[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 동향
웨비나모집
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
전체보기 뉴스 Bio통신원 Bio통계 BRIC이만난사람들 웹진(BioWave)
BRIC View
최신자료 동향리포트 학회참관기 리뷰논문요약 BRIC리포트 외부보고서
3차원 신경 조직 모델: 스페로이드에서 바이오프린팅까지
3차원 신경 조직 모델: 스페로이드에서 바이오프린팅까지 저자 김슬하 (서울대학교)
등록일 2019.08.20
자료번호 BRIC VIEW 2019-R21
조회 1107  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
3차원 시험관 내(3D in vitro) 신경 조직 모델은 기존의 2차원 배양보다 생체 내(in vivo) 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용을 더 잘 드러낸다. 따라서 전자는 역학 및 병진 연구(translational study)에 큰 잠재력을 가지고 있다고 여겨진다. 이 논문에서는 최근 연구되는 바이오 프린팅을 통해 구성된 조직 모델에 중점을 두어 최신 3차원 시험관 내 신경 조직 모델의 발달에 대해 개괄했다. 우리는 각기 다른 응용 가능성에 대해 각 모델의 장점과 한계를 설명하기 위해 구체적인 예를 제시했다. 바이오 프린팅은 다양한 세포 종류, 복잡한 마이크로 스케일의 기능 및 조직 수준 반응을 갖는 시험관 내 신경 조직에서 반복 가능하고 제어 가능한 3차원 모델 구축을 위한 혁신적인 접근법을 제공한다. 바이오 프린팅 연구의 발전은 기존 모델 연구들을 통합하고 고 정확성을 지닌 복잡한 신경 조직 구조를 생성하여 궁극적으로 질병 특이성 메커니즘을 탐색하고 새로운 치료제 개발을 촉진하며 신경 재생을 증진시킬 것이다.
키워드: 3차원 프린팅, 바이오 프린팅, 신경 재생, 뉴런, 신경교세포, 신경 외상, 신경 퇴행성 질환
분야: Neuroscience

본 자료는 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials, 154:113-133.의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목차

1. 도입
2. 신경 구조체를 디자인할 때의 원칙
3. 기존 시험관 내 3차원 모델
  3.1 세포 생물학 기반 모델
  3.2 엔지니어링 기반 모델
4. 바이오 프린팅 신경 조직 모델의 발전
  4.1 바이오 프린팅 방법의 종류
  4.2 바이오 잉크 및 인쇄 전략
  4.3 바이오 프린팅으로 만들어진 3D 신경 조직의 응용
5. 남은 과제와 미래 전망
  5.1 기술적 문제
  5.2 여러 종류의 세포
  5.3 세포를 출력할 수 있는 바이오 잉크 배합
  5.4 신호 분자의 농도 기울기
  5.5 혈관 신생
6. 개요


1. 도입

전 세계적으로 10억 명이 넘는 사람들이 신경계 질환을 앓고 있다. 신경계 질환의 전형적인 예로는 급성 외상(예: 외상성 뇌 손상(TBI), 척수 손상(SCI)), 신경 퇴행성 질환(예: 파킨슨병, 알츠하이머, 헌팅턴병) 또는 신경 발달 장애(예: 소두증 및 자폐증)를 들 수 있는데, 대부분 효과적인 치료법이 존재하지 않는다. 신경 질환을 치료하려는 많은 노력이 있었으나 여전히 병원성 메커니즘에 대해서조차 분자 수준에서 거의 이해하지 못하고 있다. 이는 생체 내 신경계를 재현하는 모델이 부족하기 때문으로 보인다.

현 기술로는 동물 모델이 실제 신경계 질환을 가장 유사하게 모사할 수 있다. 그러나 동물 실험은 시간, 금전적으로 부담이 크며 종 간의 유전적, 생화학적, 대사과정의 차이 때문에 인간 환자의 상태를 완전히 반영할 수 없다. 또한 기술적으로 동물 내부에서 일어나는 일을 모니터링하는 것이 어렵고 윤리적 문제가 자주 발생한다. 이에 대한 대안으로 신경 조직의 슬라이스 배양을 이용한 생체 외 모델(ex vivo model)이 널리 채택되어 왔다. 살아있는 동물과 비교할 때 조직 조각은 더 실험적으로 다루기 용이하지만, 신체에서 분리되는 순간 발생하는 기능적 손실을 피할 수 없다는 단점이 있다.

동물 모델과 체외 배양 시스템과는 별도로 세포 기반 시험관 모델(cell-based in vitro model)을 이용해서도 신경계를 재현하려는 연구들이 많이 진행되었다. 2차원 단층 배양, 즉 얇은 표면 코팅된 페트리 접시에서 키워지는 세포는 비용 및 노동력 측면에서 효율적이기 때문에 가장 많이 이용된다. 축삭/수상 돌기의 성장, 신경 생존 및 시냅스 형성 분야에서 특히 널리 사용되어 왔으나, 2차원 배양은 세포-세포 및 세포-ECM (ECM)의 상호 작용으로 발생하는 특정한 생리 기능을 재현하기에는 불충분하다.

