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Gordon Research Conference - Mechanisms of Membrane Transport 참가 후기
Gordon Research Conference - Mechanisms of Membrane Transport 참가 후기 저자 오세철 (Memorial Sloan Kettering Cancer Center)
등록일 2019.08.22
자료번호 BRIC VIEW 2019-C20
조회 793  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
Gordon Research Conference (GRC) - Mechanisms of Membrane Transport가 2019년 6월 23일부터 6월 28일까지 6일간 미국 뉴햄프셔 주의 Colby-Sawyer College에서 개최되었으며, 미국, 유럽, 호주, 중국, 일본 등에서 온 약 150명의 연구자가 참가하였다. 40여 회의 강연과 100여 개의 포스터 발표로, ion channels, transporters, receptors 등 막단백질의 작용 메커니즘과 연구방법론에 대한 토론이 활발하게 이루어졌다.
키워드: 막단백질, membrane transport, 구조생물학, cryoEM
분야: Structural_Biology

목차

날짜별 구두 발표 요약
  6월 23일
  6월 24일
  6월 25일
  6월 26일
  6월 27일
연구동향
  1. cryoEM 의 강세
  2. X-ray crystallography의 여전한 강점
  3. 막단백질 연구에 있어서의 Antibody/Nanobody 사용
  4. cryoEM 구조 분석에 있어서 구조 해석에 관한 panel discussion


날짜별 구두 발표 요약

6월 23일

Interplay Between Proteins and Membranes”라는 주제로, 요새 많은 그룹이 관심을 두고 있는 TMEM16 단백질에 대한 연구를 두 그룹이 발표하였다. 또한 다양한 생물리학적 방법론을 사용한, lipid가 MFS transporter의 conformational equilibrium에 미치는 영향에 대한 연구도 발표되었다.

The Flips and Flops of a Scramblase story: Insights into the Activation and Transport Mechanism of TMEM16 Proteins - Cristina Paulino (University of Groningen)

TMEM16은 ion channel이면서 lipid scramblase로도 작동하는 이중성(duality)을 보인다. 두 가지 기능 모두 칼슘 이온 의존성을 보이는 것으로 알려져 있다. 이 연구진은 single particle cryo-electron microscopy(이하 cryoEM)를 활용하여 TMEM16의 작용 메커니즘을 각 단계별로 보여주려고 하였다. Closed, intermediate, open 상태 및 Ca2+ free, Ca2+-bound 상태의 조합으로 총 여섯 단계로 이루어진 stepwise activation 메커니즘을 제시하였다. 그중 intermediate, Ca2+-free 단계를 제외한 나머지 다섯 단계의 구조를 분석하고, 그 구조를 비교함으로써 lipid conduction pathway가 열리고 닫히는 과정을 시각적으로 보여주었다. 구조를 풀지 못한 나머지 intermediate 상태가 ion conductive 한지 여부를 알아내는 것이 남은 과제라고 보고하였다.

또 한 가지 주목할 만한 결과는, TMEM16이 detergent 상태 및 nanodisc 상태에서 membrane distortion을 만들어 내는 것을 관찰했다는 것이었다. 이러한 membrane distortion이 lipid scramblase로서 기능하는 데에 핵심적으로 작용할 것으로 생각된다고 보고하였다.

Structural Basis of Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16 Proteins - Alessio Accardi (Weill Cornell Medicine)

Dithionite-induced fluorescence decay와 proteoliposome을 이용한 lipid scrambling assay와 cryoEM을 이용한 구조 연구를 기반으로, TMEM16의 transmembrane domain 4 (TM4)와 TM6가 서로 붙었다가 떨어졌다가 하는 움직임으로 두 TM 사이에 lipid scrambling을 위한 공간을 만든다는 것을 보였다. 그리고 closed 상태에서도 TMEM16은 ion channel 활성을 유지하는데, 그것은 여전히 이온 투과를 위한 공간은 충분하기 때문이라고 밝혔다. L203A ‘hydrophobic lock’ mutant 연구를 통하여 TMEM16 의 닫힌 상태에 대한 연구를 더 진행하여 위의 결론을 더욱 뒷받침하였다.

또한 Paulino group에서 발표한 바와 같이, TMEM16이 nanodisc 상태에서 membrane remodeling을 하는 것을 관찰하였다. 이러한 membrane remodeling을 통하여 TMEM16이 lipid scramblase로 작용하는 메커니즘을 제시하였다.

향후 과제로서, ion channel 활성과 lipid scramblase로서의 활성이 서로 영향을 주는지 여부가 중요한 질문이지만, 현재로서는 ion channel 활성과 lipid scramblase 활성을 동시에 측정할 방법이 없다는 점이 현재의 한계라고 보고하였다.

