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단일 세포(single cell) 분석을 이용한 다중 체학(Multi-omics) 연구 동향
단일 세포(single cell) 분석을 이용한 다중 체학(Multi-omics) 연구 동향 저자 고경대 (NIAMS/ NIH)
등록일 2020.01.02
자료번호 BRIC VIEW 2020-T01
조회 1778  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
NGS 기술을 통한 시퀀싱 데이터는 질병과 세포 활동 연구에 필요한 유전체나 전사체, 후성유전체들의 발현에 관련되어 많은 정보를 제공하였다. 그러나, 이러한 발현 정보들은 시퀀싱에 사용한 세포군 전체에 대한 발현 정도를 평균하여 나타낸 것으로, 각각 세포 안에서 어떤 유전적인 변화가 일어나는지 측정하기 힘들다. 이러한 한계를 극복하기 위해 단일 세포(single cell) 분석 기술이 등장하였으며, 이 기술을 통해 세포들의 이질성(heterogeneity)을 유지하면서 각 세포군 내에서 발생하는 유전 정보를 축적하게 되었다. 이러한 정보들은 세포 분화 있어서 새로운 동적인 변화 기저나 암과 같은 복잡한 질병에 결정적인 영향을 미칠 수 있는 새로운 세포군을 발견하는 데 중요한 역할을 하였지만, 유전체, 전사체 등을 각각 분석하는 단일 체학 분석을 통해 축적된 정보는 생명현상 전체를 이해하고 연구하는데, 있어서 충분한 정보를 제공하지 못하고 있다. 최근에 이러한 한계를 극복하기 위해, 단일 세포로부터 여러 가지의 유전물질을 동시에 추출하여 분석하는 단일 세포 다중 체학 분석 기술이 등장하기 시작하였다. 본문을 통해 이러한 분석 기술의 원리, 동향, 적용 분야들을 살펴보고자 한다.
키워드: Single cell, Multiomics, scRNA-seq, scATAC-seq, Epigenetics

목 차

1. 서론
2. 단일 세포 내의 다중 체학 분석을 위한 핵심 기술들
  2.1. 단일 세포로부터 다중 생체 분자물질들을 분리하는 방법
  2.2. 단일 세포 시퀀싱(single cell sequencing)을 응용한 다중 체학 분석 기술들
3. 단일 세포 내의 다중 체학 분석 기술 적용 분야
4. 결론
5. 참고문헌


1. 서론

일반적으로 세포의 상태와 변화를 연구하는데 유전체(genome), 후성유전체(epigenome), 전사체(transcriptome) 간의 상호 작용이 중요한 단서를 제공한다 [1]. 특히 이러한 상호작용들을 제어하는 생물학적인 기제들을 발견하기 위해, 동일한 샘플 안에서 DNA와 RNA 혹은 RNA와 단백질 간의 작용들을 동시에 분석해야만 한다. 이러한 분석을 가능하게 하기 위해서는 샘플 안에서 세포군의 다양성(heterogeneity)을 유지하면서 DNA와 RNA 또는 단백질들을 정량화하는 기술들이 필요하다. 그러나, 샘플 안에 다양하게 존재하는 세포군들의 복잡성(complexity)으로 말미암아 기존의 NGS (Next Generation Sequencing) 기술로는 단지 세포군으로부터 각각의 세포 단위로 변화하는 신호가 아닌 전체적으로 평균화된 신호를 측정하여 분석할 수밖에 없었다. 기술의 발달로 하나의 세포에서 다양한 형태의 세포 물질들을 분자 단위로 미세하게 분리할 수 있게 되면서 각각의 세포 안에서 일어나는 생명현상을 분석하는 기술들이 등장하게 되었다.