이와는 반대로 3차원 배양, 즉 인공적으로 형성해 준 3차원 환경에서 세포를 배양하는 것은 보다 장기간 배양이 가능하며 복잡하고 다채로운 미소 환경을 제공해 줄 수 있다. 이런 생리적 유사성 때문에 3차원 신경 모델은 동물 모델의 시험관 내(in vitro)에서의 훌륭한 보조적 연구방법이 될 수 있다.

세포 생물학 기반 모델과 공학 기반 모델과 같은 다양한 3D 배양 시스템은 바이오 프린팅 이전에 등장한 연구 방법들이다. 스페로이드나 오가노이드와 같은 세포생물학에 기반한 모델들과, 스캐폴드나 미세 유체(microfluidics) 플랫폼과 같은 공학에 기반한 3차원 세포 배양 모델들로 보다 더 신뢰성 있는 신경 조직 유사체를 만들어내고자 수없이 많은 연구들이 이루어져 왔다. 세포 자체로만 구성된 세포 생물학 기반 모델은 초기 발달 과정을 모방하는 측면에서 우수한 성과를 보인다. 반면 공학 기반 모델은 재료의 기계적 특성, 다공성, 생분해성 등의 요인들을 조절함으로써 세포를 둘러싼 환경을 보다 재현성 있게 조절할 수 있다. 하지만 공학 기반 모델의 발전에도 불구하고, 이런 모델 속에 담지된 세포들은 빈번하게 재료 그 자체나 외부에서 오는 신호들에 파묻히게 되고, 세포-세포 또는 세포-ECM의 미세한 생리학적 상호작용을 우선적으로 받아들이지 못하게 된다. 이러한 한계점 때문에 바이오 프린팅이 가지는 장점이 대두되고 있다. 바이오 프린팅은 정밀하게 살아있는 세포들과 생체재료, 신호분자들을 디자인대로 배치할 수 있다. 불행하게도, 바이오 프린팅의 위대한 잠재력에도 불구하고 존재하는 몇 가지 한계점들이 존재한다.

이 리뷰에서는 기존 방식들 각각에 대해 신경 조직의 시험관 내 모델에서 이룬 성과들을 먼저 제시하고, 바이오 프린팅에서 기존 방법들에 존재하는 단점을 뛰어넘으며 이뤄진 연구들을 소개하며 앞으로 남아 있는 바이오 프린팅이 넘어야 하는 한계점을 제시한다.

2. 신경 구조체를 디자인할 때의 원칙

아직 실험실에서 신경 모델을 만들려 할 때, 온전한 신경계를 모사하는 것은 너무나 원대한 목표다. 신경계 전체를 다 모델에 담으려 애쓰는 것보다는 필수적인 부분을 구성해 내는 데에만 집중하는 것이 더 실용적이다. 하지만, 어떤 속성들이 시험관 내 3차원 모델에서 꼭 재현되어야 하는 필수적인 속성인지는 아직 합의가 이뤄지지 않았다. 여기서 우리는 신경 조직을 설계할 때 고려되어야 하는 가이드라인이 될 수 있도록 실제 신경조직들이 공유하는 가장 필수적인 특징들을 설명할 것이다.

신경계는 다양한 종류의 세포들을 포함한다. 다양한 유형의 뉴런과 신경교세포(glial cell)들이 신경계 전반에 분포되어 있다. 뇌를 예로 들자면, 이는 대략적으로 860억 개의 뉴런과 850억 개의 비-뉴런성 세포들로 구성되어 있다. 중추신경계에서 비 뉴런성 세포, 즉 신경교세포라 불리는 세포들은 성상세포(astrocyte), 소교세포(microglia), 희돌기세포(oligodendrocyte), 내피세포(endothelial cell), 그리고 혈관주위세포(pericyte)를 포함한다. 그래서 시험관 내 3차원 모델은 세포들이 적절한 표현형을 드러낼 수 있도록 충분한 세포-세포 상호작용을 재현하기 위해 매우 다양한 세포들을 매우 높은 농도로 밀집시킬 수 있어야 한다.

신경계의 세포 종류 외에도 ECM 구성도 매우 독특하다. 콜라겐이나 파이브로넥틴, 라미닌 같은 구성성분들은 다른 장기들에는 굉장히 풍부하지만 상대적으로 신경조직에는 적게 존재한다. 대신에 프로테오글리칸이나 히알루론산, 테나신 등이 풍부하게 존재한다. 또한 ECM에는 다양한 신호분자들이 존재하는데, 이들은 농도 의존적으로 작용하게 된다. 이에 따라 이런 농도 기울기를 다시 형성해주는 것이 신경 재생을 촉진하는 데에 필수적이다.

ECM은 세포에게 구조적 지지체 역할을 하는 것뿐 아니라 세포의 행동을 조절하는 신호를 제공한다. 특히 ECM의 물성은 시험관 내에서 조직을 디자인할 때 필수적인 파라미터로 여겨진다. 신경 조직은 다른 조직들과 극명하게 구분되는 생리학적 특성을 가지고 있는데, 그중 하나는 심장이나 연골, 뼈 등보다 낮은 탄성계수를 가진다는 것이다(신생아의 뇌 조직 100 Pa, 성인의 뇌 조직 < 1 kPa, 척수 90-230 kPa).

