, 최근 수십 년 동안 제약 연구를 지배해온 가역 약물(reversible drugs)들은 여러 방면에서 단백질 분해제들과 대조된다. 질병-유발 단백질의 촉매 활성을 억제시키는 주 기전이 치료적으로 좋지 않은 점이 있었으며 유전자 녹다운 접근법과 같은 후보 치료 표적 확인법과 비교하여 다른 결과를 야기하였다. CRISPR 돌연변이 스캐닝 접근법을 통해 표적 단백질에서 개별 도메인의 기능적 차이를 확인할 수 있으며, 이는 억제 전략에 제한을 가하는 의미를 띈다. 그에 반해, 표적 다중 도메인을 가지는 단백질에서 임의의 도메인을 통한 E3 리가제 모집은 타겟 도메인뿐만 아니라 전체 단백질의 분해를 초래할 수 있다. 추가적으로, 분해는 단백질의 모든 기능을 제거하기 때문에 비촉매 기능으로 질병을 유발하는 단백질을 공격할 수 있는 기회가 된다.

E3 리가제에 임의의 표적 단백질을 모집하는 전략적 장점으로는 유비퀴틴 리가제의 효소적 활성을 이용한 높은 기질 회전율(substrate turnover)로 표적 단백질을 신속하게 유비퀴틴화하는 것이다. 따라서 단일 저분자 리가제 조절제로 많은 표적 단백질 분자의 파괴를 유도할 수 있다. 촉매 증폭 능력은 강한 표적 억제 및 지속성을 가지는 약리학이 유리한 반면, 적당한 결합력을 갖는 화합물들의 강력한 치료 효과를 예상할 수 있다. 약물 농도가 감소함에 따라 효과를 상실하는 가역적 저분자 억제제(reversible small-molecule inhibitors)와 달리, 단백질 분해제는 오래 지속되는 표적 억제 및 강력한 생물학적 효과를 유발할 것으로 예상된다. 이러한 이종이기능성 분해제의 동역학적 측면은 이미 상세하게 논의되어왔다.

표적 단백질 분해제들에 대한 중요한 고려 사항은 표적 단백질의 재합성 속도(re-synthesis rate)이다. 분해제는 궁극적으로 표적의 항상성 조절(homeostatic regulation)을 극복해야만 레벨 억제가 가능하며, 이는 높은 합성 속도 및 제거율을 갖는 단백질의 경우 훨씬 더 어렵다. 재합성 속도는 단백질마다 상당히 다양하며, 치료적으로 가장 매력적인 표적 단백질 중 일부는 이미 세포에서 빠르게 분해되고 있다.

단백질 분해를 통한 공통적인 이점이 있지만, 분자 접착제와 이종이작용성 분자 사이에는 중요한 약리학적 차이가 있다. 이종이작용성 분자는 리가제 및 기질 각각에 대한 결합 친화도(binding affinity)를 가지며, 이는 리간드가 각 단백질 표적에 독립적으로 결합하는 능력을 갖는다는 것을 의미한다. 그래서 더 높은 리간드 농도에서 개별 이원 복합체가 포화되어 E3 리가제-기질-리간드 삼성복분합체의 형성을 위해 경쟁하게 된다. 이 현상은 ‘후크(hook)’ 효과로 설명되어 있으며, 높은 리간드 농도에서 분해 효능의 손실로 나타난다. 대조적으로, CELMoD는 결합되지 않은 기질(free substrate)에 대해 측정 가능한 결합 친화도가 없기 때문에, 이러한 농도 의존적 현상을 나타내지 않는다.

이종이기능성 분해제들의 생체 내 활성에 대한 보고는 여전히 미미하고, 임상 연구에 진입한 분해제들을 활용한 연구의 수 또한 적기 때문에, 약물 동력학에 따라 투약 후 리간드 농도가 상승 및 하강할 때 후크 효과가 생체 내에서 나타날지는 아직 확실치 않다. 하지만 화합물 수준이 어느 정도 일정하게 유지된 인 비트로(in vitro) 실험에서 관찰되었듯이 순환 되고 있는 리간드의 제거를 통해 후크 효과를 어느정도 방지할 수 있을 것이다. 또한, 표적-결합 부분이 표적 단백질 기능 자체를 효과적으로 억제 할 수 있는 경우, 전체적인 효능에 대한 약리학적 기여는 ‘후크’ 기간 동안 지속될것이다.

