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신약개발 과정에서의 오가노이드 활용 현황 및 전망
신약개발 과정에서의 오가노이드 활용 현황 및 전망 저자 김현이 (연세대학교)
등록일 2020.05.19
자료번호 BRIC VIEW 2020-T18
조회 1224  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
지난 50여 년간 2차원 배양된 세포주는 중요한 생체 외 실험모델로 분자생물학의 눈부신 발전의 바탕이 되어 왔다. 분자와 분자 간의 상호작용을 바탕으로 생명현상을 이해하고자 하는 분자생물학은 명확한 분자적 발병 기전을 바탕으로 한 합리적인 신약개발(drug discovery)의 꿈을 가능케 하였다. 배양 접시 위에서 배양된 세포주들은 발병기전 연구와 약물 표적 발굴은 물론 약물검색과 효능 및 독성평가에 필수적인 생체 외 실험모델로 활용되었다. 하지만 불멸화와 2차원 배양으로 인한 세포의 특성 변화는 세포주의 한계로 지적되어 왔다.

오가노이드는 줄기세포를 3차원 배양하여 만들어지는 생체 외 장기모사체이다. 오가노이드는 세포주와 비슷한 생체 외 실험모델로써 장기배양 및 동결보존이 가능하고 조작과 관찰이 용이하다는 장점을 가진다. 동시에 불멸화가 필요 없어 그에 따른 세포의 본래 특성이 유지됨은 물론 생체 내에서만 볼 수 있었던 세포 계층적, 조직학적 구조를 재현함으로써 세포보다 한 단계 높은 차원의 생리현상을 연구할 수 있는 실험모델이다. 이러한 특성으로 인해 오가노이드는 신약개발을 위한 전임상의 모든 단계에서 기존의 실험모델들을 대체, 혹은 보완하는 방식으로 빠르게 자리매김할 것으로 보인다.
키워드: 신약개발, 오가노이드, 질환 모델링, 약물검색, 유효성 평가, 독성 평가
분야: Cell_Biology, Medicine, Pathology

목 차

1. 서론
2. 본론
  2.1. 질환 모델링
    2.1.1. 감염병(Infectious disease)
    2.1.2. 유전질환(Hereditary disease)
    2.1.3. 암(Cancer)
  2.2. 표적 발굴 및 표적의 유효성 평가
  2.3. 유효 물질 발굴을 위한 물질 검색
  2.4. 선도 물질 발굴을 위한 유효성 및 독성 평가
3. 결론
4. 참고문헌


1. 서론

1907년, Harrison 등이 최초로 동물 세포의 생체 외 배양에 성공하였음을 보고[1]한 이래로 세포배양은 생명현상의 연구를 위한 필수적인 실험기법이 되었다. 특히 1943년에는 쥐 세포(L 세포) [2]가, 1952년에는 사람 세포(HeLa 세포) [3]가 각각 불멸화된 세포(immortalized cell), 즉 세포주(cell-line)로 확립됨으로써 동물 세포의 지속적인 대량 배양이 가능해졌다. 이는 이후 세포가 보편적이고 표준화된 생체 외 실험 모델로써 자리 잡는 계기가 된다.

초기에 확립된 세포주들은 대부분 자연적인 불멸화(spontaneous immortalization)를 통해 확립되었다. 하지만 세포의 불멸화 과정에 대한 분자생물학적 지식이 축적되고 유전공학기술이 급속히 발전함에 따라 원하는 조직 및 장기로부터 세포를 얻고 이를 인위적으로 불멸화함으로써 세포주로 확립하는 것이 가능해졌다. 또한 세포의 동결 및 보존 방법의 발달은 세포의 반영구적인 장기 보관을 가능케 했으며, 동결된 세포들은 냉동 상태가 유지되는 한 원거리 이동도 가능하게 되었다. 말하자면 언제든지 꺼내 쓸 수 있는, 각종 장기의 세포주들로 가득 찬 액화질소통 하나쯤 마련하는 것이 어렵지만은 않은 세상이 되었다.

현재 ATCC에서 확인할 수 있는 사람 세포주의 종류는 4,000여 개에 달한다. 이 다양한 세포주들은 유전체 해독의 완료, 유전자 재조합 기술 및 분자생물학적 분석 기술의 발달과 함께 분자생물학의 눈부신 발전을 일구었다. 복잡한 생명현상을 분자와 분자 간의 상호작용으로 잘게 나누어 설명하는 이 환원주의적 접근은 발병기전과 약물의 작용에 관해서도 새로운 이해의 길을 열어주었다. 이는 우연과 경험에 의존했던 전통적인 약의 발굴을 넘어, 명확한 분자적 발병 기전을 바탕으로 한 합리적인 신약개발(drug discovery)의 꿈을 가능케 하였다. 배양접시 위에서 2차원으로 배양된 세포주들은 발병기전 연구 및 표적발굴은 물론 약물의 검색과 효능 및 독성평가에 필수적인 생체 외 실험모델이 되었다.