세포 기질의 단단한 정도가 세포의 외적인 형태와 행동에 큰 영향을 미친다는 것은 이미 잘 알려져 있다. 특징적으로, 신경줄기세포(NSC)는 더 높은 모듈러스를 가지는 기질에서 성장했을 때(>1kPa) 신경교세포로 분화되는 성향이 두드러졌고 더 부드러운 젤에서 성장했을 때(100-500 Pa) 세포의 이동을 증가시키며 뉴런으로의 분화하는 경향을 보였다. 이와 유사하게 중간엽줄기세포(MSC)는 단단한 기질에서(10kPa) 성장시켰을 때 신경교세포 계통으로 분화하는 경향이 있었지만, 부드러운 곳에서(1 kPa) 키웠을 때에는 뉴런과 유사한 표현형을 보였다.

이와 같이 세포를 배양하는 기질의 다공성도 세포의 이동과 대사과정의 효율성에 큰 영향을 미쳤다. 예를 들면 100 um보다 큰 기공의 크기와 더 좋은 연결성을 가지는 기질에서는 영양분의 교환을 증가시키고, 실제 조직과 유사한 기공의 크기를 가지는 경우에는 세포의 이동이 더 활발했다. 또한 신경 세포들은 미세 요철이나 필라 등 표면의 구조적인 신호(topological cue)에도 섬세하게 반응한다. 이런 신호는 널리 연구되어 왔으며 세포의 활성, 이동, 증식, 분화, 그리고 신경 돌기의 돌출과 성장을 촉진시킴이 이미 알려져 있다.

3. 기존 시험관 내 3차원 모델

세포 생물학 기반의 모델과 공학 기반 모델 모두 우리의 신경 조직의 발달과정과 신경 병리학 이해를 크게 발전시켰다. 이러한 모델들의 장점과 한계에 대해 먼저 짚고 넘어가는 것은 새로운 3차원 바이오 프린팅 기법을 발전시키는 데 도움이 될 것이다. 여기서 우리는 가장 널리 쓰이는 시험관 내 3차원 신경 모델을 그들이 어떻게 신경 네트워크와 모델과 신경 병리학적 특성을 구성했는지와 이 방법들 간의 주된 차이점에 주목하여 설명할 것이다.

 

upload_image
그림 1. 기존 3차원 세포 배양 모델과 바이오 프린팅과의 접목

 

3.1 세포 생물학 기반 모델

3.1.1 스페로이드

스페로이드는 자연적인 자가 조립이나 스캐폴드의 존재 없이 외부 힘에 의한 세포 간 접합으로 형성된 세포 덩어리를 말한다. 일반적으로 스페로이드는 외부에서 ECM의 역할을 하는 물질을 따로 넣어줄 필요 없이 스스로 ECM을 분비하여 자연적인 ECM의 조성을 유지한다.

스페로이드는 뇌 조직의 세포 구성의 다양성, 전기 생리학적 특성, ECM 분비 및 물성과 같은 기초적인 특성을 재현하기 위해 이용되어왔다. Dingle은 신생 랫트의 대뇌 피질 세포를 네 개의 다른 밀도(1K, 2K, 4K, 8K cells/spheroid)로 스페로이드를 만들었다. 14 일 후에 안정한 크기에 도달하여 생체 밀도와 유사하게 조립되었다(2 ~ 4 x 105 cells/mm3). 면역 조직 화학 분석 결과 뉴런뿐만 아니라 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 및 심지어 소교세포까지 포함하는 여러 개의 신경교세포가 그 안에 존재함이 확인되었다. 패치 클램프 실험으로 스페로이드 내의 뉴런이 전기적으로 활성을 드러내고, postsynaptic 전류(sPSCs)의 발생을 검출해 시냅스 네트워크가 형성되었음을 보여주었다. 또한, 라미닌을 분비하고 신생 쥐 피질과 유사한 탄성 계수를 나타내었다.

3.1.2 오가노이드

오가노이드는 실제 장기의 세포 구성, 구조 및 기능을 닮은 큰 세포 집합체이다. PSCs와 성체줄기세포(ASCs)를 이용하여 오가노이드는 인간 조직의 기초적인 기능 중 일부를 나타낼 수 있다. 여러 가지 면에서 유기체는 진보된 스페로이드라고 할 수 있다. 왜냐하면 오가노이드에서 줄기 세포는 공간적으로 구분된 분화와 세포 정렬을 스스로 구성함에 반해 스페로이드 모델에서는 줄기세포 또는 선구 세포(progenitor cell)가 부족하여 자가 재생 및 분화가 미진하게 일어난다. 결과적으로 오가노이드는 스페로이드보다 더 오랜 기간 동안 유지될 수 있는 보다 안정한 3D 세포 구조체를 만들어낸다.