표적 단백질 분해 치료법의 이러한 발견은 촉매 특성으로 인해 약동학(pharmacokinetics)을 약역학(pharmacodynamics)과 효능으로부터 분리할 수 있는 매우 강력하고 지속되는 표적 억제의 가능성을 제시한다. 표적 단백질의 전형적인 억제제는 일반적으로 투여 주기(dosing cycle) 전체에 걸쳐 표적 단백질과의 완전한 결합이 유지되는 최대 효능(안전성과 내약성 고려 사항 제외)을 유도할 것으로 예상된다. 이것은 단백질 결합 조절된 Ctrough농도(투여 주기 동안 도달된 약물의 최저 농도)가 표적에 대한 IC90 (90% 억제가 달성되는 농도)보다 높아야 할 수도 있다. 표적 단백질의 농도가 투여 주기 내내 대략 일정하게 유지되는 것을 감안했을 때, 혈장 단백질(plasma proteins)과 표적 단백질 사이의 평형상태 및 억제제에 작용하는 제거 메커니즘은 표적 점유율(target occupancy)의 조절을 통해 상대적 화학양론(relative stoichiometry)을 제어하기 위해 함께 작용할 것이다. 하지만 동일한 표적 단백질에 대한 분해제는 의도적으로 표적 단백질 농도의 감소를 유발할 것이며, 이러한 감소는 이종이기능성 분해제 분자에 대한 제거 곡선(clearance curve)과 교차하여 유리한 상대적 화학양론을 야기할 수 있을 것이다. 그리고 어느 정도 분해제 농도가 감소되더라도 여전히 단백질 재합성 속도에 뒤쳐지지 않을 수 있다.

4. 다양한 리가제 사용의 기회와 위기

인간 프로테옴에는 약 600종의 E3 유비퀴틴 리가제가 있을 것으로 추정되어, 미래 치료제 개발에 거대한 기회를 제공하고 있다. 표적 단백질 분해 분야의 전체 원리는 리간드로 유도된 표적 단백질-리가제 근접성에 의존하기 때문에, E3 유비퀴틴 리가제 및 표적 단백질의 공간적 및 시간적 공존(spatial and temporal colocalization)이 필수적이다. 표적 단백질의 조직 내 발현, 세포 내 위치 및 조절 메커니즘의 차이는 모두 잠재적인 함정이자 기회로 작용할 수 있다. Cereblon이 Ikaros 및 Aiolos와 같은 핵 단백질에 대해 임상적으로 강력한 활성을 보여주는 것이 그 예이다. 추가적 고려 사항은 리간드 첨가에 의해 용도가 재지향되는 리가제의 생물학적인 영향력이다.

이종이작용성 분해제에 대한 초기 연구는 기질과 리가제 두 가지에 대한 리간드를 변경하여 연구해왔다. IAP와 MDM2 리가제 모두 암과 관련이 있으며, 이 리가제들에 결합하는 저분자 화합물들이 질병에서 이들의 기능을 변화시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서 보고된 리간드들은 이종이작용성 리간드의 일부분으로 사용 가능하지만, 원래 설계된 활동을 계속 유지한다. IAP 리가제들을 표적으로 하는 SNIPER 접근법은 리가제를 저분자 화합물과 결합 시킴으로 이 리가제들의 분해를 유발할 수 있음을 보여 주었다. 이 특성은 이종이작용성 리간드들에서 유지되나, 이 현상을 우회할 수 있는 유사체들도 보고되어왔다. 이 효과는 cIAP1이 발암 단백질이기 때문에 임상적으로 잠재적인 이점을 제공할 수 있지만, 리가제 농도가 감소함에 따라 기질 분해 효율의 잠재적인 손실이 있을 수 있다. 유사하게, MDM2는 p53의 유비퀴틴화를 담당하는 자연적인 기능이 있으며, MDM2 리가제 결합제들은 p53 단백질의 분해 억제를 목적으로 개발되었다. 결과적으로, 이종이작용성 저분자 화합물로 MDM2를 재지향 시키는 전략은 p53의 분해억제의 추가 기능적 결과를 가져올 수 있다. 대조적으로, VHL은 저산소중-유도성 인자 1(HIF-1)의 유비퀴틴화를 매개하는 종양 억제 단백질이다. VHL을 기반으로 하는 분해제들이 VHL-기능 상실 돌연변이(loss of function mutants)와 관련된 임상적 문제들을 유발하지 않는 효율적 작동법은 여전히 연구 중이다.