How Direct Protein-Lipid Interactions Shape the Conformational Landscape of Secondary Transporters - Chloe Martens (King's College London)

Major facilitator superfamily (MFS) transporter들의 conformational shift가 직접적인 lipid-protein interaction에 의하여 조절된다는 것을 보였다. MFS transporter 중 LacY, XylE, GlpT를 대상으로, Double electron-electron resonance (DEER), hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS), MD simulation 등 여러 가지 방법론을 사용하여, 단백질의 helix 간 거리 변화를 측정하는 방법을 사용하였다. Phosphoethanolamine (PE) phospholipid가 MFS transporter의 gating helices와 상호작용함으로써 transporter의 outward-facing state와 inward-facing state 간의 conformational equilibrium에 영향을 미친다는 것을 보여주었다.

6월 24일

Linking Transport and Metabolism”이라는 주제로, homeostasis, cell interaction, pathogenesis, patho-physiology와 연관된 membrane transport 단백질에 관한 연구들이 발표되었다. 또한, “ABC Transporters in Health and Disease”라는 주제로 ATP hydrolysis를 energy source로 이용하는 ABC transporter들의 구조와 기능에 대한 연구들이 발표되었다.

Mechanics of Transition Metal Ion Transport by an NRAMP Transporter - Rachelle Gaudet (Harvard University)

망간이나 철 같은 전이금속이온의 transporter 단백질로 알려진 NRAMP (Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins) transporter의 ion transport 메커니즘을 X-ray crystallography와 liposome assay를 활용하여 연구하였다. 먼저, NRAMP transport cycle 중 여러 단계의 구조를 밝히고, 그 밝혀진 구조를 기반으로, wild type과 여러 가지 mutant의 functional study를 수행하였다. 이전부터, NRAMP의 전이금속이온 transport 메커니즘이 수소 이온에 의존한다고 알려져 있었는데, 망간, 철, 코발트 이온의 transport는 수소 이온에 크게 영향을 받지만, 카드뮴이나 아연 이온의 transport의 경우에는 수소 이온에 대한 의존성을 거의 보이지 않는다는 점을 보고하였다. 그 이유를 명확하게 밝히지는 못하였으나, 수소 이온에 의존하지 않는 전이금속이온들은 모두 주기율표상의 12족인 것으로 보아 공통적인 메커니즘이 있을 것으로 생각한다고 밝혔다. 또한, 전이금속이온의 transport 경로와 수소 이온의 transport 경로가 다르다는 사실을 밝혀 NRAMP transporter의 새로운 메커니즘을 제시하였다.

Structure of the human LAT1–4F2hc heteromeric amino acid transporter complex - Qiang Zhou (Westlake University)

Anti-cancer drug의 potential target으로 생각되는 Large neutral L-amino acid transporter인 LAT1과, LAT1의 membrane trafficking chaperone이라고 여겨지는 4F2hc의 heterodimer 구조를 cryoEM을 활용하여 규명하였다. LAT1은 inward-facing state 상태에 있었고, LeuT fold를 가지고 있었다. 4F2hc는 single transmembrane helix를 가지고 있으며 상대적으로 size가 큰 extracellular subunit이 있었다. 4F2hc와 LAT1가 disulfide bond를 형성하는 것을 포함, charge interaction 및 hydrophobic interaction을 통해 강하게 결합하고 있다는 것을 보여주었다. 연구진은 4F2hc가 LAT1의 scaffold domain을 안정화시킴으로써 transport 활성을 증가시키는 것으로 생각한다고 주장하였다. 또한, biochemical assay를 통하여 4F2hc가 transporter 활성을 위해서 꼭 필요하다는 것을 밝혔다. 그에 더하여, proteoliposome assay에서, cholesterol이 transport 활성을 크게 증가시키는 것을 보고하고, 이로 미루어 보아 transport 활성에 lipid의 영향이 있는 것으로 생각된다고 발표하였다.

Structural Basis for pH-Dependent Retrieval of ER Proteins from the Golgi by the KDEL Receptor - Philipp Bräuer (University of Oxford)

Golgi로 수송된 Endoplasmic reticulum (ER) 단백질을 ER로 다시 회수하는 과정은 KDEL 서열 인식이 중요한 역할을 한다. 회수되어야 하는 단백질들은 C-terminal에 KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) 아미노산 서열을 가지는데, 이 서열은 KDEL receptor에 의해 인식된다. KDEL 서열과 KDEL receptor는 pH-dependent한 결합을 보이는데, 연구진은 먼저, pH 7에서 5까지의 범위에서 pH가 낮아질 때(수소 이온 농도가 증가할 때)에 점차 결합이 강해진다는 것을 functional assay를 통해 보여주고, X-ray crystallography로 규명한 구조로부터 어떻게 결합 부위의 Tyr158과 Glu127 간의 수소 결합 네트워크가 pH에 따라 달라지는지를 보여주었다.