일반적으로 오가노이드는 다양한 종류의 세포들의 내재적인 능력을 보존하고 발달과정에서의 세부적인 부분들을 재현하는 데에 다른 방법들보다 더 적합하다. 특히 실제 조직의 기본적인 구조와 생리학적 특징을 발견하는데 많은 성과가 있었다. 그럼에도 불구하고 이러한 자체 조립을 통해 만들어지는 모델에는 몇 가지 한계가 있다. 첫째, 크기와 모양이 매우 다양하다. 또한, PSCs가 담지되어 자라는 niche의 역할을 마트리겔이 할 수 있다는 것이 밝혀지면서 신경 오가노이드를 형성할 때는 대부분 마트리겔이 이용되는데, 마트리겔의 조성이 완전히 분석되지 않았기 때문에, 마트리겔의 사용을 포함하는 많은 오가노이드들은 batch to batch inconsistency, 즉 생산된 마트리겔 조성의 불균질로 인한 문제를 피할 수 없으며, 이 때문에 오가노이드를 high throughput screening에 이용하기 힘들다. 또한 일반적으로 오가노이드 모델은 스페로이드 모델보다 사이즈가 크다. 이 때문에 중심부에서 양분과 산소의 결핍으로 인한 세포의 괴사는 불가피하다. 따라서 기체 및 영양소 교환을 촉진하기 위해서는 모세 혈관 네트워크를 오가노이드 구조 안에 형성해야 할 필요가 있다.

3.2 엔지니어링 기반 모델

세포생물학 기반 모델은 배양 기간 도중에 가해지는 외부적인 자극들과 세포 내부적 신호에 의한 조직 과정에 의존하지만, 공학 기반 모델은 살아있는 조직을 조직의 재형성과 성장에 필수적인 핵심 신호들을 조합함으로써 완성하고자 한다. 조성의 분석이 미진한 마트리겔이나 변수가 많은 세포생물학 기반으로 형성된 구조체 대신에, 공학 기반 모델은 전형적으로 온전히 정의된 성분들만을 이용해서 세포들이 원하는 조직적 특성을 드러내게끔 하려고 한다. 구체적인 예시와 응용사례들을 아래에 제시한다.

3.2.1 신경 조직 구축을 위한 공학 기반 스캐폴드

마트리겔은 오가노이드 배양에서 자주 사용되었기 때문에, 이 물질은 조직 공학 접근법, 즉 스캐폴드 연구에서 널리 이용되어 왔다. 마트리겔을 대체하기 위해 완전히 정의된 물질을 연구하기 위해 몇 가지 주목할만한 연구가 수행되었다. 요약하면, 하이드로겔 및 poly (ε-caprolactone)과 같은 물질(PCL) 및 poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA), 알긴산, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), GelMA, 콜라겐 I, 마트리겔, 키토산, 아가, 실크 피브로인, 히알루론산, 메틸셀룰로오스 등이 이용되어 왔으며, 또한 RGD, IKVAV 및 YIGSR 같은 펩타이드나 단백질 라미닌(LN), 피브로넥틴(FN) 등을 PEG와 같은 bioinert한 재료들과 조합하여 이용하기도 했다.

3.2.2 미세 유체(microfluidics) 기술 기반 모델

미세 유체 플랫폼의 핵심적인 특징은 세포를 3차원으로 배양하는 환경에 유체의 흐름이라는 요소를 더하는 것이다. 패터닝을 통해 ECM과 세포 구획을 분리하여 공배양하는 동시에 성장인자와 같은 수용성 인자들의 농도 기울기를 형성하는 등의 섬세한 조작이 미세 유체 플랫폼에서는 가능하다. 또한 미세 유체 플랫폼은 리소그래피를 통해 주로 제작되기 때문에 고해상도로 패터닝된 배양 기판을 재현성 있게 얻을 수 있다는 장점이 있다. 이런 장점들 때문에 신경 연구에서는 대뇌피질의 구조를 모사하는 연구에서 점점 많이 이용되고 있다. 신경 돌기의 성장, 그리고 BBB와 같은 뇌 특이적인 환경을 실험실에서 재현할 수 있다.

4. 바이오 프린팅 신경 조직 모델의 발전

바이오 프린팅은 3D 인쇄 기술의 핵심이다. 이 기술을 이용해서 우리는 세포와 생체재료, 효능을 가진 분자들을 높은 정확도로 3차원으로 자유롭게 구성할 수 있다. 정밀한 세포들 간의 배치가 생리학적으로 중요한 신호를 제공한다는 가설이 제시되면서, 바이오 프린팅을 다양한 세포들로 구성된 조직 모델에 적용하는 것이 활발하게 연구되어 왔다. 기존의 스캐폴드를 먼저 제작하고 세포를 넣어주는 2가지 단계로 구성된 방법과 다르게, 바이오 프린팅은 생체재료와 세포를 포함하고 있는 바이오 잉크를 한 번에 출력하는 한 단계만으로 구성된다. 세포 생물학 기반 모델은 세포를 다루는 데에 전문적인 기술이 필요하지만, 바이오 프린팅은 프로그래밍된 기계에 의하여 자동으로 진행된다. 이런 특성은 다양한 세포들로 구성된 모델을 균일하게 high-throughput으로 생산하여 약물 테스트나 임상 용도로 이용할 수 있게 한다.