대조적으로, thalidomide와 결합하는 포켓이 식물 및 곤충에서도 100% 아미노산 서열 동일성(amino acid sequence identity)을 나타냄에도 불구하고 cereblon이 리간드에 의해 또는 유전적으로 녹다운될 때 비교적 추가기능을 보이지 않고 ‘침묵’하는 것으로 보아 cereblon의 세포 내 기능은 강력하게 조절되고 있는 것으로 보인다. 대규모의 연구적 및 임상적 투자가 있었음에도 불구하고 cereblon에 대한 생물학적 연구는 글루타민 합성 효소, AMPK (5’ AMP-activated protein kinase) 및 MEIS2 (Meis Homeobox 2)의 조절 외에는 알려진 바가 많지 않다. 따라서, cereblon을 조절하는 저분자 화합물을 이종이작용성 리간드에서 리가제-결합 부분으로 사용하는 전략은 기회뿐만 아니라 위험 또한 초래한다. 현재까지 보고된 cereblon과 결합하는 이종이작용기능성 리간드들의 모든 예는 임상적으로 승인된 CELMoD로부터 유래된 리가재-결합 모티프를 사용한다. cereblon의 네오기질 활성은 이종이작용성 리간드에 유지되어 의도하지 않은 ‘표적 외(off-target)’ 활동으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 이종이작용성 분자들로 네오기질 Ikaros와 Aiolos의 분해가 확인되었는데, GSPT1 분해는 항 증식(anti-proliferative) 효과를 유발할 수 있는 표적 외 활성을 가지는 것으로 보고되었다.

Cereblon을 표적으로 하는 전략의 위험성으로는 1950년대 thalidomide로 인한 선천적 결함의 원인인 기형 유발(teratogenic) 영향을 유지할 가능성이 있다. 따라서 이러한 효능의 분자적 기전을 확인하는 것은 분해제 분야에서 보다 안전한 약물을 개발하는 데 상당한 도움이 될 것이다. 두 개의 독립적인 연구를 통해 배아전사인자 SALL4가 thalidomide로 인해 강력하게 분해되는 네오기질임을 입증함으로 thalidomide의 기형 유발 효과에 대한 분자 메커니즘을 설명하였다. SALL4와 배아병증(embryopathy) 사이의 연결은 인간 유전학 및 동물 모델 실험에 의해 입증되어왔다. 인간 생체 내 SALL4 활성을 감소시키는 돌연변이는 thalidomide로 유발되는 배아병증과 매우 유사한 임상적 증상을 나타내어 오진으로도 많이 이어져 왔다.

인간 SALL4 발현의 반수부족(haploinsufficiency)은 임상적 배아병증을 유발하기에 충분하며, 이는 SALL4 하향 조절(downregulation)의 유전적 및 약리학적 효과의 인과를 나타낸다. SALL4의 기형 유발성(teratogenicity)을 입증하는 결과 중의 하나로 쥐와 같이 내성을 보이는 종에서는 그렇지 않지만, 토끼와 같이 민감한 종의 태아에서는 thalidomide에 의해 SALL4가 강력하게 고갈되는 것이 밝혀졌다. 또한, 인간 cereblon을 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 쥐는 다른 네오기질들을 분해하지만 쥐 SALL4는 분해하지 않으며 기형 유발 영향에 내성을 보인다. 중요하게도, SALL4의 분해를 유도하는 것은 CELMoD만이 아니다; cereblon을 통해 작용하는 이종이작용성 분자들 또한 SALL4를 분해한다고 밝혀져 왔다.