또한 연구진은 KDEL receptor 구조를 다른 종류의 transporter인 semiSWEET transporter 구조와 비교하였다. 두 단백질의 서열과 기능이 상이한데도 불구하고, 구조가 매우 유사하였다. 연구진은 receptor와 transporter가 하나의 scaffold로부터 각기 다른 기능을 가지도록 진화한 것인지, 각자 다른 구조와 기능을 가진 두 단백질이 하나의 구조로 수렴하게 된 것인지가 흥미로운 질문이라고 언급하면서 발표를 마무리하였다.

Of Channels and Transporters: Potassium Uptake in Bacterial Survival - Inga Hänelt (Goethe-University Frankfurt)

Nucleotide binding에 따라 조절되는 two-pore potassium uptake system인 KtrAB 구조를 negative staining하여 cryoEM으로 규명하고, ADP-bound 상태와 ATP-bound 상태의 구조를 비교하였다. 또한, Electron paramagnetic resonance (EPR) 실험으로 ATP binding에 따른 pore domain과 regulatory domain 간의 거리 변화를 측정하였다. 위 두 가지 실험 결과를 종합하여, 어떻게 ATP 결합이 KtrAB complex의 구조 변화를 유도하고, potassium 이온 통로를 gating 하는지를 밝혔다.

Insight into Drug Transport and Small-Molecule Inhibition of Human ABCB1 and ABCG2 - Kaspar Locher (ETH Zurich)

ABCB1 (P-glycoprotein)과 ABCG2 (BCRP)는 대표적인 ATP-binding cassette (ABC) exporter로서, 어떤 암세포들에서 multidrug resistance에 기여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 뇌의 약물 투과성에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. ABCB1/ABCG2 double knockout은 뇌의 약물 투과성을 크게 증가시킨다. 이 연구에서는, ABCB1과 ABCG2의 다양한 저해제와의 결합 상태의 고해상도 구조를 cryoEM으로 규명하였다. ABCB1 경우는 저해제 Zosuquidar 2 분자가 하나의 ABCB1 결합 부위에 결합하는 것을 보여주었으며, ABCG2는 Ko143이라는 저해제와의 구조를 규명하는 것으로부터 시작하여, Ko143에서 화학적으로 변형된 구조를 갖는 다양한 화합물을 합성하고 screen하여, Ko143 보다 더 강력한 저해제를 찾아내었다. 그중 MZ29라는 화합물이 ABCG2에 결합한 구조를 규명하여 두 개의 MZ29가 하나의 ABCG2에 two-fold symmetry를 가진 형태로 결합한다는 것을 밝혔다. 구조 규명을 통해 기존의 저해제가 어떻게 작용하는지를 밝히고, 그 구조에 기반하여 기존의 저해제보다 더 우수한 성능을 갖는 저해제를 합성 및 검증하고, 그렇게 개발된 저해제의 작용 메커니즘을 다시 구조 규명을 통하여 밝히는 일종의 선순환을 보여주었으며, 이 발표를 듣는 청중의 감탄을 자아내었다.

위에 언급된 데이터 이외에도, 아직 publish 되지 않은 다른 몇 가지 저해제와의 결합 구조 및 functional study 결과를 보여주었다.

Architectures of Lipid Transport Systems for the Bacterial Outer Membrane - Damian Ekiert (New York University School of Medicine)

Bacteria에서 inner membrane과 outer membrane 간에 phospholipid가 어떻게 수송되는지는 아직 잘 알려져 있지 않다. 이 사이는 거리가 200 Å정도 되는 hydrophilic space (periplasm)이기 때문에 단순히 확산에 의해서 phospholipid가 수송되기는 어렵다. 이 발표에서는 YebT와 PqiB라는 단백질이 hexameric ring을 형성하고, 그 hexameric ring이 서로 stacking하여 periplasm의 길이에 해당할 정도의 긴 hydrophobic channel을 형성하는 것을 보여주었다. 이 channel의 내부를 통하여 inner membrane과 outer membrane 사이에 lipid transport가 일어날 수 있다고 설명하였다. Crosslinking을 통하여 lipid가 channel 내부에 결합하는 것을 보여줌으로써 그 설명을 뒷받침하였다.

Conformational Space of a Heterodimeric ABC Exporter Under Turnover Conditions - Dovile Januliene (Max Planck Institute of Biophysics)

Heterodimeric ABC exporter인 TmrAB의 구조를 cryoEM으로 규명하였다. 이 연구의 특이할 만한 점은, TmrAB transport cycle의 8가지 단계 모두의 구조를 규명하였다는 것이다. 8단계 중 inward-facing state가 2단계, outward-facing state가 4단계, intermediate가 2단계였다. 이렇게 규명한 구조들과 functional study를 종합하여, 다음과 같은 결론을 발표하였다. Substrate binding이 conformational specific한 것이고, conformational change를 유발하는 것이 아니라는 것을 밝혔다. ATP binding이 extracellular gate를 열기에 충분하며, intracellular side의 gate opening은 ATP hydrolysis 후의 phosphate release로 인해 일어난다고 주장하였다. 또한, nucleotide release가 transport의 rate limiting step이라고 밝혔다.