4.1 바이오 프린팅 방법의 종류

바이오 프린팅은 주로 액적법(droplet-based), 사출법(extrusion-based), 레이저 기반 프린터를 이용한다. 액적법은 잉크젯 프린팅 방식, acoustic droplet ejection, 마이크로 밸브 프린팅 등으로 다시 한번 나눌 수 있다. 일반적으로 액적법은 3.5에서 70 mPa s 정도의 낮은 점성을 가지는 재료에 이용되고, 사출법은 30 ~ 6 x 107 mPa s 의 넓은 범위의 높은 점성을 가지는 재료에 이용된다. 그리고 사출법은 보다 낮은 비용이 소요되며 작동방식이 좀 더 간단하다. 반면에 레이저 기반 방식은 비용은 더 비싸지만 보다 정밀한 구조체를 만들 수 있다.

 

upload_image
그림 2. 대표적인 바이오 프린팅 기법의 종류
(좌부터 사출법, 액적법, 레이저 기반 프린팅)

 

4.2 바이오 잉크 및 인쇄 전략

3D 신경세포 배양에 이용될 수 있는 많은 재료들이 이미 연구되었음에도 불구하고, 모든 재료들을 그대로 바이오 프린팅에 접목할 수 있는 것은 아니다. 현재 사용 가능한 물질은 주로 알긴산, 폴리(에틸렌 글리콜)디아크릴레이트(PEGDA), 피브린, 키토산, 히알루론산, 실크 피브로인, 젤라틴, 아가, 프로필 메틸 셀룰로오스, 콜라겐 등이다. 세포 주변을 생체재료와 생화학적 신호들로 완전히 둘러싸 버리는 기존의 세포 캡슐화 과정과는 달리, 바이오 프린팅은 바이오 잉크가 인쇄 속도에 걸맞는 적절한 젤화 속도를 가져야 한다. 또한 점도가 낮은 재료의 경우 충분히 높은 높이로 쌓아 올리는 것이 어려울 수 있다. 이 문제를 해결하기 위해 바이오 잉크의 속성을 최적화하는 몇 가지 전략들이 있다. 이에 대한 예시를 아래에서 살펴보자.

재료를 인쇄가 용이하도록 물성을 향상시킬 수 있는 전략은 인쇄하기 전에 재료를 부분적으로 가교결합 시키는 것이다. 예를 들어, 알긴산에 소량의 칼슘 이온을 첨가하는 것은 점도를 증가시켜서 인쇄하기 쉽게 만든다. 하지만 증가하는 삼투압 때문에 세포 독성이 발생할 수 있기 때문에 조심스럽게 농도를 조절해야 한다. Zhou이 이용한 방법은 미생물의 transglutaminase (MTGase)를 사용하여 GelMA를 부분적으로 가교 결합시키는 것이다. 처리된 GelMA는 점도가 증가하여 순수한 GelMA보다 인쇄가 훨씬 용이했다. UV에 민감한 GelMA, 히알루론산(HA)메타크릴레이트, PEGDA같은 경우에는 UV 광원을 이용해 부분 가교시키는 전략을 이용할 수 있다.

인쇄 적합성을 개선하는 또 다른 방법은 재료의 고유한 특성을 이용하는 것이다. 예를 들어, 플루로닉은 온도 감응성을 가지는 물질로 37℃에서 젤레이션이 일어난다. 플루로닉을 알긴산과 혼합하여 출력한 결과 순수한 알긴산에 비해 형상 유지력이 크게 향상되었다. 이는 이후 칼슘 이온을 추가하여 가교결합을 더해 구조를 보다 견고하게 강화할 수 있다. 또한, 나노재료를 rheological modifier로 이용한 사례들도 많다. 예를 들면, 순수한 5%의 GelMA는 바이오 프린팅을 위하여 온도를 정확하게 컨트롤해야 하지만, 0.5~2%의 나노실리케이트를 첨가하면 보다 점성이 늘어나며 물성이 향상되었다.

탈착식 배쓰에서 인쇄하거나 추후에 제거할 수 있는 지지체를 이용해 구조체의 안정성과 정밀도를 보다 높일 수 있다. 이 방법에서 이러한 일회성 지지체는 바이오 잉크 및 세포와 호환되어야 하며 세포 독성 부산물 없이 쉽게 제거할 수 있어야 한다. Hinton이 개발한 FRESH method가 대표적인데, 연구진은 젤라틴 마이크로파티클로 구성된 열 감응성 배쓰 내부에서 프린팅하여 구조의 유연성과 복잡성을 높였다. 이 연구에서 이 배쓰를 이용해 피브린, 콜라겐, 마트리겔을 200 μm 분해능으로 대퇴골, 심장 및 두뇌와 같은 복잡한 구조를 프린팅하였다. 이와 같이 해부학적으로 복잡한 구조를 가진 신경 조직 프린팅의 가능성을 제시했다.