하지만 세포주로 인해 가속된 분자생물학의 발전은 곧 불멸화된 세포의 문제점들을 드러내었다. 암세포가 그러하듯이 불멸화된 세포는 무한에 가까운 증식이 가능해지는 대신 고유의 기능을 잃는다. 게다가 생체 내와는 다른 2차원 배양환경은 세포가 본래 가지고 있었던 특성을 유지하기 어렵게 만든다.

세포에 대한 분류가 보다 세세해지고 배양액의 조성이 발전함에 따라 발생 및 성장 과정에서 잠깐 존재하다가 사라지거나, 성체에서 아주 조금만 존재하는 세포들을 배양하는 것이 가능해졌다. 이 세포들은 적절한 배양액의 조성으로 생체 내 미세환경을 재현해 주면 불멸화가 없이도 장기간에 걸쳐 자가복제(self-renewal)를 통한 증식을 한다. 또한, 특정한 환경에서는 비대칭 분열(asymmetric division)을 통해 분화된 기능성 세포를 만들어 낸다. 이들 중 배아 발생 초기에만 존재하며 거의 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체에 소량으로 존재하며 특정 몇몇 세포로만 분화할 수 있는 세포를 “성체줄기세포(adult stem cell)”라 부른다. 배아줄기세포는 개체의 발생을, 성체줄기세포는 조직의 재생을 책임진다.

세포는 본래 3차원 환경에서 성장하고 기능한다. 이웃 세포와의 결합이나 생체 외 기질(extracellular matrix)과의 3차원적 결합을 통해 조직, 장기, 개체를 형성한다. 최근 세포배양 기법의 발달은 기존의 2차원 배양을 벗어나 세포를 입체적인 환경에서 키울 수 있는 다양한 방법을 제공한다. 3차원 배양은 이웃 세포 및 생체 외 기질과의 상호작용을 복원하며, 이에 따른 3차원 세포증식은 방향성을 가진 조직의 발달과정에서 흔히 관찰되는 성장 및 분화 인자의 농도 구배차를 재현한다. 줄기세포 배양 조건의 확립과 3차원 배양 기법의 결합은 이른바 ‘오가노이드’의 개발을 가능케 하였다.

오가노이드(organoid)는 장기(organ)와 소체(小體, oid)의 합성어로써 직역하면 ‘소형 장기’이다. 하지만 소형 장기라는 번역은 자칫 ‘크기만 작은 장기’라는 잘못된 인상을 줄 수 있다. 현재 “오가노이드”라 통칭되는 3차원 세포 배양체들은 대부분 장기 고유의 세포 계층(cell hierarchy)과 조직 구조(histological structure)를 일부 재현하는 데 그친다. 따라서 소형장기보다는 “장기모세체”라는 번역이 보다 적절해 보인다.

줄기세포가 크게 둘로 나뉘는 만큼 오가노이드도 배아줄기세포 유래의 오가노이드와 성체줄기세포 유래의 오가노이드로 나눌 수 있다. 현재 배아줄기세포로 부터는 장, 위, 간, 폐, 망막, 뇌, 뇌하수체, 신장, 내이 오가노이드가, 성체줄기세포로부터는 유래의 장, 간, 췌장, 신장, 자궁, 전립선, 고환, 유선 오가노이드가 확립, 보고되어 있다 [4]. 적절한 조성의 배양액에서 3차원으로 배양되었을 때 배아줄기세포 각 장기의 발생을, 성체줄기세포는 각 장기의 재생을 생체 외에서 재현한다.

오가노이드는 불멸화하지 않더라도 배양액 조건이 잘 갖춰진 경우 세포주처럼 장기간에 걸친 생체 외 배양 및 냉동을 통한 장기보존이 가능하다. 하지만 2차원으로 배양된 세포주와는 달리 3차원으로 배양된 전분화능 혹은 다분화능 줄기세포는 자가복제와 비대칭 분열을 통해 조직 고유의 세포 계층 및 조직구조 형성에 필요한 모든 세포를 만들어 낸다. 그렇기에 오가노이드를 단일 세포로 분해한 후 다시 3차원 배양을 하게 되면 오가노이드 내에 있던 줄기세포들로부터 다시 오가노이드가 만들어진다. 즉, 세포주처럼 계대배양이 가능하다. 또한 오가노이드에서 분리된 줄기세포들에 유전적인 조작을 가하고 이를 3차원으로 배양하면 구성 세포가 모두 유전적으로 변형된 오가노이드를 얻을 수 있다. 말하자면 오가노이드는 세포주가 가진 생체 외 모델로서의 이점을 고스란히 유지하면서도 생체 내 장기의 특성을 일부 모사할 수 있는 새로운 실험모델이다.

2. 본론

신약개발의 과정에서 실험모델의 중요성은 아무리 강조해도 지나침이 없다. 신약개발을 위한 실험모델은 효능과 안정성 검증에 높은 신뢰성을 보여야 함은 물론, 관찰 및 측정과 조작의 용이성 또한 갖춰야 한다. 오가노이드는 생체 내와 생체 외 특성을 모두 가진 실험 모델로써 신약개발 과정의 초기 단계인 질환 모델링(disease model)으로부터 시작하여 표적발굴 및 표적의 유효성 평가(target identification and validation), 유효물질 검색(screening of hit), 선도물질 발굴을 위한 유효성 및 독성평가(Efficacy and toxicity profiling for lead identification)에 이르는 전임상의 모든 과정에 활용 가능하다. 지금부터 신약개발 과정에서 오가노이드의 활용 가능성을 단계별 실례들을 중심으로 살펴보고자 한다.