Mechanism of Allosteric Regulation of P-Glycoprotein - Hassane Mchaourab (Vanderbilt University)

P-glycoprotein은 ABC exporter로서 암세포, blood-brain barrier 등에서의 multidrug resistance에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 연구진은 double electron-electron resonance (DEER) spectroscopy를 이용하여 P-glycoprotein의 여러 부위 간의 거리 및 그 분포를 측정하는 방식으로 substrate 및 inhibitor의 결합에 의해 P-glycoprotein이 allosteric modulation되는 메커니즘을 연구하였다. 구조를 밝히는 것과 달리 DEER spectroscopy를 이용해서는 단백질의 여러 가지 상태의 분포를 알 수 있기 때문에 많은 information을 줄 수 있는 장점이 있다.

ATP hydrolysis는 substrate movement와 coupling되어 있으며, 두 nucleotide binding site (NBS)가 cooperative fashion으로 기능한다는 것을 밝혔다. 또한, NBS 간에 heterogeneity가 있는데, 이는 NBS 간에 local asymmetry가 있기 때문이라고 설명하였다. 위에서 Kaspar Locher group이 연구했던 저해제인 zosuquidar의 작용에 대해서도 연구했는데, 이 저해제가 P-glycoprotein의 inward-facing state를 안정화시킨다는 것을 밝혀내었다.

6월 25일

Ion Channels: From Atom to Animal” / “Protein Folding in the Membrane”를 주제로 하여, ion channel들의 작용 메커니즘과 membrane transport에 관련된 protein folding 연구들이 발표되었다.

Structural Titration of Human IP3 Receptors Reveals Mechanisms of Ligand-Dependent Gating - Richard Hite (Memorial Sloan Kettering Cancer Center)

ER에 위치하며 Calcium 및 IP3를 signaling molecule로 인식하는 calcium channel인 IP3 receptor의 cryoEM 구조를 여러 가지 상태(Ca2+ free, Ca2+ bound, Ca2+/IP3 bound, ATP-bound 등)에서 밝혔다. 다만 구조가 밝혀진 상태들이 모두 closed state이며, open state의 구조는 아직 밝혀지지 않은 것이 남은 과제라고 보고하였다. IP3 receptor는 Ca2+ 농도에 biphasic한 dependency(저농도에서는 activation, 고농도에서는 inhibition)를 보이는 특이한 ion channel로서, 이 연구진은 두 개의 calcium binding site를 찾아내어 보여주었으며, 각각의 binding site가 high affinity, low affinity site 로써 각각 activation과 inhibition에 역할을 할 것이라는 가설을 세우고 후속 연구를 진행하고 있다고 밝혔다. cryoEM 구조생물학과 calcium-sensitive fluorescence probe를 이용한 functional study를 함께하고 있는 점이 주목을 받았다.

Lipid Modulation of CNG Channels - Crina Nimigean (Weill Cornell Medicine)

cyclic AMP (cAMP)를 ligand로 하는 ion channel인 SthK가 어떻게 lipid에 의해 조절되는지를 cryoEM 구조와 single channel recording, 그리고 atomic force microscopy (AFM)을 통하여 보였다. cryoEM으로 open state에서는 Cyclic nucleotide binding domain (CNBD)의 움직임을 보여주었다. 또한, SthK가 cAMP 외에도 voltage-dependent channel이기도 하다는 것을 추가적으로 밝혔다.

A Molecular Basis for Membrane Mediated Inhaled Anesthesia - Scott Hansen (The Scripps Research Institute)

이 연구에서는 super-resolution imaging (dSTORM) 및 초파리 행동 연구를 통하여, 특정 종류의 마취제가 작용하는 메커니즘을 연구하였다. 예상과는 달리, 마취제는 특정 단백질에 작용하는 것이 아니라 lipid membrane에 작용을 하며, lipid membrane의 변화는 TREK-1 channel의 lipid gating에 영향을 주기 때문에 마취 효과를 나타낸다고 밝혔다.

Structural Basis of Dynamic TRP Channel Interaction with Lipids, Proteins and Cations - Ute Hellmich (Johannes Gutenberg University Mainz)

Endosome/lysosome에 주로 분포되어 있는 TRPML channel의 luminal domain만을 따로 발현 및 정제하여 이에 대한 구조 분석과 칼슘 및 Lipid의 결합에 대한 기능 연구를 Isothermal titration calorimetry (ITC)로 진행하였다. 이 구조 분석과 functional assay 둘 다 중성 pH 및 산성 pH 조건에서 이루어졌다. pH가 내려감에 따라 luminal domain의 칼슘 이온 결합이 약화되며, 또한 이것이 luminal domain의 낮은 pH, 즉, Endosome/lysosome 환경에서의 multimerization과 연관이 있다고 주장하였다.