이러한 단일 세포(single cell) 분석 기술들은 연구자들로 하여금 유전체, 전사체, 혹은 단백질체 같은 특정한 오믹스(omics) 영역에 관련된 정보들을 손쉽게 축적(profiling)하는 데 큰 도움을 주었다 [2]. 예를 들어, 많은 연구자들은 단일 세포 RNA 분석 기술을 통해 생명체의 기관 전체 혹은 조직 안에 존재하는 서로 다른 형태의 세포군들을 종합적으로 분류하는데 기준이 되는 유전자 발현 지도들을 생성한다. 이러한 지도들은 특정한 상태나 조건 하에 기관 내에서 세포들의 동작을 연구하는데 중요한 단서를 제공하지만, 세포의 상태나 외부 조건의 변화에 따른 세포들의 동적인 변화들을 전체적으로 관찰하는 데 한계를 가지게 된다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 동일 조건 하에서 동일 세포로부터 DNA, RNA 혹은 단백질 같은 세포 물질들을 동시에 추출하여 다중 체학(multi-omics) 정보 분석에 사용함으로써, 특정 상태는 물론 세포 분화와 같은 특정한 세포활동에서 일어나는 전체적인 변화를 연구하는데 중요한 단서를 제공하기 시작하였다. 앞으로, 본문을 통해 단일 세포 단위의 다중 체학 정보 축적(multi-omics profiling)에 관련된 기술 동향과 분석 방법들에 관해 간단하게 살펴보고자 한다.
 

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그림 1. 단일 세포내에서의 다중 체학 분석의 개념도


2. 단일 세포 내의 다중 체학 분석을 위한 핵심 기술들

2.1. 단일 세포로부터 다중 생체 분자물질들을 분리하는 방법

단일 세포 안에서 다중 체학 측정을 위한 첫 단계는 단일 세포로부터 다중 생체 분자 물질들을 동시에 분리하는 것이다 [2]. 이러한 물질들을 분리하는 과정은 다시 두 단계로 나누어진다. 첫 단계로 이질성을 가지는 세포군으로부터 임의로 단일 세포들을 채취하는 과정이다. 단일 세포 체취 과정은 세포 내에서의 하위(downstream) 유전자들의 발현에 필요한 DNA, RNA와 단백질들의 움직임을 정확히 표시하는데 필요한 샘플들을 얻는데 중요한 역할을 한다. Mouth pipetting, serial dilution, robotic micro manipulation, flow-assisted cell sorting (FACS), micro fluidic platforms [3] 등이 널리 쓰인다. 단일 세포들을 채취한 후 다음 단계로, 채취한 단일 세포로부터 DNA와 RNA 같은 생체 분자 물질들을 분리한다. 이러한 물질들을 분리하기 위해 다양한 방법들이 고안되었으며, 이 방법들은 크게 micropipetting, centrifugation, antibody-conjugated magnetic microbeads 등을 이용하여 물리적으로 추출하는 방법 [4, 5, 6], oligo-dT coated magnetic beads를 이용하여 DNA로부터 폴리아데닐화된 mRNA를 분리하는 방법 [7, 4], 물리적인 추출뿐만 아니라, 두 부분으로 분리한 후 DNA와 RNA들을 동시에 증폭하는 방법 [8], 단일 세포 내의 물질들은 두 부분으로 나눈 후, 각각 물질들을 동시에 분석하는 방법 [9] 등이 있다. 이러한 방법들은 분석하고자 하는 체학(omics)에 따라 정확도와 효율이 달라지므로, 해당하는 체학들에 맞는 방법들을 선택하는 것이 중요하다.
 

표 1. 단일세포 다중 체학 분석 기술 비교
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2.2. 단일 세포 시퀀싱(single cell sequencing)을 응용한 다중 체학 분석 기술들

앞에서 언급한 방법들을 이용하여 시퀀싱에 필요한 세포 물질들은 추출한 뒤 프로파일링하고자 하는 체학의 영역에 따라 필요한 기술들을 정확하게 선택하여 결합하는 방법들이 필요하다. 몇 가지를 예들을 통해 현재 가능한 다중 체학 분석 기술들을 살펴보고자 한다.