SALL4 분해가 cereblon과 결합하는 약물의 기형 유발성으로 인한 임상적 위험에 기여하는 유일한 메커니즘인지는 여전히 불확실하다. 네오기질들의 종류에 대한 지식은 지난 몇 년 동안 급격히 증가됬으며, 특히 C2H2 징크 핑거(zinc finger) 계열의 단백질들에서 예상했던 것보다 더 많은 네오기질을 모집할 수 있는 cereblon의 능력을 강조하였다. 이것은 ‘새로운 치료할 수 있는(newly druggable)’ 표적의 식별을 위해 중요하다. 또한 CELMoD와 cereblon에 의존하는 이종이기능성 분해제의 발견과 개발에서 표적 외 활동에 대한 연구가 향후 약물 개발에 중요할 것이다.

저분자 화합물에 의한 E3 리가제들의 재지향을 보이는 성공적인 첫 예들을 기반으로 많은 추가적인 리가제들 또한 이러한 방식으로 용도 변경 될 것으로 예상된다. 이러한 방식으로 리가제들을 식별하는 방법은 아직 이론적이나, 초기 실험 결과를 통해 이 발견 과정을 가속화할 수 있는 원리들을 규명할 수 있다. 이러한 리가제 선별을 위해 효율적인 리가제와 결합하는 저분자 화합물의 필요성은 상당한 선행 자원 투자를 제시한다. 융합 단백질을 사용하여 비고유 기질을 모집하고 유비퀴틴화 하는 능력을 조사했을 때, 6개의 리가제 중 5개가 이러한 방식으로 용도 변경될 수 있다고 보고되었다. 또한, 활성-기반 프로파일링(activity-based profiling)을 위해 개발된 기술은 리가제-결합제의 식별에 비교적 빠른 경로를 제공하며, 이러한 첫 예들을 기반으로 다양한 리가제들이 이종이작용성 리간드로 용도가 변경되었다.

5. 분해를 통한 차별화 된 치료법

기존의 가역적 억제제는 간단한 방정식으로 설명되는 방식으로 표적과 결합해야 한다. 대조적으로, 표적에 대한 결과적인 효과를 달성하기 위해, 분해제는 단순한 리간드-표적 상호 작용 이외에 추가의 세포 인자를 포함하는 다단계 과정을 필요로 한다. 주요 단계는 저분자 리간드와 E3 유비퀴틴 리가제 효소 사이의 삼성분복합체의 형성을 포함한다. 이 E3 유비퀴틴 리가제를 포함하는 복합체는 효율적인 유비퀴틴 전달이 가능해야 하며, 기질이 프로테아좀으로 분해될 수 있는 방식으로 표면 라이신(lysine) 잔기에 결합되기 전에 유비퀴틴-활성화 효소(E1 ubiquitin-activating enzymes) 및 유비퀴틴-접합 효소(E2 ubiquitin-conjugating enzymes)의 순차적인 단계가 선행된다. 유비퀴틴화된 기질은 또한 탈유비퀴틴화 효소(deubiquitinating) enzymes; DUBs)에 의해 촉매 되는 유비퀴틴 제거에 대해 충분한 내성을 보여야 한다. Harvard와 Celgene의 연구진은 E2 유비퀴틴-접합 효소 UBE2G1과 UBE2D3가 순차적으로 작용하여 Ikaros와 GSPT1과 같은 알려진 cereblon 네오기질로 효율적인 유비퀴틴 전달을 가능하게 한다는 것을 밝혀냈다. 유비퀴틴 전달 후에 cereblon 네오기질들이 프로테아좀으로 분해되기 위하여 단백질 p97이 필요하다는 것이 밝혀졌다. 또한 추가 분해제가 개발됨에 따라, 분자, 리가제, 조직, 유기체 및 환자 집단에 걸쳐 얼마나 세포 시스템이 공유되는지 연구될 것이다.