2.1. 질환 모델링

2.1.1. 감염병(Infectious disease)

감염병 연구는 종종 병원체의 까다로운 배양조건으로 인해 어려움에 봉착한다. 숙주에 대한 특이성으로 인해 사람 외 실험동물에는 감염이 되지 않거나 특유의 생활 주기를 가지고 있어 2차원으로 배양된 세포주와는 상호작용하지 않는 경우가 적지 않다.

사람의 위에 기생하며 위궤양과 위암을 일으키는 것으로 잘 알려진 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)가 그 대표적인 예이다. McCracken 등은 사람의 배아줄기세포를 이용하여 사람의 위와 유사한 조직구조를 가진 위 오가노이드(gastric organoid)를 만들었다. 이 오가노이드의 강(lumen) 내에 헬리코박터 파일로리를 주입하였을 때 인체와 유사한 숙주-병원체 상호작용이 일어남을 확인하였다 [5].

노로바이러스(norovirus)는 전 세계적으로 전염성 급성 장염을 일으키는 주요 병원체로 알려져 있다. 생체 외에서 노로바이러스를 배양하고자 하는 노력이 40년 넘게 이어졌지만 아주 제한적인 성공만이 보고되었을 뿐이었다. Ettayebi 등은 노로바이러스가 사람 소장 유래의 성체줄기세포로부터 만들어진 장 상피 오가노이드(enteroid)에 감염될 수 있음을 확인하였다. 장 상피 오가노이드에 접종된 노로바이러스가 증식하는 것을 발견하였으며, 이를 이용하여 담즙이 일부 노로바이러스 종의 증식을 돕는다는 사실을 밝혔다. 또한 장 상피 오가노이드가 노로바이러스에 대한 항바이러스제의 효과를 확인하는데 유용한 도구가 될 수 있음을 보여주었다 [6]. 사람 전분화능 줄기세포로부터 만들어진 장 오가노이드(intestinal organoid)에서도 노로바이러스의 증식이 확인되었다 [7]. 특히 사람 장 상피 오가노이드에 접종된 노로바이러스는 쥐 감염 모델에서는 볼 수 없었던 장 세포(enterocyte)에 대한 친화성(tropism)을 보였는데 이는 사람에서의 예상 감염 경로와 일치하는 결과이다 [8]. 그 외에도 엔테로바이러스(enterovirus), 로타바이러스(rotavirus) 등의 바이러스와 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 살모넬라(Salmonella), 대장균(Escherichia coli) 등의 박테리아 그리고 크립토스포르디움(Cryptosporidium)과 같은 기생충 등으로 인한 감염질환 모델링에 장 상피 및 장 오가노이드가 활용될 수 있음이 보고된 바 있다 [8].

임산부가 감염되었을 경우 태아의 소두증(microcephaly)을 일으키는 것으로 알려진 지카 바이러스(Zika virus) 역시 실험동물이나 세포주를 이용한 연구가 불가능하였다. Qian 등은 사람 유도만능줄기세포를 이용, 발생 중인 전뇌(developing forebrain)와 유사한 구조의 사람 뇌 오가노이드를 만들고 이를 지카 바이러스에 노출시켰다. 분석 결과 지카 바이러스가 오가노이드 내 신경 전구세포(neural progenitor)에 우선적으로 감염되며 세포사멸을 유도하여 신경세포층의 축소를 일으킴을 확인하였다 [9]. 또한 Gabriel 등은 지카 바이러스의 감염이 중심체(centrosome)의 이상에 의한 신경전구세포의 조기 분화를 유도함을 보였 주었다 [10]. 그리고 Li 등은 피질의 성장과 접힘의 감소[11]가 지카 바이러스에 노출된 뇌 오가노이드에서 관찰됨을 보고하였다.

2.1.2. 유전질환(Hereditary disease)

오가노이드는 특정 장기에 발생하는 유전질환의 모델링을 하는 데 유용하다. 환자 유래의 유도만능줄기세포나 조직검사 혹은 수술 시 얻어진 조직으로부터 분리한 성체줄기세포를 이용해 만든 오가노이드는 환자의 유전적 특성을 그대로 보유한 질환 모델이 된다.

