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XXI. Annual Linz winter workshop - Advances in single-molecule Research for biology and nanoscience 참관 후기
XXI. Annual Linz winter workshop - Advances in single-molecule Research for biology and nanoscience 참관 후기 저자 류제경 (델프트공과대학교, 네덜란드)
등록일 2019.03.26
자료번호 BRIC VIEW 2019-C04
조회 1021  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
린쯔 워크숍은 AFM 기법을 중심으로 Super-resolution microscopy, single-molecule FRET, optical tweezers 등의 다양한 single molecule biophysics 주제로 매년마다 2월경에 열린다. 이번 린쯔 워크숍에는 다양한 단백질의 HS AFM 이미징이 주로 소개되었고, 다양한 bio AFM 기법들이 소개가 되었다. 바이오 물질 표면의 화학적 성질부터 전기적 성질 거기에 기계적 성질까지 다양한 방법의 측정 기술로 이미징하는 것들이 소개가 되었다. AFM이 개발된 이후에 bio 샘플에 이용이 된 후, AFM의 디테일들이 정말 많이 개발이 되었고, 여러 연구소와 회사들을 통해서 다양한 commercially available한 기법들이 많이 개발되었음을 느낄 수 있다. 또한, 그동안 실험적으로 어렵다고 여겨진 실시간으로 단백질의 구조 변화를 초고해상도로 실시간으로 영화를 찍듯이 촬영하는 기법인 HS AFM 기법이 다수 소개가 되었고, 물리의 발전이 이렇게 생물학에 지대한 영향을 줄 수 있다는 것을 새삼 더 깨달을 수 있었던 워크숍이었다.
키워드: AFM, HS AFM, 이미징, 단백질 구조
분야: Biophysics
목차

Ⅰ. 학회소개
Ⅱ. 주요 발표 내용
  - HS AFM
  - Molecular recognition 이미징
  - 다양한 대상 측정
Ⅲ. 총평


린쯔 도시 전경
< 린쯔 도시 전경 >


Ⅰ. 학회소개

린쯔 워크숍은 올해는 11번째가 된다. 워크숍을 바로 하기 전날에는 매년 마다 근처 스키장에 같이 가서 친목을 다진다. Peter Hinterdorfer 교수가 organization을 하는데, bio AFM을 연구하고 있다면, 꼭 한 번쯤은 가야 하는 학회이다. 특별히 워크숍이 열리기 전에는 Peter 교수님이 하시는 다양한 AFM 기법에 대한 강의와 직접 한 번씩 다뤄 볼 수 있는 Hands-on session도 있어서 생물학에 AFM을 적용하려고 하는 입문자와 이 분야에서 디테일을 이야기하고자 하는 사람이라면 꼭 가 볼만한 학회이다. 요즘 생물물리학 추세가 general한 토픽을 다루는 학회보다는 깊은 생물학 주제를 다루거나 아니면 새롭게 개발되어진 생물학을 위한 생물물리 테크닉이 소개되는 학회로 사람들이 몰리는 추세여서 올해도 뜨겁게 워크숍이 열리게 되었다.

요즘은 전자현미경 기법에서 노벨상이 나오고, 단백질 구조 연구에 전자 현미경 기법이 아주 활발하게 되어 오고 있지만, 아직 전자 현미경은 single particle analysis를 하지 않으면 단백질들의 낮은 contrast 때문에 개별의 단백질들을 이미징 하기에는 한계가 있다. 그런 의미에서 AFM 이미징은 여전히 독보적인 위치를 가지고 있고, 특별히 DNA와 단백질의 상호작용 연구에는 좋은 contrast 덕분에 보편적으로 진행이 되고 있다. 무엇보다 최근에 개발된 HS AFM 기법은 유일하게 단백질의 구조 변화를 액상에서 아주 초고속으로 이미징을 할 수 있는 기법이다.