분해제들의 다수의 세포적 구성 요소에 대한 의존성은 발견 과정에 복잡성을 추가하고 임상적 비효율성에 가능성을 높일 수 있다. 그러나 이 복잡성은 동시에 치료제 개발 단계에서 차별화를 부여할 수도 있다. 예를 들어, 분해의 선택성은 무차별적으로 표적과 결합하는 리간드로부터도 달성될 수 있음이 입증되었다. 이종이작용성 분자들의 리가제-결합 부분과 이어진 무차별 인산기 전이효소를 사용한 연구는 결합 친화도와 분해 사이에 상관관계가 거의 없음을 보여 주었으며, 일부 경우에는 삼성복분합체 형성 속도가 더 중요하게 작용한다는 것을 밝혔다. 적어도 현존하는 분해제에 관해서, 리가제-기질 사이에 강한 선호도가 존재할 수 있으며, 일부 기질들은 특정 리가제에 의해 분해되기 쉬우나 다른 기질들은 그렇지 않은 것으로 보고되어왔다.

차별화된 분해 치료법에 대한 하나의 응용법은 고도의 보존률을 보이는 단백질 계열에서 선택성을 달성할 수 있는 기회를 제공하는 것이다. 인산기 전이효소 관해서, 다양한 삼성복분합체 형성은 CDK4-CDK6 이중 억제제로부터 선택적 CDk6 분해제의 발견을 가능하게 하였다. 이 연구는 임상적 CDk4/ 6 이중 억제제인 팔보시클립(palbociclib)이 표적-결합 부분으로 사용되었고, cereblon 결합제로 E3 리가제를 동원하였다. 링커의 화학적 구성을 변화시킴으로써, 해당 연구진은 CDK6에 대한 선택성을 갖는 분해제들을 제공하였다. 이러한 링커의 화학적 구성 변화로 인해 분해제의 p38δ와 p38δ 사이의 선택성 또한 입증되었다.

삼성복분합체를 스캐폴딩 하는 이종이작용성 리간드의 첫 번째 결정 구조(crystal structure)는 도구 화합물(tool compound)인 MZ1과 BRD4의 브로모도메인(bromodomain)에 결합된 VHL의 구조였다. 구조적 연구와 함께, 일부 화합물이 위의 결정 구조 연구에서 높은 협동성에 대한 가능성을 입증하기 위해 생물물리학적 실험이 진행되었다. VHL과 BRD4에 대한 연구와는 달리, cereblon을 기반으로 한 시스템에 대한 연구에서는 양성 협동성(positive cooperativity)에 대한 증거는 발견되지 않았다. 이 연구에서는 이종이작용성 리간드에 동등하게 결합할 수 있는 경우에도 단백질들의 삼성복분합체를 차등적으로 감소시키기 위해 위의 시스템의 음성 협동성(negative cooperativity)를 이용함으로써 선택성을 달성했다. 이와 유사하게, BTK-cereblon 이종이기능성 시스템에 대한 보고들에서도 협동성에 대한 증거는 거의 발견되지 않았다. 물론, 이 결과들은 상이한 이종이작용성 리간드 또는 기질 시스템과 함께 cereblon을 사용한 양성 협동성의 가능성을 배제하지는 않는다.