한편으로는 co-axial 노즐을 이용하는 연구가 최근 활발하게 연구되고 있다. 젤레이션 과정은 피브리노겐이나 알긴산 등의 단위체가 가교제(crosslinker)에 노출되면 일어나게 된다. 그래서 co-axial 노즐을 이용하여 단위체 솔루션과 가교제를 동시에 출력했을 때 노즐의 끝에서 즉각적으로 젤레이션이 일어나게 할 수 있다. 2중층으로 된 노즐의 안쪽과 바깥쪽에서 다른 용액이 사출되게 함으로써 점성이 낮은 재료의 프린팅이나 속이 비어있는 튜브 형태의 구조물, 2중층 구조물 등을 출력할 수 있다.

4.3 바이오 프린팅으로 만들어진 3D 신경 조직의 응용

다음 섹션에서 우리는 신경 조직의 응용에 중점을 두고 위에서 언급한 다른 모델들과 비교 하여 장점과 잠재적인 이점을 따져보았다. 모델링에서 넘어야 할 장애물을 확인하고 추후 극복할 수 있는 방법을 제안했다.

4.3.1 다세포 구조체

바이오 프린팅 과정에서는 재료의 점성, 노즐의 직경과 사출 압력 등의 요인들로 인해 발생하는 압력과 장력, 전단응력 등의 시너지 효과가 발생하기 마련이다. 그래서 많은 초기의 연구들은 바이오 프린팅 과정을 거친 후 세포들의 기능과 활성을 유지하는 것에 초점을 맞췄다. 세포의 생존율은 바이오 프린팅 이후에 확인해야 하는 가장 중요한 수치라고 할 수 있다.

동물 세포들로 진행한 바이오 프린팅 연구들이 좋은 성과를 내면서 인간 세포로 연구가 확장되었다. 인간 세포를 인쇄하는 것에 관한 주목할만한 연구는 Gu의 팀에서 수행했다. 인간 신경줄기세포를 새로운 바이오 잉크를 이용해 3D 다공성 그리드 구조로 직접 인쇄하였는데, 알긴산, 아가로오스 및 카르복시 메틸 키토산(CMC)으로 구성된 이 바이오 잉크는 신경줄기세포의 증식과 분화를 도왔다. 인쇄된 구조체 내에서 세포들이 시냅스 연결을 형성하고 자발적인 네트워크 활동을 보였다.

이런 성과에도 불구하고 인간 세포를 이용한 바이오 프린팅 연구는 그 필요성에도 불구하고 활발하게 진행되고 있지 못하다. 이는 아마도 인간의 신경 조직을 쉽게 얻기 어렵기 때문일 것이다. 최근의 iPSC 및 신경 분화 프로토콜의 발전은 이 문제에 대한 해결책이 될 수 있다. Alan이 프린팅을 거친 이후 인간 줄기세포가 충분히 살아남을 수 있는지에 초점을 맞춰 연구를 진행했는데, 밸브 기반 바이오 프린팅을 거친 후 hiPSCs 및 hESCs는 모두 70% 이상의 생존율을 나타내었고 인쇄되지 않은 세포와 생존율에서 유의미한 차이가 없었다. 또한 세포가 인쇄 후 간세포 분화 배지에 노출되었을 때 nuclear factor 4 alpha 양성 반응을 보였으며 알부민을 분비했다. 이 연구는 적절한 분화 조건을 이용하여 세포를 신경 계통으로 분화시킬 수 있는 가능성을 제시했다.

4.3.2 3D 구조

세포와 재료를 원하는 위치에 쌓아 올릴 수 있는 프린팅 기법을 이용해 귀, 피부, 뇌와 해부학적으로 유사한 구조체를 만들 수 있다. Lozano는 RGD 펩타이드로 개질한 젤란검을 이용해 뇌와 유사한 구조물을 사출법을 이용해 프린팅했다. CaCl2를 가교제로 첨가해 다층 구조체를 안정화시켰다. 결과적으로 젤란검의 다공성 구조는 산소와 양분 공급하는 역할에 아주 적절했고 세포 성장과 네트워크 형성에 있어 순수한 젤란검보다 긍정적인 영향을 주었다. 이를 이용하여 뇌 피질 구조를 모방하기 위해 대뇌피질 뉴런을 이용하여 3차원의 구조체를 출력하였다. 그 구조는 상하의 세포 층으로 되어 있으며 각각 106개의 세포로 되어 있고 중간층에는 세포를 포함하지 않는 층으로 구획을 분리했다. 5 일간의 배양 기간 동안 축삭돌기가 세포가 없는 층으로 침투하여 성장하는 것을 보였다.

Hsieh가 실시한 다른 연구에서 신경계 질환의 연구를 위해 합성 생분해성 열 감응성 폴리 우레탄을 이용해 신경줄기세포를 3차원으로 출력하였다. 폴리우레탄은 독성 가교 결합제 없이 37℃에서 자발적으로 가교 결합되었다. 그 결과 폴리(ε- 카프로락톤)디올(PCL-diol)과 폴리(D, L- lactide) (PLLA diol)을 기반으로 한 25% 폴리우레탄이 세포 증식 및 분화를 촉진하는 데 최적이라는 것을 보였다. 또한, 3차원으로 인쇄한 구조체를 TBI가 있는 성체 제브라 피쉬에 이식하여 구조물의 효능을 평가했다. 6일 후, 제브라 피쉬는 양호한 회복 양상을 보였다. 따라서 결과는 폴리우레탄이 NSC의 적절한 운반체임을 시사하고 바이오 프린팅이 신경 이식 및 재생을 위한 유망한 대안이 될 수 있다고 제시했다.