Structure and Mechanism of P4-ATPase Lipid Flippases - Poul Nissen (Aarhus University)

Lipid Flippase인 P4-ATPase의 구조를 cryoEM을 활용하여 Partially activated state, Activated state에서 규명하였다. 또한 Lipid binding이 P4-ATPase의 부분적인 구조인 amphipathic helix 형성을 안정화시킨다는 결과를 보여주었다. P4-ATPase가 Activated되는 과정을 밝혔으며, Lipid translocation pathway가 어디인지를 보이는 것이 남은 과제라고 보고하였다.

Functional Mechanisms in Channels and Transporters - Francis Valiyaveetil (Oregon Health and Science University)

Glutamate의 Neurotransmission에서 중요한 역할을 하는 Glutamate transporter의 Homologue인 GltPh의 Na+ 및 Aspartate (Asp) 결합에 따른 구조 변화를 연구하였다. 기존의 결정 구조에서 GltPh는 그 기질 Binding site의 덮개 역할을 하는 HP2 domain이 Na+ 및 Asp 결합에 따라 구조 변화가 두드러지는 것으로 나타났는데, 본 연구에서는 functional assay로 그것을 재확인하였다. 실험 방법론이 주목할 만했는데, Binding site 근처의 두 amino acid를 각각 Unnatural amino acid인 PheCN 및 Tryptophan으로 치환한 후, Na+ 및 Asp 결합에 따른 Tryptophan fluorescence의 변화를 측정하였다. 기존의 다른 방법론에 비해 signal의 변화가 큰 편이라서 데이터 분석이 용이하다는 점이 주목할 만하였다. 실험 결과, Na+ 결합 전에는 HP2가 닫혀 있다가, Na+ 결합에 따라 열리고, 다시 Asp 결합에 따라 닫힌다는 것을 보였다.

6월 26일

Computational Design and Evolution of Function” 및 “New Technologies for Uncovering Mechanistic Insight“를 주제로, membrane transport의 evolution에 관련된 연구 및 막단백질 연구에 적용할 수 있는 새로운 연구 방법론들에 대한 발표가 있었다.

Structure of an Intermediate in the CLC Transport Cycle - Merritt Maduke (Stanford University)

Proton-coupled Cl- transporter인 CLC transporter에 대한 구조 연구와 DEER를 활용한 여러 pH 조건 하에서의 기능 연구를 수행하였다. 그 자리에는 현재 및 과거에 CLC transporter를 연구했던 사람이 많았기 때문에 매우 활발한 토론이 이루어졌다.

Evolution of Drug Export in the Small Multidrug Resistance Family - Randy Stockbridge (University of Michigan)

Guanidinium ion export에 관여하는 Gdx transporter 기능 연구를 하였다. Gdx는 Proton coupled transporter로서 transport stoichiometry가 Guanidinium:proton = 1:2 antiport이다. 화학적 구조가 비슷한 urea, arginine에 비해 guanidinium에 대한 높은 선택성을 가지는 것을 보여주었다. 나아가 guanidinium을 substructure로 가지는 화합물들에 대한 transport assay를 통해, singly substituted guanidinium은 Gdx transporter가 transport하지만 double substituted guanidinium은 transport하지 않는다는 것을 밝히고, 그로부터 Gdx transporter의 메커니즘이 정교하게 조절된다고 주장하였다.

The Salipro System for Stabilization of Membrane Proteins - Jens Frauenfeld (Salipro Biotech AB)

Saposin을 이용하여 막단백질을 nanodisc와 유사한 방식으로 reconstitute하는 방법 및, extract하는 방법을 소개하였다. 특징은 nanodisc와 달리 크기의 조절이 필요하지 않으며, 타겟 단백질의 크기에 맞추어 Saposin ring의 크기가 알아서 조절된다는 점이었다. 소수이기는 하지만 2~3년 전부터 이를 사용하여 좋은 결과를 낸 막단백질 연구들이 소개되었다. 막단백질 연구에 있어 기존에 많이 사용되고 있는 Detergent 및 Nanodisc를 대체할 수 있는 연구 방법론이라 생각되어 많은 사람들의 질문과 주목을 받았다.

6월 27일

Membrane transporter and channels impacting health and disease” / “New concepts of membrane transport biology”를 주제로 건강과 질병에 관련이 큰 ion channel 및 transporter에 대한 연구가 주로 발표되었다.