낭성 섬유증(cystic fibrosis)에 대한 지난 10여 년간의 연구는 오가노이드를 이용한 유전질환 연구의 좋은 예이다. 낭성 섬유증은 북유럽인에서 가장 흔하게 발견되는 유전질환 중 하나로 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) 유전자의 돌연변이에 의해 발생한다. CFTR 단백질은 탄산 이온(HCO3-)과 염소 이온(Cl-)의 상피 통과 분비(trans-epithelial secretion)를 제어하며 이 단백질의 기능이 상실될 경우 점액 분비 및 점막 형성에 이상이 발생한다. Lie 등은 2012년 발표한 논문에서 2차원 배양 시 빠른 속도로 역분화(dedifferentiation)하여 기능을 잃어버리는 장 상피세포를 대신하여 오가노이드를 장 상피 연구에 활용할 수 있음을 밝혔다. 쥐의 소장에서 얻어진 성체줄기세포를 이용해 만들어진 장 오가노이드(enteroid)는 장과 유사한 수준의 CFTR 발현 및 활성을 보여주었다[12]. 이어 Dekkers 등이 쥐는 물론 사람의 장 오가노이드에서 CFTR의 활성이 유지됨을 확인하였다. 특히 forskolin을 처리하면 CFTR의 활성이 증가하며 이에 따라 오가노이드의 내부 강(lumen)으로의 액체 분비(fluid secretion)가 늘어나 “forskolin 유도 팽창(forskolin-induced swelling; FIS)”라 명명된 독특한 현상이 나타남을 발견한다. FIS는 CFTR의 활성에 의존적이었다. 즉, 돌연변이에 의해 CFTR 활성이 저해된 낭성 섬유증 환자 유래의 장 오가노이드들은 FIS가 나타나지 않았다. 오가노이드에서 일부 재현된 장 상피의 조직구조로 인한 이 특이 현상은 CFTR의 활성을 쉽게, 그리고 정량적으로 확인할 수 있는 강력한 도구가 되었다 [13].

Lancaster 등은 자체 개발한 뇌 오가노이드 제작 방법을 이용하여 유전자 이상으로 인해 소두증을 갖게 된 환자로부터 얻어진 유도만능줄기세포로부터 소두증의 특징을 가진 뇌 오가노이드를 만든 바 있다. 환자 유래의 오가노이드는 정상 오가노이드에 비해 신경 상피(neuroepithelium)의 발달이 제한적이었으며 조숙한 신경 분화가 관찰되었다. 또한 정상 유전자의 도입이 오가노이드의 소두증 표현 형질을 완화시킴을 확인하였다. 그 외에도 자폐증(autism) [14], 정신분열증(schizophrenia) [15], 파킨슨씨 병(Parkinson’s disease) [16]에 대해서도 뇌 오가노이드를 이용한 질환 모델이 제작, 연구된 바 있다.

2.1.3. 암(Cancer)

2003년, Al-Hajj 등은 유방암 조직을 구성하는 다양한 세포들 중 극히 일부만이 발암성(tumorigenicity)을 가짐이 밝혔다 [17]. 이 세포군은 자가 복제를 통해 스스로를 유지하는 동시에 비대칭 분열을 통해 암세포들을 생산함으로써 암 조직을 형성, 유지한다. 정상 조직에서의 성체줄기세포를 연상케 하는 이 특별한 세포군(cell population)은 암 줄기세포(cancer stem cell)라 명명되었으며, 지난 십여 년간의 연구를 통해 다양한 암종에서 그 존재가 확인되었다 [18].

성체줄기세포와 암 줄기세포 간의 유사성은 자연스레 암 오가노이드(tumor organoid 혹은 tumoroid)에 대한 발상으로 이어졌다. Sato 등은 사람의 정상 및 암 조직 유래 세포들로부터 오가노이드 배양이 가능함을 보여주었다 [19]. 이어 van de Wetering 등은 여러 대장암 환자들의 조직으로부터 얻은 세포들을 장 오가노이드 배양법[19]을 따라 배양하였다 [20]. 장 성체줄기세포의 유지에 필요한 보금자리 인자(niche factor)들의 공급과 함께 3차원 배양된 암 줄기세포들은 정상 줄기세포가 정상 조직의 발생을 재현한 것과 유사하게 암 조직의 발생을 생체 외에서 재현하였다. 암 오가노이드에서는 암세포의 2차원 배양에서는 볼 수 없었던 암 조직 내 세포들 간의 이질성(intra-tumor heterogeneity)이 관찰되었다. 또한 각기 다른 환자들로부터 얻어진 대장암 오가노이드들은 서로 다른 조직학적 특성을 보였는데, 각각의 오가노이드들은 그것들이 유래한 암 조직의 고유한 특성을 그대로 유지하고 있었다. 이는 암 오가노이드가 암의 또 다른 주요 특징인 개별 암 간의 이질성(inter-tumor heterogeneity)을 재현하였음을 보여준다.

이외에도 암 오가노이드는 암 질환의 모델링에 있어 여러 장점을 가지고 있다. van de Wetering 등은 외과적 절제(surgical resection)를 통해 얻어진 암 환자의 조직에 포함된 일부 정상 조직을 이용하여 정상 장 오가노이드를 만들었다. 이는 기존의 불멸화를 통한 세포 배양 방식으로는 획득할 수 없었던 정상 대조군의 확보가 가능함을 의미한다. 또한 계대 배양을 통한 장기간 배양과 동결을 통한 장기보존도 가능함을 보여주었다 [20]. 그 후로 직장암, 간암, 방광암, 난소암, 유방암, 췌장암, 전립선암의 암 오가노이드 확립이 보고되었다 [21]. 하나 주목할 만한 것은, 암 오가노이드의 확립 성공률이 전통적인 암 세포주 확립의 성공률을 크게 상회한다는 점이다. 세포주 확립의 경우 10~20% 정도의 성공률이 일반적인 반면, 암 오가노이드의 경우 보통 60~90%에 이르는 높은 성공 확률이 보고되고 있다 [22].