E3 리가제들이 표적 단백질 분해를 위해 조작 될 때 발생하는 다단계 작용 메커니즘은 성공의 주요 장애물이 될 수 있는 추가적인 복잡성을 가져오지만, 고전적인 억제제와의 차별화 기회를 제공한다는 것은 분명하다. 적절한 상황에서, 분해 치료법을 통해 달성될 수 있는 선택성 프로파일은 고전적인 결합 및 억제 단독으로는 달성할 수 없을 가능성이 있다. 유사하게, 다수의 세포 인자에 의존하기 때문에 리가제 및 표적이 편재적으로 발현되는 조직 내에서도 특이적 분해의 기회가 존재할 수 있다. 따라서, 단백질-단백질 상호 작용이 이종이작용성 분자의 활성에 반드시 필요한 것으로 보이지는 않지만, 잠재적 이점에 대한 명백한 입증이 이루어져 왔다. 따라서 이종이작용성 분자는 분자 접착제를 갖는 특성 범위에 있는 것으로 간주될 수 있다. 분해 선택성의 초기 예들은 경험적 방법을 통해 식별되었지만, 과학계의 관심이 높아지고 계산과학 도구(computational tool)의 적용으로 인해 차세대 치료법의 발견을 위해 추가적 합리적인 접근법이 이용될 수 있을 것이다.

6. 물리화학적 특성 및 설계 고려 사항

각각 다른 리가제들을 재지향시키는 생물학적인 차이 외에, 현재 이용 가능한 리가제 결합제들 사이에서도 물리화학적 차이와 관련된 인자들이 또한 존재한다. Cereblon과 결합하는 부분들은 현재 가장 낮은 분자량을 제공하고 분자 접착제 화합물로서 임상적으로 검증되었기 때문에 실질적인 이점을 갖는다. 임상적 분자접착제 약물들은 바람직한 분자량 및 ‘5의 규칙’과 같은 특성과 관련하여 역사점 관점을 준수합니다. 그러나, 이종이작용성 분자에 관한 현재의 문헌은 이러한 개념에 도전하고, 승인된 약물 특성의 경계를 더욱 넓힐 것으로 예상된다.

이종이기능성 분해제 부류의 분자에서 고강 투여 및 중추 신경계 노출을 달성하기에 적합한 적절한 물리화학적 및 흡수, 분포, 대사 및 배설(ADME) 특성을 얻는 것과 관련한 부분은 상당한 도전이며, 이러한 부분에서 유연한 분자를 사용하면 물리법칙에 구속되어 있어도 디자인과 최적화에 대한 체계적인 접근을 통해 놀랍도록 유용한 결과를 얻을 수 있다. 단일 기능성 방식(unifunctional modality)에 의해 약리학적 효과를 발휘하는 유사한 분자량 범위(~700-900 Da)의 작은 분자와는 달리, 이종이기능성 분해제들은 도메인 구성(표적 결합 부분, 링커, 리가제 결합 부분)으로 이루어져 있기 때문에 분자의 설계를 통한 추가적인 제어를 가능케 한다. 이 세 가지 영역이 반드시 배타적일 필요는 없고 전체적으로 협력해야 하지만, 개별적으로 고려하는 것도 유용할 수 있다.

유리한 물리화학적 특성의 가능성을 극대화하기 위해 전체 분자량을 조절 가능한 최저분자량으로 유지하려는 의도의 디자인전략으로, 타겟-결합 부분(target-binding moiety; TBM)과 리가제-결합 부분(ligase-binding moiety; LBM)의 분자량을 낮출수록 링커 영역에 더 유리한 특성을 부여할 수 있다. 이 관점에서, 리간드 효율에 대한 현대 의약화학 원리의 적용은 설계에서 중요한 측면이다. 표적화된 전형적인 기본 분자 프로파일이 가장 높은 친화도를 보이는 리간드로 표적과의 결합력을 최대화하기 위해 추구되는 패러다임인 저분자 억제제와 달리, 표적 단백질 분해 메커니즘은 표적에 대한 결합력이 비교적 덜 요구된다. 이와 같이, TBM과 동등한 효율을 보이고 더 간결한 리간드는 분자량적 관점에서 더 낮은 분자량을 달성할 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 경우에 따라, 가장 근접한 상동체(homolog)에 비해 원하는 특이성을 달성하기 위해 다소 더 크고 더 높은 결합력을 보이는 TBM이 필요할 수 있다.