Anallosteric oxyanion binding site controls Na+/I- symporter transporter stoichiometry - Nancy Carrasco (Yale School of Medicine)

NIS transporter는 13개의 transmembrane domain을 가진 sodium-coupled iodide transporter이다. 하나의 iodide 당 두 개의 Na+가 co-transport되는 것으로 알려져 있다. 이 그룹은 NIS transporter를 오랫동안 연구해 왔는데, 이번 발표에서는 갑상선의 요오드 축적을 방해하며, 또한 로켓의 연료로도 사용되는 ClO4-가 어떻게 NIS에 의해 transport 되는지에 대한 연구를 발표하였다. ClO4-가 NIS에 의해 transport되며, 이 transport는 이전까지 알려진 I-의 transport와는 달리, electroneutral한 과정이라는 것을 밝혔다. 이에 관련된 정확한 메커니즘은 제시되지 않았지만, ClO4-가 NIS의 transport mechanism을 바꾸는 것으로 생각되며, 두 개의 Na+ 이온이 아닌, 하나의 Na+ 이온이 coupling되어 있다고 보고하였다. 또한, ClO4- transport를 다시 electrogenic하게 만드는single amino acid substitution (G93T)에 관한 연구도 보고하였다. 마지막으로 특정 취약 대상자들 – 소아 및 임산부 등 – 이 ClO4-에 노출되는 것은 큰 위험성을 가질 수 있다고 역설하고, 임상의학, 그리고 공중보건의 영역과의 접점에서의 기초과학 연구를 강조하며 발표를 끝맺었다.

Molecular mechanisms of P2X3 receptor channel activation and modulation by divalent cation bound ATP - Kenton Swartz (NIH)

이 연구에서는 Extracellular ATP mediated signaling을 인식하여 sensory hypersensitization에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 P2X3 receptor의 metal-bound 구조 및 메커니즘을 규명하였다. 기존에 P2X3 receptor의 apo form 및 ATP-bound form의 구조는 규명되어 있었으나 divalent metal ion (Mg2+, Ca2+)가 미치는 영향에 대해서는 이해가 잘 안 되어 있었다. 이 연구에서는 x-ray crystallography와 computational study의 조합으로 physiological condition의 Mg-ATP, Ca-ATP 가 P2X3 receptor를 regulation하는 메커니즘을 밝혔다. Divalent ion의 결합은 P2X3 receptor의 gating과 ATP dissociation을 조절하여 receptor가 desensitization 상태로부터 recovery되는 속도를 늦추는 것으로 밝혀졌다.

The split personality of glutamate transporters: a chloride channel and a transporter - Renae Ryan (University of Sydney)

EAAT (glutamate transporter) 단백질은 Cl- ion channel이기도 하다. Cl- 이온 투과성은 SLC1 (solute carrier 1) family 전반에 걸쳐 나타나는 특성으로서, 특히 EAAT5의 경우, presynaptic rod bipolar cell에서 큰 Cl- conductance를 보이고, episodic ataxia 환자에서는 EAAT1의 Cl- conductance의 증가를 보이는 것이 보고되어 있다. 그래서 glutamate transporter의 Cl- conducting state에 대한 연구는 생리학적으로도 그 의미가 중요하다 할 수 있다. 하지만 EAAT의 Cl- 이온 투과 메커니즘은 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 이 연구진에서는 cysteine crosslink를 활용하여 EAAT homologue인 GltPh를 Cl- conducting state에 고정해 보려는 시도를 하였다. Cysteine crosslink를 통한 고정 자체는 성공적이었으나, 구조 분석이 5 Å resolution에 머무르고 있어 아직은 Cl- 이온 투과 메커니즘을 밝혀내는 데에 어려움이 있다고 보고하였다.

또한, Episodic ataxia 환자에서 발견된 두 가지 변이 - Pro290Arg와 Met128Arg - 가 어떻게 EAAT의 glutamate transporter로서, 또 Cl- ion channel로서의 기능을 변화시키는지에 대해서도 연구하였다. Pro290Arg 변이는, Cl- ion channel 활성을 증가시켰으며, glutamate 친화성(affinity) 또한 증가시켰다. 그러나 glutamate transport 속도 자체는 감소되는 것을 관찰하였다고 보고하였다. Met128Arg 변이는, 운동실조증 환자의 EAAT에서 나타나는 de novo mutation으로서, Cl- ion channel 활성을 증가시키며, 큰 Na+ leak current를 발생시킨다는 것을 보고하였다.

How Toxins modify sodium channels - Jian Payandeh (Genentech)

Voltage-gated sodium channel인 Nav channel은 24개의 transmembrane domain을 가지는 단백질이다. Nav1.1부터 Nav1.9까지 총 9가지가 있는데 그 중 Nav1.7에 spider toxin이 어떻게 작용하는지에 대한 연구를 발표하였다. Spider toxin 중 하나인 Protoxin-II (ProTx2)와 human Nav1.7의 결합구조를 cryoEM 및 x-ray crystallography를 이용하여 밝혔다. ProTx2는 voltage-sensor domain II (VSD2)에 결합하여 VSD2를 activated state 또는 deactivated state에 고정시키는 것으로 나타났다. 또한 VSD2 mutant는 ProTx2가 결합된 Nav channel가 비슷한 특성을 보였다. 이를 통해 ProTx2가 Nav channel에 작용하는 메커니즘을 이해할 수 있었다. 다른 종류의 toxin인 Scolpion toxin인 AaH2에 대해서도 연구했는데, ProTx2와는 달리, AaH2는 VSD4에 결합함으로써 VSD4를 deactivated state에 고정시키고, 그에 따라 channel function을 저해시킨다는 것을 밝혔다. 연구진은 이러한 연구가 Nav channel에 선택적으로 작용하는 길항제를 개발하는 데에 도움이 될 수 있을 것이라고 주장하였다.