2.2. 표적 발굴 및 표적의 유효성 평가

질환의 발생에 직접적으로 연관된 유전자 혹은 단백질을 발견하는 것과 그 작용기작을 밝히는 것은 신약개발을 위한 표적발굴의 필수적인 첫 단계이다. 그러나 종종 발병기전에 대한 온전치 못한 정보가 새로운 표적의 발굴이 어렵게 하는데, 이러한 정보들은 보통 동물, 세포, 생체 외 실험모델, 혹은 사람에 대한 역학조사(human epidemiological study)에서 도출된 간접적인 증거들을 기반으로 한다. 동물이나 세포에서 효과를 보였던 약물들이 사람을 대상으로 한 임상시험에서 효과를 보이지 않는 일이 비일비재하다. 사람에 대한 역학조사에는 관찰연구의 근본적인 한계로 인해 인과관계가 반대로 해석되는 역 인과성(reverse causality) 도출의 위험이 상존한다 [23].

사람 유전학(human genetics)은 실험모델을 이용한 연구나 역학조사의 한계를 극복하도록 도와준다. 사람의 전장 유전체 상관성 분석(genome-wide association study)으로부터 도출된 단일 염기 다형성(single-nucleotide polymorphism, SNP) 정보 혹은 사람에게서 발견되는 기능 상실(loss-of-function) 및 기능 획득(gain-of-function) 돌연변이 정보를 질환 관련 표지 인자(disease relevant biomarker)와 연관하여 분석함으로써 신약 표적에 대한 단서를 얻을 수 있다. 최근 유전자 교정기술이 발전함에 따라 특정 SNP 혹은 돌연변이의 분자생물학적 기능을 비교적 쉽게 확인할 수 있게 되었다 [24]. 하지만 유전자 교정기술을 이용한 연구 역시 세포 혹은 동물을 실험모델로 활용해야 하는 만큼 모델 자체가 가진 한계를 벗어날 수 없다.

오가노이드는 불멸화 과정이 없고 3차원으로 배양되는 만큼 기존의 세포 배양에 비해 생체 내와 더욱 유사한 유전자 발현 양상을 보여준다. 앞서 언급된 CFTR의 경우, 기존의 방법으로 배양된 장 상피세포들에서는 그 발현 및 활성이 거의 관찰되지 않았으나 장 오가노이드(enteroid)에서는 장과 유사한 수준의 CFTR 발현 및 활성이 나타났다 [12]. 중피종(mesothelioma) 세포의 경우 3차원으로 배양 시 2차원 배양에서는 볼 수 없었던 209개의 유전자가 발현되는 것을 볼 수 있었다. 이 중 argininosuccinate synthase 1 (ASS1)이라는 유전자는 환자의 암 조직에서도 그 발현이 관찰되었던 유전자로 인위적으로 발현량을 낮출 경우 항암제에 대한 민감성이 높아지는 것을 확인하였다 [25].

또한 오가노이드는 유전자 조작(genetic manipulation)이 상대적으로 쉬워 표적의 유효성 평가에도 적합하다. 화학물질(transfection reagent)이나 바이러스를 이용한 유전자 도입 방법이 이미 잘 정립되어 있으며, 한시적인 형질전환(transient transfection)은 물론 항생제 등을 이용한 선택적 배양(culture selection)을 통해 지속적 형질전환(stable transfection)이 된 오가노이드를 확립하는 것도 가능하다. 세포주를 이용한 연구에서 유전자의 기능을 밝히기 위해 전통적으로 활용해온 유전자 조작 기법들, 즉 과발현(over-expression), knock-down, knock-out, knock-in 등이 모두 오가노이드에 적용 가능하다. 또한 CRISPR/ Cas9 등의 유전자 교정 기술을 이용하면 정상 줄기세포에 돌연변이를 도입함으로써 유전질환 모델 오가노이드를 만들거나 반대로 환자 유래의 줄기세포에서 돌연변이를 제거하여 정상 오가노이드를 만들어 낼 수 있다 [26].

Schwank 등은 낭성 섬유증 환자 유래 유도만능줄기세포의 CFTR 유전자 돌연변이를 CRISPR/ Cas9으로 교정하여 정상 장 오가노이드를 만들어내었다 [27]. Freedman 등은 다낭성 신장 질환(polycystic kidney disease)의 연구를 위해 환자 유래의 유도만능줄기세포를 신장 세포로 분화시키는 데 성공하였으나 2차원 배양으로는 질환의 병리학적 특성을 재현할 수 없었다 [28]. 이에 Freedman 등은 낭배 외피(epiblast)로 분화된 사람 배아줄기세포를 3차원 배양하였으며 특정 조건 하에서 근위 세뇨관(proximal tubule), 발 세포(podocyte), 내피(endothelium)를 가진 신소체(nephron)유사 신장 오가노이드가 나타남을 확인하였다. 또한 CRISPR/ Cas9을 통해 다낭성 신장질환의 원인 유전자로 알려져 있던 polycystic kidney disease (PKD1PDK2) 유전자들이 각각 결핍된 사람 배아줄기세포를 만들고 신장 오가노이드로 키워 본 결과, 오가노이드 내 관 구조들에서 낭이 형성됨을 확인하였다 [29].