Ⅱ. 주요 발표 내용

본 연구자가 이 학회를 가게 된 이유는 현재 어떤 AFM 기법들이 개발되고 있는지 알아보고 싶었고, 아직 본 연구자의 AFM 연구의 테크니컬한 한계들을 어떻게 극복할 수 있는지를 알아보고 싶었기 때문이다. 본 연구자의 연구에는 여전히 표면 처리 문제와 tip과 sample의 interaction 문제가 한계점으로 남아있다. 그래서 어떤 방식으로 표면 문제를 해결하고 있는지, 더 좋은 tip은 없는지를 알아보고 싶었고, dry AFM의 이미징의 한계를 어떻게 하면 극복할 수 있는지를 보고 싶었다.

- HS AFM

Toshio Ando의 Pore forming 생체막 단백질의 실시간 이미징

HS AFM을 처음으로 개발하고, 보여준 사람은 일본의 Kanazawa 대학의 Toshio Ando 교수다. 이번 연도에도 Ando 교수님이 이 학회에 오셔서 Plenary talk을 해주셨다. HS AFM이 적용할 만한 가장 좋은 대상은 생체막 위에서의 현상인 것 같다. 특별히 AFM에서는 고정 생체막 위에서 이미징하는 것이 선호되는데, 그 이유는 생체막 때문에 Surface에 단백질이 denaturation 되는 정도가 줄어들기 때문이다. 이번에 Ando 교수님이 연구하신 것은 생체막의 pore를 형성시키는 단백질인 Streptolysin O라는 단백질이었다. 이 단백질은 cholesterol을 recognition 할 수 있는 부분이 있어서, 생체막에 붙었을 때 구조 변화가 일어난다고 알려져 있다. Prepore에서 pore가 형성되는 전이 과정을 HS AFM 기법으로 연구를 하였는데, 높이가 11 nm에서 7 nm로 바뀌는 것을 관찰하였다. 단일 스텝으로 과정이 이뤄지지 않았고, oligomer 형성 과정과 다양한 스텝으로 pore가 형성되는 것을 보여주었다. 또한 pore가 3-4 nm였다가 1-2 nm로 바뀌는 과정도 보여주었다. 이 결과는 생체막 단백질의 구조 변화를 이해하는데 중요한 단초를 제공한다고 볼 수 있다.

Felilx Rico의 High-speed Force spectroscopy

HS AFM의 빠른 스캐닝 스피드를 HS FS (High speed force spectroscopy)에 적용을 하였다. 이것으로 단백질의 unfolding과 receptor/ligand의 unbinding을 MD simulation 정도의 빠르기까지 측정할 수 있게 하였다. 그래서 생물학적인 현상을 원자 수준까지 이해하려고 했다. Heterogeneious하고, rate에 의존하는 unfolding과 unbinding의 경로를 다른 생물 분자에서 보여주었다. 또한 초고속 진동을 가지는 microrehology도 개발해서 세포의 기계적인 특성을 아주 고주파수(100 kHz)로 측정했다. 서로 다른 세포에 대한 viscoelastic response를 측정했다. 이것은 아마 세포의 기계적 특징을 개별의 filament 수준에서 볼 수 있게 하는 결과이다.

Heiko Haschke의 High-speed, correlative AFM-light microscopy

이제까지 HS AFM 기법은 단백질 하나의 개별 단위의 이미징에 초점을 두고 오면서 작은 스캐너의 영역과 작은 이미지 size에서 이뤄져 왔다. 따라서, 세포를 이미징하는 데에는 큰 한계가 있었다. 최근 Bruker를 합병한 JPK는 초고속(several frames/sec)으로 형광 기법과 AFM 기법을 결합하여 이미징하는 장치(NanoWizard Ultra High Speed AFM)를 개발하고 상용화하는 데 성공하였다. 또 세포 단위로 이미징을 할 수 있도록 스캐너의 영역도 확장을 시켰다. 이것으로 일반 epi-형광 현미경, 초고해상도 형광 현미경(STED), TIRF, confocal microscopy 등까지도 같이 결합하여 연구하는 사례들이 소개가 되었다. 이 장비는 일반 현미경 위에 바로 얹기만 하면 되도록 설계가 되어서 AFM 기법과 형광 기법의 장점들을 모두 갖춘 장비가 되었다. 또한, 기존의 sample scanning 방식에서 tip scanning 방식을 사용함으로 형광 이미징 샘플이 움직일 필요가 없게 되었다. 앞으로 이 장비로 많은 application이 있을 것이라 기대된다.