4.3.3 생화학적 농도 구배 도입

바이오 프린팅은 세포의 운명을 조절하기 위해 잘 조직화 된 방식으로 생화학적 시그널의 정확한 패터닝을 가능하게 한다.

Lee는 바이오 프린팅된 하이드로겔에서 시간에 따른 성장인자의 방출을 조사했다. 먼저 콜라겐 젤 기질에 직사각형 모양의 신경 줄기세포(L × W = 3 × 2mm2)를 패터닝 했다. 이어서, VEGF가 풍부한 피브리노겐을 세포 옆에 인쇄한 다음, 동일한 위치에 트롬빈을 인쇄해 피브리노겐을 가교 결합시킨다. 그 후, VEGF가 주위 매질로 급속히 확산되는 것을 방지하기 위해 세포 및 가교 결합 된 VEGF-함유 피브린 겔을 둘러싸기 위해 콜라겐 겔 층을 인쇄해 세포의 증식, 형태 및 이동을 모니터링했다. 결과적으로 세포가 VEGF-함유 피브린 겔을 향해 활발하게 이동하여 복잡한 형태를 형성했다. 세포의 이동은 3일에 걸쳐 지속되었으며, 이는 성장인자가 하이드로겔 내에 국소적으로 잘 담지되었다가 시간에 따라 방출되었음을 보여준다. 그러나 이 가설을 확인하기 위해서는 VEGF를 정량화하기 위해 시간에 따른 정밀한 측정이 필요하다.

요약하면, 이 연구는 여러 유형의 하이드로 겔(pH 의존성 콜라겐 및 효소로 가교된 하이드로겔)을 인쇄 할 수 있는 가능성을 보여 주었을 뿐만 아니라, 성장인자의 방출을 조절할 수 있는 공학적 신경 구조물의 프로토 타입을 제시했다는 것이다. 시그널링 분자의 정확한 패터닝에 의해, 원하는 세포 반응을 유도하고 줄기세포의 운명을 결정하는데 이용될 수 있다.

5. 남은 과제와 미래 전망

실제 조직의 생리적 환경을 반영하려면 매우 동적인 미세 환경에서 세포가 어떻게 행동하는지 이해하는 것이 중요하다. 세포 기반 모델 및 공학 기반 모델을 포함한 3차원 체외 배양 시스템은 신경 조직의 발달 과정을 이해하는 데 많은 진전을 가져왔다. 그러나 세포 및 신호 분자에 대한 제어가 불충분하면 세포-세포 및 세포-ECM 간의 상호 작용을 포착할 수 없다. 공학, 재료 과학 및 생물학을 연결하는 바이오 프린팅은 각 분야의 강점을 활용해 기존에 불가능하던 연구들을 가능케 할 수 있다. 조직 공학, 피부, 뼈, 귀 및 혈관과 같은 여러 조직에서 놀라운 발전이 이루어졌지만 신경 조직의 생체 인쇄는 아직 초기 단계라고 할 수 있다.

시험관 내에서 조직과 기관을 만드는 데 있어 중요한 과제는 정확하게 세포를 원하는 곳에 배치하는 것이다. 바이오 프린팅은 시험관 내에서 조직과 기관을 복제하는 데 큰 잠재력을 지닌다. 그러나, 제한된 신경 조직 모델이 바이오 프린팅을 이용해 만들어졌다. 또한, 진행된 연구는 거의 세포의 형태적인 변화에만 초점을 맞추고 생리학적 특성에 대해서는 충분한 평가가 이뤄지지 않았다. 여러 측면에서 다음과 같은 한계점이 존재한다.

5.1 기술적 문제

뉴런은 주변의 미세 환경에 매우 민감하여 인쇄 과정에서 발생하는 전단 응력이 세포의 생존과 변형에 미치는 영향을 무시할 수 없다. 참고 문헌에 나와 있듯이, 전단 응력은 주로 인쇄 압력, 노즐 팁 직경 및 재료 점도에 영향을 받는다. 재료 점도를 낮추고, 노즐 크기를 증가시키고, 이상적인 최소 인쇄 압력을 선택함으로써 전단 응력을 줄일 수 있다. 그러나 이 전략은 필연적으로 인쇄 해상도를 감소시키게 된다. 따라서 전단 응력과 인쇄 해상도의 균형을 맞추는 전략을 개발하는 것이 중요하다.

5.2 여러 종류의 세포

여러 연구가 여러 종류의 세포들을 함께 인쇄했지만, 다소 제한된 신경 세포 유형(주로 설치류의 피질 뉴런, 슈반 세포 또는 NSC)만이 이용되었다. oligodendrocytes, microglia, astrocytes 및 pericytes 와 같은 신경계에 존재하는 다른 종류의 세포들이 실제 신경계를 충분히 재현하기 위해서는 함께 출력되어야 한다. 이는 여러 세포들의 공동 배양 및 다양한 세포 유형의 생존 및 기능을 보다 잘 지원할 수 있는 적합한 물질의 개발에 대한 도전 과제를 제시한다.