2019년 발표된 논문에서 Artegiani 등은 담낭 오가노이드(cholangiocyte organoid)에 다양한 유전자 조작을 가하여 담낭암(cholangiocarcinoma)의 발생에 BAP1 유전자가 하는 역할을 정밀하게 규명한 바 있다. 돌연변이에 의한 BAP1 유전자의 불활성화(inactivation)가 담낭암을 포함한 몇몇 암종에서 발견된다는 사실은 이미 잘 알려져 있었다. 하지만 BAP1 결핍 쥐의 경우, 사람과는 전혀 다른 종류의 암이 발생하여 질환모델로서의 활용이 불가능했다. Artegiani 등은 이전 연구에서 확립된 배양 기법[26]을 이용하여 사람의 정상 담낭 오가노이드를 만든 후 CRISPR/ Cas9을 통해 오가노이드 내 BAP1 유전자의 결손을 유도하였다. BAP1 유전자의 결손은 담낭 오가노이드의 형태를 크게 변화시켰는데, 이는 세포 간의 결합 감소, 이동성 증가, 상피의 방향성 상실 등에 의한 것으로, 실제 담낭암 조직에서 흔히 발견되는 현상이다. 이어 Artegiani 등은 정상 BAP1 유전자의 재도입이 오가노이드의 형태를 정상으로 되돌림을 보여주었다. 그러나 탈유비큐틴 효소 활성이 죽거나 핵으로의 이동에 필요한 염기서열이 제거된 돌연변이 유전자의 도입은 BAP1 유전자의 결핍으로 인한 오가노이드의 형태 변화를 막지 못했다 [30]. 요약하자면 Artegiani 등은 세포 실험에서 전통적으로 쓰이던 정교한 분자생물학적 연구를 오가노이드에 적용함으로써 BAP1 단백질의 세포핵에서의 기능이 담낭의 구조 형성에 중요하며, 돌연변이에 의한 BAP1 단백질의 기능 상실이 담낭암 조직에서 보이는 비정상적인 구조의 발생에 주요한 역할을 함을 명확하게 보여주었다.

2.3. 유효물질 발굴을 위한 물질 검색

유효물질 발굴을 위한 물질검색은 크게 표적 기반 물질검색(target-based screening)과 표현형 기반 물질검색(phenotypic screening)으로 나뉜다. 표적 기반 물질검색은 이미 알려진 분자 표적(molecular target)의 생물학적 활성을 조절할 수 있는 저분자화합물(small molecule) 혹은 생물의약품(biologics = 항체, 유전물질 등)의 발굴에 쓰인다. 반면 표현형 기반 물질검색은 질환과 관련한 물질의 생물학적 기능만을 세포나 개체 수준에서 측정하는데, 물질의 분자표적이나 작용기작은 고려하지 않는다 [31].

지난 30여 년간 표적 기반 고속물질검색(target-based high-throughput screening)이 유효물질 발굴을 위해 주로 쓰여왔다. 특히 세포를 이용하는 표적 기반의 고속물질검색은 간단하고 저렴하며 효율이 높다는 장점이 있다 [32]. 복잡한 병리 현상을 분자와 분자 간의 상호작용으로 환원하여 설명하고, 이를 바탕으로 도출된 단일한 분자 표적과 상호작용할 수 있는 화합물들을 광범위하게 검색하는 이 검색방식은 약물 후보물질들의 수를 극적으로 증가시켰다 [33]. 하지만 당초 기대와는 달리 최종 판매승인을 얻는 치료제들의 수는 크게 늘지 않았다. 더욱이 분자표적에 대한 연구의 발전은 도리어 대부분의 질환이 하나의 원인이 아닌, 여러 원인들이 복합적으로 작용한 결과임을 보여주었다. 또한 소위 ‘-체학(-體學, -omics)'들의 발달은 ‘하나의 표적을 대상으로 하는 하나의 약물’이라는 환원주의적 발상이 복잡한 병리 현상에 접근하는데 충분치 않음을 밝혔다 [34].

최근 몇 년간 표현형 기반 물질검색(phenotypic screening)에 대한 관심이 다시 증가하고 있다. 표적 기반의 물질검색은 약물의 작용기작이 이미 알려져 있는 후발 의약품(follow-on drug)을 발굴하는데 효율적이다. 그러나 계열 내 최초 의약품(first-in-class drug)의 발굴에는 표현형 기반 물질검색이 더 효과적이다. 표현형 기반 물질검색의 결과들은 생물학적 해석은 쉬우나 정량적인 측정이 어려운 탓에 고속물질검색에는 적합하지 않다고 여겨져 왔다. 하지만 최근 관측장비와 관측 데이터의 처리 및 분석기술이 크게 발전함에 따라 그 활용 가능성이 높아지고 있다 [32]. 하지만 세포 이상의 고차원 실험모델은 고속물질검색에 적합하지 않아 주로 세포 실험모델로 활용하는데 정작 세포를 통해 확인할 수 있는 표현형이 많지 않다는 난점이 있다.