Ted Limpoco의 video-rate AFM imaging

Asylum research 회사에서도 초고속 AFM 기법을 개발하였는데, 이 기법으로 625 lines/sec의 이미징 속도가 가능하게 되었다. 물론 Ando type에 비해 아직 빠르기는 10배 정도 느리지만, user friendly 한 면에서는 한층 앞선 것 같다. 이 장비로 collagen fibril formation 되는 과정을 보았고, Nuclease에 의해서 DNA가 cleave 되는 것도 실시간으로 보여주었다. Exonuclase의 작동, origami의 formation의 실시간 측정, graphite 위에서의 micelle의 실시간 이동도 관찰한 것을 보여주었으며, Calcium channel 단백질의 구조 변화 측정, 거기에 viral particle의 구조도 구체적으로 보여준 사례들을 소개해주었다. 중간 중간에 많은 분들이 HS AFM을 이용하여 단백질에 적용한 사례들을 보여주었는데, 이제 HS AFM 기술이 보편화되어 가고 있음을 더욱 느낄 수 있었다.

Toshio Ando가 HS AFM을 개발한 이후 Bruker, Asylum 등도 후발주자로 이 기술을 따라오고 있다. 아직 Ando type의 HS AFM의 speed를 따라간 것은 아니지만, 이전에 비해 현격히 빠른 speed의 이미징 기술을 보여주고 있었다.

Pierre-Emmanuel Milhiet의 생체막 organization과 remodeling

생체막 분열을 일으키는 단백질을 membrane 위에서 filament를 형성하면서 membrane을 변화시키는 과정을 보여주었다. 특히 이 단백질이 PIP2와 상호작용을 하는 과정을 실시간으로 보여준 것은 정말 인상적이었다. 또한, Mg2+ 같은 divalent ion에 의해서 이 filament 형성이 어떻게 조절되는지를 보여주었다.

Jurgen Strasser의 C1q binding to IgG oligomers

포스터 중에서도 HS AFM 기법을 소개한 사례들이 몇몇 있었다. HS AFM과 관련된 poster session 중에서 가장 흥미로웠던 것은 IgG antibody의 hexamerization을 관찰한 결과였다. Immunology 에서 C1q란 세포 표면에서 antibody를 recognition 하는 단백질이 있는데, 이것과 IgG의 반응이 immune 반응을 일으킨다고 한다. 하지만 어떻게 이 둘이 binding하고, activity를 갖는지는 전혀 알려지지 않았다. 흥미로웠던 것은 mica 표면에 이 antibody를 부착시켜서 이미징을 했을 때는 표면 artefact로 이상한 현상이 관찰이 되었는데, 고정 생체막 위에 DNP이라는 epitope를 이용해서 antibody를 부착시켰더니 antibody의 functionality가 정확히 관찰이 되는 것이었다. 표면 위에서 떠다니는 antibody들이 서로 만나서 oligomerization 되는 것은 표면 처리가 얼마나 HS AFM 이미징에 중요한지를 보여준다고 할 수 있다.

또한 50 nm 정도 되는 nanoparticle을 이용해서 생체막의 curvature에 어떻게 이 antibody가 작용하는지를 연구하기 위해서 curvature가 있는 nanoparticle 위의 생체막을 만들어 주었다. 하지만 아직 한계가 이 nanoparticle이 clustering 되는 것을 막는 것을 피하진 못했다고 했다.

Karner의 SecA와 SecYEG의 상호작용 연구

SecA와 SecYEG의 membrane transporter 이미징을 HS AFM 기법으로 한 사례도 소개가 되었다. 고정 생체막 위에서의 생체막 단백질 이미징의 한계는 바로 생체막의 Diffusion 때문에 쉽게 구조 이미징을 할 수 없다는 단점이 있다. Diffusion이 심하면 scanning speed가 따라가지 못해서, 이미징을 하지 못하는 현상이 나타나는 것이다. 그래서 Preiner 그룹은 streptavidin crystal을 이용해서 생체막 단백질을 가두는 기술을 개발했고, 이 기술로 그 단백질을 이미징을 했다. 생체막 위에서 이 두 단백질이 결합하는 과정이 보여졌다.