2.2.1. 단일 세포를 이용한 유전체와 전사체 시퀀싱

동일한 단일 세포에서 DNA와 RNA를 동시에 프로파일링하기 위해서 유전적인 변이와 전사적인 변이 사이에 연결고리를 찾는 것이 중요하다. 이러한 연결고리를 유지하면서, DNA와 RNA들을 동시에 프로파일링하는 방법들은 현재 크게 세 가지로 나눌 수 있다. 첫째로, DR-seq (DNA-RNA sequencing)은 gDNA와 mRNA들을 동시에 증폭한 후에 두 부분으로 분리한 뒤 시퀀싱을 위한 gDNA와 mRNA 라이브러리를 각각 생성하여 시퀀싱에 이용한다 [8]. gDNA와 mRNA 라이브러리들을 생성하기 위해 MALBAC (multiple annealing and looping-based amplification cycles)와 변형된 CEL-seq 프로토콜을 사용한다. 다른 접근 방식으로, G&T-seq (Genome and Transcriptome se-quenching)은 oligo (dT)로 코팅된 상자성(paramagnetic) 비드를 이용하여 DNA로부터 mRNA를 물리적으로 분리하여 각각을 시퀀싱을 위한 라이브러리로 사용한다 [10]. 마지막으로, 동일 세포로부터 세포핵(nucleus) 와 세포질(cytoplasm)을 분리하여 세포핵은 유전체나 후성유전체 분석에, 세포질에 있는 RNA는 전사체 분석에 사용하는 방법이다 [11, 12]. 이 방법은 다중 오믹스 분석을 위한 시퀀싱에 필요한 라이브러리 생성에 있어서 유연성을 제공하지만, 모든 과정이 수동으로 이루어지므로, 전체적인 처리 효율이 매우 낮다.

2.2.2 단일 세포를 이용한 후성 유전체와 전사체 시퀀싱

일반적으로 후성 유전체는 셀 안에서 유전체를 판독하는 과정과 전사체가 발현되는 과정이 서로 어울려져서 결정된다. 따라서, 후성유전적인 이질성(heterogeneity)과 전사과정에서의 이질성의 연계는 대부분 단일 세포 분석을 통해서 관찰할 수 있으며, 세포 상태의 변화나 세포 분화과정에서 전사적 변화와 후성 유전적 변화의 관계는 단일 세포 안에서 양쪽을 동시에 프로파일링함으로써 연구할 수 있다.

scTrio-seq (Single-cell Triple-omics sequencing)은 단일 세포 안에서 유전체 전체의 CNV (Copy Number Variations)와 DNA 메틸롬 그리고 전사체를 함께 얻을 수 있도록 도와준다 [5]. 각각의 세포들을 용해하여, 온전히 세포핵과 세포질에 있는 mRNA를 분리한 뒤, 원심분리를 통해, 세포핵을 채취하고, 나머지 세포질에 남아있는 액체는 다른 튜브로 옮긴다. 이 액체에 남아 있는 mRNA는 scRNA 라이브러리로 전환하고, 세포핵은 scRRBS 방법을 이용하여 CNV와 DNA 메틸롬을 분석할 수 있도록 처리한다.

scMT-seq (Single-cell methylome and transcriptome sequencing)은 scTrio-seq와 비슷한 방법으로 미세모세관을 이용하여 세포핵을 분리한 후, 세포와 세포벽을 용해한다. 용해된 물질 안에 있는 mRNA는 변형된 smart-seq2 [13] 프로토콜을 사용하여 증폭되며, 동시에 세포핵 유전체는 변형된 scRRBS [14] 프로토콜을 이용하여 처리한다. scM&T-seq (Single-cell methylome and tran-scriptome sequencing)은 G&T-seq 프로토콜을 기반으로 하여 DNA와 RNA를 물리적으로 분리한 후 scBS-seq를 gDNA에 적용하여 분석하며, 주로 CpG 메틸화에 관련된 정보를 제공한다 [7].