오가노이드는 장기의 조직구조를 재현하면서도 생체 외 배양이 가능하기에 표현형 기반 물질검색에 매우 적합하다. 앞서 살펴본 바와 같이 사람 장 오가노이드에서는 CFTR의 높은 활성과 방향성을 가진 조직학적 구조로 인해 forskolin 유도 팽창이라는 독특한 현상이 나타난다. Dekkers 등은 사람의 장 오가노이드가 96웰 배양접시에서도 잘 자라며 형광물질로 표지한 후 forskolin을 넣으면 오가노이드의 팽창 여부를 쉽고 빠르게 확인할 수 있음을 보여주었다 [13]. 이 실험은 384웰로 확장 가능하였으며, 현재 이를 이용하여 낭성 섬유증의 치료제를 발굴하려는 시도들이 이어지고 있다 [8]. Dekkers 등은 28종의 각기 다른 CFTR 돌연변이 유전형질을 가진 71명의 환자로부터 대장 상피를 얻어 대장 오가노이드를 만들었다. 각기 환자 고유의 유전형을 유지하고 있는 오가노이드들에 약물을 단일로, 혹은 복합으로 처리하여 CFTR-F508de 돌연변이 유전형질의 경우 “VX-770”과 “VX-809”라 각각 명명된 두 약물을 복합으로 처리하는 것이 단일로 처리하는 것보다 CFTR의 기능회복에 월등한 효과를 보임을 밝혔다 [35]. 또한 Vijftigschild 등은 일군의 G-단백질 결합 수용체(G-protein-coupled receptor) 조절 물질들을 forskolin 유도 팽창 실험을 통해 검색하였으며 그 결과 β2-adrenergic 수용체의 작용제(agonist)가 CFTR의 기능을 크게 높임을 발견하였다. 이렇게 발굴된 약물들은 실제로 낭섬유증 환자 코 점막의 기저 전위차(baseline potential difference)를 높이는 효과가 있는 것으로 확인되었다 [36].

암 오가노이드 역시 항암제 발굴을 위한 표현형 기반 물질 검색에 쓰일 수 있다. van de Wetering 등은 18명의 각기 다른 환자로부터 확립된 19개의 대장암 오가노이드를 384웰에 심은 후 자동화된 방식으로 약물 감수성에 대한 표현형 기반 물질검색을 수행하였다. 연구자들은 Oxaliplatin, 5-Fu 등의 1세대 화학요법제(chemotherapeutics)는 물론 개발 중이거나 이미 개발되어 임상에 쓰이고 있는 약물들을 포함한 83개의 화합물들을 모아 이들에 대한 오가노이드들의 반응을 측정하고 그 결과를 각각의 유전정보와 결합하여 비교, 분석하였다. 그 결과 임상에서 이미 알려져 있던 항암제 저항성에 대한 표지 인자들이 오가노이드에서 동일하게 작동함을 알 수 있었으며 새로운 표지 인자들의 발굴도 가능하였다 [20].

2.4. 선도물질 발굴을 위한 유효성 및 독성평가

유효물질 발굴의 다음 단계는 선도물질 발굴이다. 물질검색을 통해 얻어진 유효물질들은 다양한 농도에서 서로 다른 실험방법들을 이용한 교차검증을 통해 유효성과 독성을 시험받는다. 재차 검증된 유효 물질들은 의약화학적 최적화(medicinal chemistry optimization)와 재검증을 통해 효능이 개선되고 부작용이 줄어든 선도 물질로 재탄생 된다. 선도물질의 발굴에 수많은 검증의 과정이 필요한 만큼 비용 대비 효율적이면서도 유효성과 독성을 신뢰성 있게 예측할 수 있는 생체 외 모델의 확보가 무엇보다도 필수적이다. 그동안 선도물질 발굴 단계에서도 세포가 주요한 생체 외 실험모델로써 사용되어 왔다. 하지만 세포 수준에서 좋은 효과를 보였던 약물들이 생체 내 유효성 검증을 통과하지 못해 후기 임상 단계에서 실패하는 경우가 비일비재하다. 또한 단일한 세포만을 이용한 검증실험에서는 미처 발견하지 못했던 독성이 뒤늦게 발견되어 임상시험 과정에서 퇴출 되거나 시판 후 시장에서 철수되기도 한다 [31].

몸을 구성하는 장기들 간의 역동적인 상호작용은 생체 내에서의 약물의 작용을 예측하기 어렵게 만드는 주요 원인 중 하나이다. 복잡한 생체 시스템 내에서의 약물 작용을 신뢰성 있게 모사하는 생체 외 모델을 만들기 위해서는 이러한 상호작용을 재현하는 것이 무엇보다도 중요하다. Body-on-a-chip은 칩 위에 미세관들로 연결된 작은 방들을 만들고 각 방마다 다른 종류의 장기에서 기원한 세포들을 키움으로써 장기 간의 상호작용을 생체 외에서 모사하고자 하였다 [37].