Nicotinic receptor reconstitution and structure - Ryan Hibbs (UT Southwestern Medical Center)

이 연구진은 니코틴-아세틸콜린 수용체에 대한 구조 및 기능 연구를 발표하였다. 니코틴 수용체-항체-니코틴 복합체의 cryoEM 구조를 밝힘으로써, 니코틴 수용체의 니코틴 결합 위치가 두 군데이며, 각 결합 위치가 subunit A, B 사이, 그리고 subunit D, E 사이에 위치한다는 것을 보여주었다. 이온 통로는 가장 좁은 부분의 지름이 3.4 Å이며 통로 전체가 안정적으로 hydrated 되어있다는 것을 보여주었다. 추가로, 니코틴 수용체의 저해제인 AT-1001의 결합 구조 역시 밝혔다. 기능 연구로는, Reconstituted liposome으로부터 excised patch를 이용하여 single channel recording을 수행하였다.

The molecular basis of ‘Force from Lipids’ gating in MscS mechanosensitive channels - Eduardo perozo (University of Chicago)

Mechanosensitive ion channel인 MscS에 대한 구조 및 기능 연구를 수행하였다. MscS의 경우, 기존에 규명된 구조를 바탕으로 inter-helical interactions와 lipid binding에 의한 gating mechanism이 제시되어 있었다. 하지만 기존의 구조에서는 N terminal 부분의 구조가 규명되지 않았었기에, 이 연구진은 cryoEM을 사용하여 구조를 다시 규명하였고, N terminal domain이 membrane interface에 anchoring하며 특히 Trp16이 anchoring에 중요하다는 것을 밝혀내었다. 또한, 이전에는 보지 못했던 추가적인 lipid density들을 많이 발견하였으며, 이것이 ion permeation 및 gating에 lipid가 주는 영향을 이해하는 데에 도움이 될 수 있을 것이라고 주장하였다.

How one strong H-bond screws up a CLC transporter - Christopher Miller (Brandeis University)

CLC transporter의 염소 이온 transport 및 불소 이온에 의한 transport interruption mechanism에 대해, planar bilayer assay 및 X-ray crystallography를 활용한 연구를 발표하였다. 이 강연은 연구 발표보다는 membrane transport 연구자들의 Chris Miller에 대한 tribute가 중점이었다고 할 수 있다. 학회 기간 동안, 이번 GRC는 Chris Miller의 마지막 GRC이며 오는 9월에 은퇴한다는 것이 알려졌다. 그래서 Chris Miller의 발표 시작 직전에, chairperson이 발표를 급하게 중지시키고, Chris Miller의 이전 포스닥 중 가장 선배 격이라고 할 수 있는 Joe Mindell (NIH)이 Chris Miller를 소개하는 시간을 가졌다. Chris Miller의 첫 GRC에서 어떤 에피소드들이 있었는지, 그가 얼마나 다른 연구자들과 디스커션을 잘하며, 학문적 영감을 주는 사람인지 등등에 대해 소개하고, 그 자리에 얼마나 많은 Chris Miller의 이전 제자(및 포스닥)들, 그리고 그 제자들의 제자들, 제자의 제자의 제자들이 있는지에 대해서도 언급하였다. 그리고 참석자 전원이 기립하여 1분 정도 박수를 함으로써 이 커뮤니티에 지대한 영향을 준 과학자에게 감사와 존경을 표하였다.

연구동향

1. cryoEM 의 강세

이번 컨퍼런스에서 발표된 고해상도 3차원 구조 중 다수(절반 이상)가 single particle cryoEM을 통해서 분석된 구조들이었다. 대부분의 구조의 resolution은 3.3~4.0 Å 정도였으며, sub-3 Å의 구조를 보여준 연구진도 있었다. 인상적이었던 발표 중의 하나는, 한 ABC exporter의 transport cycle의 총 8단계의 구조를 모두 분석하여 보여준 연구였다. 특정 transporter의 transport cycle을 각 단계별로 구조 분석하려면 십수 년이 걸려서 하거나 혹은 거의 불가능하다고 여겨지는 일이었다면, 이제는 단 몇 년 만에 transport cycle 전체를 고해상도 구조로 보여줄 수 있는 시대가 오고 있다는 것을 예상하게 해주는 발표였다. 이외에도, ion channel이나 transporter 구조 연구에서 각기 다른 상태의 구조를 분석하고, 그렇게 분석된 구조들을 가지고 하나의 스토리를 만드는 발표를 적지 않게 볼 수 있었다. 또한, 소수의 경우였지만, 단백질에 결합한 이온이나 물 분자의 density를 볼 수 있을 정도의 고해상도 구조 분석을 한 연구진도 있었다. 이를 통해, single particle cryoEM이 막단백질의 구조와 메커니즘을 연구하는 데에 있어 강력한 방법론이라는 것을 다시금 확인할 수 있었다. 다만 상대적으로 크기가 작은 막단백질들의 경우, 고해상도 구조 분석이 아직은 어렵다는 것이 해결해야 할 숙제로 남아있는 것으로 보인다.