scNOMe-seq (Single-cell nucleosome occupancy and methylome sequencing)은 기존의 NOMe-seq [15] 과 Bisulfite 시퀀싱 [14]을 함께 사용하여, CpG 영역 메틸화와 CpG 영역을 접근성을 함께 측정한다. 이 두 가지 방법을 함께 적용하면, chromatin 접근성을 측정에 있어, 접근할 수 없는 chromatin을 쉽게 구별할 수 있으며, 유전체 전 영역에서 CpG 영역을 측정하는 해상도를 높일 수 있다. 이러한 scNOMe-seq 방법을 변형하여 chromatin 접근성, DNA 메틸화와 DNA CNV (Copy Number Variation)을 동시에 측정할 수 있는 scCOOL-seq (Single-cell chromatin overall om-ics-scale landscape sequencing)이 개발되었으며 [16], scM&T-seq와 결합하여 chromatin 접근성, DNA 메틸화와 전사체 정보를 함께 측정할 수 있는 scNMT-seq도 개발되었다 [17].

2.2.3 단일 세포 분석을 통한 전사체와 단백질 측정

전체 유전체 안에서 전사체들로부터 단백질들이 생성되는 과정을 이해하는 것은 어떻게 전사 단계(transcriptomic)의 세포 상태에서 기능성을 나타내는 표현형(phenotypic)의 세포 상태로 변화하는지를 이해하는데 중요한 단서를 제공한다. 나아가 이러한 연구는 scRNA만으로는 관찰할 수 없는 전사 후나 mRNA 번역(translation) 후 과정에서 나타나는 표현형 상태의 세포들에 대한 이질성을 연구하는 데 중요한 역할을 할 수 있다.

먼저, 단일 세포 내의 전사체와 단백질 레벨을 동시에 측정하는 기술로 PEA (Proximity Extension Assay)와 타겟 cDNA 증폭 방법을 결합하는 방법이 있다 [23]. 서로 다른 항원에서 같은 단백질에 결합하는 한 쌍의 항체(antibody)들을 사용하여 역전사 과정을 통해 DNA 폴리머라이즈와 RNA 폴리머라이즈를 연속적으로 일으킨다. 이러한 과정은 단백질로부터 유도된 DNA 바코드와 RNA로부터 cDNA가 동시에 생성되도록 돕는다. 생성된 생체 물질들은 qPCR이나 시퀀싱을 통해, 단백질과 전사체 레벨들을 측정하는 데 이용되지만, 가능한 항체 쌍에 따라 측정할 수 있는 단백질에 한계가 있다. 다른 방법으로, FACS (Fluorescence-activated cell sorting)와 용해를 통해 세포를 분리한 후, RNA와 단백질을 분리하여 측정하기 위해 세포 용해액(lysate)을 나눈다. 최종 단계로, PEA는 단백질량을, 역전사는 RNA양을 측정하는데 적용하여 나온 결과물들을 미세 유체(micro fluidic) qPCR assay를 통해 읽어들인다.

PLAYR (the proximity ligation assay for RNA) 방법은 세포를 고정한 후, mass cytometry를 사용하여 특정한 전사체와 단백질을 감지하는 것이다 [24]. 즉, PLAYR 프로브와 결합한 전사체들은 삽입과 circle 증폭 과정을 거쳐 mass cytometry와 호환 가능한 프로브와 다시 결합한다. 동시에 metal isotope들을 구분할 수 있는 항체를 사용하여 특정한 단백질들을 감지하도록 한다. 이러한 과정들은 mass cytometry 하여금 RNA와 단백질을 동시에 측정할 수 있도록 도와주며, 수천 개의 단일 세포 안에서 RNA와 단백질들을 빠르게 검사할 수 있지만, 높은 친화력(high-affinity)을 갖는 항체들의 수와 사용할 수 있는 metal isotope 수가 제한적이다.