LBM과 관련하여, 특히 리가제의 선택을 포함한 많은 고려 사항이 고려되어야 한다. 이종이기능성 분해제의 경우, 역사적으로 사용된 가장 일반적인 E3 리가제는 cereblon 및 VHL이다. 이 리가제들 사이의 세포 생물학적 차이뿐만 아니라 이종이기능성 분해제에 일반적으로 사용된 각각의 LBM들은 분자량과 본질적인 물리화학적 특성이 상당히 다르며, 이는 분해제들의 완전체의 전체적인 특성에 각기 다른 영향을 끼친다. 분해제의 생체 내 효능과 약동학을 극대화하기 위해서 TBM과 링커가 다른 여러 상황에서 정량적으로 분해제의 물리화학적 및 ADME 특성에 대한 전반적인 영향을 평가하려는 분석 체계는 아직 없는 상황이다.

이러한 이종이기능성 분해제의 링커 부분은 여러 전문가들에 의해서 구강 및 흡입 전달 편이성과 혈액-뇌 장벽을 통과하는 관건에 제일 중요한 도메인으로 여겨진다. 이것은 주로 링커 부분이 삼성복분합체 형성 시 표적 단백질과 리가제 사이의 걸쳐있는 공간에서 용제(solvent)로써 노출되어 있다고 인식되기 때문이다; 그러나, 각각의 결합 포켓의 깊이에 따라 링커의 최소 일부는 표적 단백질 또는 사용된 리가제와의 직접적인 결합 상호 작용에 관여될 수 있다. 이 현상에 대한 초기 연구는 합성 접근성, 다양한 길이와 기하적인 사항을 고려해 PEG (polyethylene glycol) 링커를 사용하였다. 하지만 지난 몇 년 동안 링커 제작 기술과 지식은 크게 발전했으며, PEG는 이제 인간 임상적보단 연구적 상황에서 쓰여지고 있다. 실제로, PEG 링커를 알킬 사슬(alkyl chain)로 대체하여 BRD9을 분해하는 이종이작용성 리간드를 최적화하였다. 신규 링커 디자인들은 엔트로피(entropy), 수용성 용해도, 투과성 및 대사성을 포함한 여러 측면에서 최적화 중에 있으며, 동시에 표적 단백질 및 리가제로부터 결합/ 분리성도 고려한다.

7. 약물로 치료 가능한 프로테옴의 확장에 대한 의미

이종이기능성 단백질 분해제의 제일 매력적인 잠재성 중 하나는 역사적으로 치료제를 개발할 수 없다고 여겨져 왔던 단백질들이 연구의 대상으로 고려될 수 있다는 것이다. 현재까지 대략 600개의 단백질이 임상 후보 물질에 의해 표적화된 것으로 추정된다. 유비퀴틴 리가제 조절제들의 이종이작용성 및 분자접착체 리간드들은 위에서 설명 된 바와 같이 공통적인 장점을 가지고 있으나, 이들 간의 분자적 차이는 그들의 활용도와 화학적 및 약리학적 특성에 상당한 차이가 있음을 의미한다. 분자접착제들은 이종이작용성 계열 리간드들보다 훨씬 낮은 분자량을 가질 수 있으며, 이는 약동학적 특성이 우수한 치료제의 개발에 실질적인 이점으로 작용한다. 이 분자적 고효율은 아마도 복합체 내의 단백질 표면들에서도 결합력이 증가된 것에서 기인되었을 가능성이 높다. 따라서, 단백질 표면이 리간드뿐만 아니라 서로 결합이 가능해야 하기 때문에 ‘분자접착제’ 접근법의 적용 가능성은 상당히 제한된다. 이러한 이유때문에 Cereblon 조절제들의 기질들은 구조적으로 상동성을 띄는 네오기질 데그론(neosubstrate degron)을 포함한 Ikaros, CK1α 및 GSPT1과 같은 기질들로 제한된다.