최근 칩 안의 세포들을 오가노이드로 대체함으로써 더욱 신뢰성 높은 모델을 구축하려는 노력이 이어지고 있다. 장기는 그 자체로도 단순한 세포의 덩어리가 아닌 기능성 조직들로 이뤄진 복합체이며, 이러한 하부구조들이 장기 간의 상호작용에도 큰 영향을 미친다. 오가노이드는 body-on-a-chip에 조직의 차원을 더함으로써 더욱 정밀한 모사를 가능케 한다. Jin 등은 간, 소장, 위의 오가노이드들이 상호작용할 수 있는 미세유체 공배양 모델을 개발하였다. 오가노이드들은 각기 다른 구역 내에서 배양되었지만 각 구역들을 관으로 연결하고 칩의 기울기를 주기적으로 변화 시켜 관 사이로 배양액이 흐르게 함으로써 오가노이드 간의 상호작용을 유도하였다. Jin 등은 이 칩 위에서 소장과 간 간에 담즙 생산의 항상성 유지를 위한 상호작용이 재현됨을 확인하였다 [38].

이러한 형태의 다중 오가노이드 시스템은 선도물질의 발굴 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 보이며, 동시에 전임상 연구를 위한 동물실험을 줄이는데 기여할 것으로 기대된다. Skardal 등은 생체공학적으로 만들어진 간과 폐 조직을 심장 오가노이드와 함께 공배양하였다. 놀랍게도 이 시스템에서는 화학요법 항암제인 bleomycin의 그동안 알려지지 않았던 심장 독성이 발견되었는데 이는 폐와 심장 사이의 사이토카인을 매개로 한 상호작용에 의해 발생하는 것으로 나타났다. Bleomycin은 단독으로 배양된 심장 오가노이드에는 큰 영향을 미치지 않았다 [39].

3. 결론

오가노이드는 세포주와 비슷한 생체 외 실험 모델로써 장기 배양 및 동결보존이 가능하고 조작과 관찰이 용이하다는 장점이 있으면서도 불멸화에 따른 기능손실이 없음은 물론 생체 내 장기에서 볼 수 있는 세포 계층 및 조직구조를 재현함으로써 세포보다 한 단계 높은 차원의 생리현상을 연구할 수 있는 실험모델이다.

오가노이드의 생체 유사성은 감염병, 유전질환, 암 등의 정교한 질환 모델링 및 발병 기전 연구를 가능케 하며 이는 신뢰할 수 있는 분자표적의 발굴로 이어진다. 유전자 조작의 용의성은 표적의 유효성을 평가하는 데 도움이 됨은 물론 형광 단백질의 발현 등을 통해 상태 변화를 쉽게 관찰할 수 있는 리포터 오가노이드(reporter organoid)의 개발[40]까지도 가능케 한다. 또한 생체 외 모델로써 배양 및 관찰의 용이성 덕분에 96웰 이상의 고밀도 배양을 필요로 하는 고속물질검색에도 활용이 가능하다. 특히 미세유체 칩 위에서의 다중 오가노이드 공배양 시스템은 동물실험에서만 확인할 수 있었던 장기 간의 복잡한 상호작용까지 재현하는 약물 유효성 및 독성평가 모델을 제공한다.

하지만 오가노이드가 세포주를 이용한 실험들을 완전히 대체할 수 있다거나 동물 실험을 획기적으로 줄일 수 있다고 말하는 것은 아직 무리이다. 오가노이드 배양은 비용은 여전히 세포 배양에 비해 비싸고 대량화가 어렵다. 3차원 배양을 위해 사용되는 생체 외 기질 혹은 스캐폴더(scaffolder)는 비쌀뿐더러 다루기가 까다로워 배양의 자동화를 어렵게 한다. 또한 3차원 배양 시 발생하는 영양분, 성장 및 분화 인자의 분배 불균형은 오가노이드들이 균일하게 성장하는 것을 방해한다 [41]. 더욱이 현재 오가노이드들에서 관찰되는 조직학적 구조와 기능은 실제 장기와 비교하였을 때 아직도 부족한 점이 많다 [42].

오가노이드 배양 기술은 지난 십 년간 급속하게 발전하였으며 여전히 발전 중이다. 이제 열 살 남짓한 기술의 미래를 논하는 것은 너무 성급한 일일지도 모른다. 하지만 한 가지 분명한 것은 오가노이드가 생체 내 현상을 세포보다 한 단계 높은 수준에서 모사할 수 있는 생체 외 실험 모델이라는 점이다. 이러한 특성으로 인해 오가노이드는 신약개발 전임상의 모든 단계에서 기존의 모델들을 대체, 혹은 보완할 수 있는 새로운 실험모델로써 빠르게 자리매김할 것으로 보인다.

4. 참고문헌

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김현이(2020). 신약개발 과정에서의 오가노이드 활용 현황 및 전망. BRIC View 2020-T18. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3510 (May 19, 2020)
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