2. X-ray crystallography 의 여전한 강점

X-ray crystallography의 여전한 강점 역시 두드러졌다. 크게 두 가지 면에서 crystallography의 강점이 부각되었는데, 첫째, 150 kDa 이하의 크기를 가지는 단백질의 경우, x-ray crystallography로 구조가 분석된 경우가 대부분이었다. 150 kDa 이하 단백질을 single particle cryoEM으로 성공적으로 분석한 경우는 아직 소수였다. 둘째, 뛰어난 data quality를 보여주는 crystallography 연구가 많았다. 결정화가 어려운 것으로 알려진 막단백질임에도 불구하고, crystallography로 분석된 구조들의 경우 다수가 2~3 Å 정도의 resolution을 보였다. 가장 좋은 데이터는 1.8 Å resolution으로, aromatic amino acid의 side chain 구조까지 정확하게 보여주었다. 이를 통해, crystallography를 통한 막단백질 구조 분석이 그 분석 대상의 scope와 data quality에 있어 여전히 강점을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. 특히 약물 결합이나 미세한 구조 변화에 있어서의 정밀한 메커니즘을 연구하려면 crystallography로 얻을 수 있는 sub-3 Å의 구조 데이터가 큰 도움을 줄 수 있다고 생각된다.

3. 막단백질 연구에 있어서의 Antibody/Nanobody 사용

막단백질의 구조 규명과 기능 연구에 있어 표적 단백질에 대한 antibody 및 nanobody 사용이 증가하고 있음을 알 수 있었다. X-ray crystallography를 이용하여 구조를 규명하는 경우, 막단백질의 결정화에 있어 antibody/nanobody가 crystal packing에 도움을 줄 수 있기 때문인 것으로 생각된다. cryoEM으로 구조를 규명하는 경우, antibody/nanobody의 결합이 data processing 과정에서 particle alignment에 도움을 줄 수 있기 때문인 것으로 생각된다. 특히 monomer끼리 구조가 비슷한 heterodimer의 구조를 분석하는 데에 있어 dimer 중 하나의 monomer에만 binding하는 nanobody를 찾아서 구조 분석에 진전을 본 연구진도 있었다. 또한, 여러 상태의 equilibrium에 있는 단백질을 antibody/nanobody 결합을 통해, 하나의 상태로 equilibrium shift를 유도할 수 있다는 것 또한 구조 및 기능 연구 모두에 있어 강점으로 작용할 수 있다는 의견들이 있었다. Antibody/nanobody를 사용하는 연구진들 이외에도 이러한 방법론 자체를 개발하는 데에 집중하고 있는 연구진들도 적지 않았다.

4. cryoEM 구조 분석에 있어서 구조 해석에 관한 panel discussion

cryoEM을 활용하여 막단백질 구조를 분석했을 때 나오는 결과를 두고 어떻게 해석할 것인가에 대한 panel discussion이 있었다. Cristina Paulino (University of Groningen), Jose Faraldo-Gomez (NIH), Richard Hite (MSKCC)가 패널로 참여했으며, 패널들 이외에도 많은 사람들이 토론에 참여하였다.

토론 주제 중의 하나는, cryoEM으로 막단백질의 구조를 밝혔을 때 볼 수 있는, 그리고 최근 분석된 구조들에서 많이 보이는 non-protein density를 detergent 또는 lipid로 assign하고 그 부분을 lipid binding site라고 결정하는 것이 과연 맞는 것인가에 대한 것이었다. 이 토론에서 나온 중요한 지적은, 막단백질의 경우, lipid는 ligand로서 작용할 때도 있지만 solvent처럼 작용하기도 하기 때문에 구조에서 lipid density가 보인다고 해서 그것이 정말 생물학적/생리학적 의미가 있는지에 대해서는 잘 생각해 보아야 하며, 자칫 과대 해석을 할 수 있는 부분을 경계해야 된다는 것이었다.

이 panel discussion은 토론 주제에 대하여 하나의 답을 내놓으려고 하기보다는, 여러 사람이 의견을 공유하고 그것을 다듬는 과정이었으며, 우리가 놓치고 있는 부분을 환기하는 자리였다.

 

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오세철(2019). Gordon Research Conference - Mechanisms of Membrane Transport 참가 후기. BRIC View 2019-C20. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3302 (Aug 22, 2019)
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