다른 방법으로, Cytometry와 시퀀싱을 결합한 방법이 있다. 이 방법은 CITE-seq를 사용하여 생성된 전사체들과 항원 결정기(epitope)들에 관계된 세포 인덱스들을 이용한다 [25]. 먼저, 일시 정지 상태의 세포에 세포의 표면 단백질을 타겟으로 하는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)로 활성화된 항체를 이용하여 레벨을 생성한다. 이 올리고뉴클레오타이드는 PCR 핸들(handle)과 항체 바코드 그리고 a poly (A) 테일(tail)로 구성되어 있으며, 스트렙타비딘-비오틴 상호 작용을 통해 서로 항체에 접합되어 있다. 덧붙여, 올리고뉴클레오타이드의 5’ 끝에 있는 이황화 결합은 감소하는 조건으로 올리고 뉴클레오타이드가 해체될 수 있도록 도와준다. 단일 세포 시퀸싱을 통해 세포들은 드롭렛 단계에서 Drop-seq 비드(beads)들이나 10x Genomics Chromium 젤(gel) 비드(beads)들과 함께 캡슐화된다. 세포가 용해되는 동안, 이들 항체 유도 태그들과 세포의 mRNA들은 비드들 위에 있는 oligo (dT) 에 융해된다. 역전사와 증폭 후, cDNA와 항체 유도 태그들은 크기별로 분리될 수 있다. 이러한 방식은 주로 면역 세포의 표면 단백질들을 타깃으로 하지만, 만약 항체 염색 전에 투과 과정을 거친다면, 이론적으로, 세포질이나 핵산에 관련된 단백질들을 감지하는데 중요한 방법이 될 가능성이 높다. 특히 이 방법론은 scRNA-seq만으로 구별할 수 없는 자연적으로 존재하는 킬러 세포들의 하위 종들을 감지할 수 있다.

마지막으로 REAP (RNA expression and protein sequencing assay)-seq [26] 은 droplet scRNA-seq에서 이용하는 DNA 바코드에 결합하는 항체들을 사용한다. CITE-seq와 달리, 바코드와 올리고뉴클레오타이드를 연결하는데, Thunder-Link PLUS 올리고뉴클레오타이드 활용 시스템을 사용한다. 세포 용해 후 역전사체는 mRNA으로부터 cDNA를 생성하여 DNA polymerase 작용을 통해 항체 바코드를 확장한다. CITE-seq와 비슷하게 두 개의 세포 바코드 라이브러리는 크기에 따라 분리될 수 있다. 이러한 방식은 scRNA-seq와 병행하여, 82개의 단백질을 동시에 감지할 수 있다.

3. 단일 세포 내의 다중 체학 분석 기술 적용 분야

단일 세포 내의 다중 체학 분석 기술은 유전체, 후성유전체, 전사체, 단백질체에서 생성된 다양한 데이터를 하나로 통합하여 새로운 생명 현상을 발견하고 이해하는데 필요한 기회를 제공하며, 이렇게 통합된 데이터는 질병 연구에 중요한 생물학적인 메커니즘을 연구하는데 중요한 단서를 제공한다. 예를 들어, 단일 세포 RNA-seq통해 발견된 세포 그룹에 DNA methylation-seq에서 얻어진 데이터를 적용하여 특정 기관이나 암세포에서 기존의 방법으로는 발견하지 못한 새로운 형태의 세포군을 발견하였다 [18]. 또한, 동일 세포 내의 후성 유전체와 전사체 시퀀싱을 통해, 단일 세포 RNA-seq에서 분류된 다양한 세포군들에서 중요하게 발현되는 전사체들의 정보를 얻을 수 있다[19]. 즉, 단일 세포 RNA-seq 통해 얻어진 후보 유전체들 중에 후성 유전체 시퀀싱 결과를 통해 검증되어, 실제 발현 가능성이 높은 유전체들이 선택된다. 이러한 과정들은 질병 치료에 중요한 타겟 을 정확하게 발견할 수 있도록 도움을 주며, 나가 맞춤형 치료에 핵심기술로 큰 공헌을 할 것이다.

또한, 단일 세포를 이용한 다중 체학 분석 기술은 특정한 세포 계통 내에서의 동적인 변화들을 재구성하는데 중요한 정보를 제공한다. 즉, 세포가 분열하는 동안 변화하는 후성 유전체들의 정보와 세포 분화 동안 얻어지는 전사체들의 발현 정보들을 통합하여 특정 세포 분열과 사멸 현상에서 순차적으로 발생하는 세포 내의 동적인 변화들을 재구성할 수 있다. [20] 이러한 발생학적인 비교는 암 연구에 적용되어 정상적인 세포와 암세포 사이에 동적인 세포 변화 차이를 비교함으로써, 정상적인 세포가 암세포로 변화하는 데 영향을 미치는 원인을 발견하는 데 중요한 역할을 한다. 나아가 각각 세포군에서 발생하는 유전자 간의 상호 작용을 연구함으로써, 질병과 같은 특정한 환경 내의 유전자들의 변화를 연구할 수 있다.