E3 리가제를 재지향시키는 위에 기재된 두 가지 접근법 모두 약물 개발 가능한 프로테옴(druggable proteome)을 확장시킬 수 있지만, 결과는 다르다: 이종이작용성 리간드는 여전히 표적 단백질에 대한 충분한 결합력을 보이는 리간드를 필요로 한다. 반면에 분자접착제 리간드들은 반드시 E3 리가제-리간드-기질 복합체에 일부가 아닌 표적 단백질에 대한 결합력을 보일 필요가 없다. 다만, 후자의 방법은 특정 표면 특징에 훨씬 더 의존하며, 프로테옴의 일부분에만 적용 가능하다. 두 접근법 모두 억제치료제 개발이 불가능하다고 여겨져 온 표적들에 대해 차별화된 치료 결과를 제공할 수 있다.

임상적으로 승인된 약물들의 분자접착제 접근법의 발견은 이 치료제들이 지배적으로 사용되고 있음을 의미한다. 단기적으로나마, 표적 단백질 분해제에 대한 임상적 활용도는 분자접착제 및 이종이작용성 약물 계열들 모두 사용될 것이다. 분자접착제 치료제의 경우, cereblon은 주요 구조적 degron에 의존성이 높음에도 불구하고 향후 약물들에 포함될 가능성이 높다. Cereblon의 주요 구조적 degron이 다수의 단백질들의 공통적인 도메인이라는 보고들 및 전체 프로테옴 내에서 이 degron의 풍부함(abundance)에 대한 체계적인 조사는 잠재적 표적 단백질 프로테옴을 확장시킬 것이다.

이종이작용성 리간드의 경우, 잘 정의된 임상적 집단(well-defined clinical population)에 적용 가능한 최적화 된 TBM은 실제 약물로 쓰이기 위해 이미 가역적 억제제로 검증된 리간드들일 것이다. 따라서, 억제제로서 검증된 몇몇 리간드들은 분해제로 사용할 수 있는 가능성이 높다. 예를 들어, 안드로겐 수용체(androgen receptor)는 유효하며 분해가 검증된 임상적 강력한 결합제들이 존재하며, 억제제 사용 시 나타나는 내성을 분해제로 우회할 수 있을 것으로 전망된다.

인산기 전이 효소들도 위와 유사하게 가역적 저분자 약물들이 존재하기에 분해제 개발에 활용 가치가 높다. BTK 및 IRAK4는 강력한 표적 억제, 약물 내성 돌연변이의 발견 및 추가적인 스캐폴드 기능을 타겟 할 수 있는 측면에서 억제제가 분해제보다 더 효율성을 보일 수도 있는 표적 단백질들로 각광을 받아왔었다. 그러나 분해제를 이용한 차별화 된 치료법의 가능성은 전통적으로 치료제/ 억제제 개발이 불가능하다고 판단되어온 분야들에서 더 빛난다. 예를 들어, 단백질 질환(proteinopathies) 중에서 병리학적 단백질(pathological protein)의 분해는 약물요법에 대한 확실한 표적이며, 초기 성공에 대한 징후가 있다. 실제로, 퇴행성 뇌질환과 관련된 단백질 타우(tau)의 분해제가 보고된 바 있다.

이종이기능성 리간드를 사용한 표적 단백질 분해 분야에서 편의성을 위해 현재까지의 많은 노력이 리간드화가 검증된 프로테옴에 초점을 두었지만, 향후에는 심각한 질병의 주요 단백질들을 포함한 나머지 ~18,000 개의 단백질들에 대한 영역으로 확장될 것이다. 아직 리간드화가 되지 않은 단백질들을 표적 하는 이종이기능성 분해제의 확인을 위해 추가적 연구가 필요하며, 이는 임상적 가치의 실현화를 지연시킬 수밖에 없지만 추가적인 리가제를 화학적으로 활성화하여 더 다양하고 다수의 단백질을 표적화시킬 수 있을 것이다. 표적화 단백질 분해의 두 가지 접근법들을 통해 신규 치료법의 개발이 멀지 않아 보인다.

 

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지창훈(2020). 표적 단백질 분해 치료법의 개발. BRIC View 2020-R15. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3512 (May 21, 2020)
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