줄기세포는 다양한 세포로 분화 할 수 있는 내재적 잠재력을 지니며 세포-세포 및 세포-ECM 상호 작용을 통해 분화한다. 따라서, 다양한 신호 분자들과 줄기세포를 적절하게 출력하여 신경 조직의 해부학적 구조와 미소 환경을 더 잘 재현할 수 있다.

5.3 세포를 출력할 수 있는 바이오 잉크 배합

3차원 프린팅 기술은 금속이나 고분자를 섬세한 구조로 출력할 수 있게 한다. 하지만 바이오 프린팅 연구의 큰 걸림돌 중 하나는 프린팅 재료의 선정이 훨씬 까다롭다는 것이다. 세포를 지지하면서도 인쇄에 적합한 재료를 찾기는 생각보다 어려운 일이다. 특히 신경 조직은 기계적 물성이 굉장히 약하기 때문에 유사한 물성을 갖는 재료들은 입체적으로 쌓아 올리기 어렵다. 즉, 세포와 함께 출력 가능하면서도 다양한 물성을 갖도록 조절할 수 있는 재료를 찾아내는 것이 중요하다.

5.4 신호 분자의 농도 기울기

장기들이 형성되는 조직화 과정에서 형성 인자들의 농도 기울기를 통해 발달이 이루어진다. 따라서 이 요인을 프린팅 과정에서 필수적으로 고려해야 하며, 이런 생화학적 신호에 대한 정교한 제어를 통해 가변적인 구조를 크게 개선할 수 있다.

5.5 혈관 신생

적절한 혈관 생성이 실패하면 조직 괴사가 발생하기 때문에 3D 조직 구조의 혈관 형성은 조직 공학에서 가장 큰 과제 중 하나이다. 현재까지 혈관 형성에 성공한 신경 조직은 없지만 다른 관련 연구에서 아이디어를 얻을 수 있다. Sakaguchi는 콜라겐 기반으로 한 마이크로 채널과 관류 흐름을 이용해 시험관 내에서 혈관 구조를 가진 조직을 출력했다. 이와 유사하게 추후에 제거되는 물질(sacrificial materials) (예: 아가로오스, Pluronic, gelatin bath) 또는 co-axial 프린팅을 통해 혈관 네트워크를 두꺼운 조직에 융합시킬 수 있다. 이와 같이 구조체 내부에 출력된 관 구조물은 혈관으로서 작용할 수 있으며 내피세포를 이용해 혈관 네트워크 형성을 촉진할 수 있을 것이다.

6. 개요

세포 및 ECM의 시너지 효과에 대한 인식이 높아짐에 따라 3D 배양 시스템의 개발이 촉진되었다. 3차원 모델은 생체와 관련성이 높은 환경을 제공하고 신경 조직 발달의 수수께끼를 푸는 데 큰 잠재력을 가지고 있다. 그럼에도 불구하고, 신경계를 모델링하는 것은 다양한 신경 세포가 존재하는 구조와 세포 사이에 형성되는 네트워크의 극단적인 복잡성으로 인해 굉장히 어려운 과제이다.

지난 수십 년 동안 이 논문에서 살펴본 바와 같이 스페로이드, 오가노이드, 공학 기반 모델 및 미세 유체 공학을 비롯한 3D 배양 모델의 개발 및 적용이 급속히 발전하고 있으며 그 각각의 장점과 한계가 뚜렷하다.

오가노이드가 조직의 발달과정의 세부적인 부분에 대한 유용한 통찰력을 제공하지만 스캐폴드는 적절한 구조와 복잡성으로 조직을 만드는 과정을 효과적으로 제어한다. 반면에, 미세 유체 플랫폼은 실제 환경과 더 관련 있는 역동적인 배양 조건을 제공한다. 그러나 이러한 방법들 중 어느 것도 완벽하지 못하며 생성된 조직 모델을 섬세하게 통제할 수 없다. 새로운 바이오 프린팅 방법은 재료, 세포 및 신호 분자를 긴밀하게 공간적으로 조절할 수 있게 한다. 그러나 그 큰 잠재력에도 불구하고 해결해야 할 몇 가지 한계점이 있다. 특히, 인쇄 가능한 생체재료의 한계가 뚜렷하기 때문에 새로운 바이오 잉크 재료에 대한 개발이 필요하다. 또한, 실제 조직 내에서 생체 분자들의 농도 구배에 대한 더 나은 이해가 필요하다. 우리는 가까운 장래에 혁신적인 생체 재료 및 엔지니어링 방법론이 3D 바이오 프린팅 기술을 지속적으로 향상시킬 것이라고 기대한다.

 

  추천 1
  
인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
  
본 게시물의 무단 복제 및 배포를 금하며, 일부 내용 인용시 출처를 밝혀야 합니다.
Citation 복사
김슬하(2019). 3차원 신경 조직 모델: 스페로이드에서 바이오프린팅까지. BRIC View 2019-R21. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3301 (Aug 20, 2019)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
  댓글 0
등록
목록
고려대학교
위로가기
동향 홈  |  동향FAQ  |  동향 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아