더 나아가 이러한 분석기술들을 통해 얻어진 결과들은 기관 혹은 종 전체를 구성하는 세포 간의 상호작용과 기능들을 설명하는 지도책(atlas) 프로젝트에 기초 정보가 될 수 있다. 최근에 가장 야심찬 프로젝트로 국제 인간 세포 지도(Human Cell Atlas) 컨소시엄이 구성되었다 [22]. 이들 프로젝트들은 데이터를 기반으로 하여 일반적으로 생명 기관들의 발달을 이해하는데 기초가 되는 세포군들을 분류하고 새로운 세포들을 찾아서 이러한 세포들이 노화나 질병에 어떠한 역할을 하는지 밝히는 것이다. 초기에 대부분의 지도들은 single cell RNA seq 기반으로 만들어져 표현할 수 있는 정보의 한계가 있지만, 다중 체학 기술을 이용하면, 세포 상태 변화를 유발하는 분자 생물학적으로 중요한 물질을 발견하거나 메카니즘을 이해하는데 필요한 다양한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, scNMT-seq [17]을 이용하면 단일 세포 내에서 크로마틴 개방과 전사체의 발현 정보를 동시에 프로파일링할 수 있고, 이러한 정보들은 세포의 상태를 결정하는 데 관련된 GRN (Gene Reg-ulatory Network)를 이해하고 질병 상태에서 GRN의 기능들이 어떻게 변화하는지를 확인하는데 중요한 단서를 제공한다. 이와 같이, 단일 세포를 이용한 다중 체학 분석 기술은 다양한 생물학 분야에서 여러 가지 생명현상에 대한 새로운 이해와 연구를 이끄는데 중요한 부분으로 등장할 것이다

4. 결론

단일 세포 분석 방법의 등장으로 세포 내에서 이루어지는 다양한 생명 현상들을 체계적으로 이해하며, 일반적인 시퀀싱 분석 방법으로 발견할 수 없는 세포군과 그 특성을 발견할 수 있는 중요한 단서들은 얻게 되었다. 이러한 단서들은 다양한 형태의 세포들이 분화되고, 유지되며, 사멸하는 전 과정을 시스템 생물학적으로 이해하는 데 중요한 역할을 하기 시작했지만, 유전체, 전사체, 혹은 단백질 같은 하나의 생체 물질 간의 상호 작용에 관련된 정보만을 제공하는 단일 체학 형태의 분석은 많은 한계점을 보여주고 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해 동일한 세포에서 유전체와 전사체를 혹은 후성 유전체와 전사체를 동시에 시퀀싱 하여 프로파일링하는 다중 체학 방법은 암 같은 복합적인 인자로 발생되는 질병을 치료하는데 중요한 타겟이 될 수 있는 새로운 세포군을 발견하거나, 세포 분화 과정을 제어하는 생물학적인 메커니즘을 연구하는데 핵심적인 정보를 제공하고 있다. 제공되는 정보의 정확성, 해상도와 분석 효율을 높이기 위해서 샘플로부터 세포들을 추출하는 방법, 추출된 세포로부터 유전 물질들을 분리하는 방법, 분리된 유전 물질들을 증폭하여 시퀀싱을 위한 라이브러리 생성, 시퀀싱 한 데이터를 목적에 맞게 통합하여 분석하는 방법들이 앞으로 연구하여 개선해야 하는 과제들이다.

5. 참고문헌

==> 첨부파일(PDF) 참조

 

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고경대(2020). 단일 세포(single cell) 분석을 이용한 다중 체학(Multi-omics) 연구 동향. BRIC View 2020-T01. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3400 (Jan 02, 2020)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
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