- Molecular recognition imaging

박준원 교수님의 Abeta amyloid의 Molecular recognition imaging

포항공대 박준원 교수님은 알츠하이머를 일으키는 Amyloid beta에 대해서 연구를 했는데, 이 단백질의 N terminal 부분에 부착되는 antibody와 C terminal에 부착되는 antibody를 AFM tip 끝에 매달아서 Molecular recognition microscopy 기법으로, 이 oligomer에 N term과 C term 부분들이 어떻게 노출이 되었는지를 연구하였다. 그 결과 N term과 C term 모두가 표면에 expose 되어 있음을 보여주었다.

오유진 박사님의 Label-free probing of binding affinity using recognition imaging

오유진 박사님은 Molecular recognition imaging 기법으로 label-free biomolecule interaction을 측정하는 기술을 개발했다. 단순하게 DNA-DNA의 상호작용을 모델시스템으로 보여주려고 했다. AFM 탐침에 단일 가닥의 DNA를 부착해두고, 또 표면에는 다른 상보적인 DNA를 부착하면 결국 AFM을 긁으면서 binding 하는 부분이 mapping이 되었다. 이것으로 DNA의 농도를 바꿔가면서 Kd 를 측정했다고 했다.

- 다양한 대상 측정

Franz J. Giessibl의 qPlus sensor

Franz J. Giessibl은 SPM으로 노벨상을 수상한 Gerd Binning 밑에서 연구를 진행했다. 그때 교수가 3가지 문제를 풀어보라고 했다고 했다. 그중 하나는 DNA sequencing을 해보라고 했다. 그리고 지금까지 원자 하나를 이미징하는 것에 집중해서 왔다. qPlus라는 기법으로 SPM과 AFM을 동시에 측정할 수 있으며 piezo의 response를 tip으로 이용하는 기법인데, 정말 해상도가 아주 놀라웠다. 원자 하나의 전자 구름까지도 관찰하는 수준이었다. 하지만, 아직 3D 이미징에 대해서는 한계점을 가지고 있다고 했다.

Ricardo Garcia의 Hydration layers의 AFM 이미징

3D AFM 이라는 기법이 있었다. 이 기법으로 oil-water interface를 연구를 했는데, 질문이 hydrophobic한 곳 바로 위에서 물들이 어떻게 움직이냐는 질문으로 시작했다. 신기하게, 물 층이 hydrophobic한 그라핀 위에 2층 정도 나열이 되고, 그 뒤에는 일반 물처럼 작동했다. 아직 바이오에 어떻게 적용할지는 미지수이나, 단백질끼리의 hydrophobic interaction 이 중요한 일을 연구하는데 적용을 할 수 있을 것이라 생각한다.

Mervyn Miles의 Infectious와 non-infectious prion의 구조

Prion은 misfold된 단백질로 크로이츠펠트-야코프병(CJD) 같은 치명적인 질병을 유발한다. 이 단백질 중에 감염성과 비감염성의 질병이 있다는 것을 알게 되었다. 이 두 가지의 fibril의 특징을 AFM 기법으로 연구하였는데, 결과가 재미있었다. 감염성 있는 fibril의 특징은, 이게 2개로 나뉘었을 때, 각각의 끝 부분에서 fibril이 계속적으로 자라게 되어서, 결국은 분화가 된 것이 2개의 큰 덩어리가 된다는 것이다. 이런 식으로 마치 생명체가 번식하는 것처럼 단백질 fibril이 계속 많아지게 된다. 하지만, non-infectious의 경우에는 나뉘어도 각각이 다시 번식하지 않는다고 했다. 이 두 가지의 fibril의 성질을 AFM과 표면의 adhesion force를 측정해서 했다.

Simone Benaglia의 biomodal AFM을 이용한 단백질의 nanomechanical property 측정

아주 고해상도로 20S 프로테아좀의 구조를 이미징하면서 동시에, 이것의 nanomechanical property까지 측정을 했다. 아주 고해상도로 단백질의 영역마다 mechanical property가 다름을 보여주었다. 지금은 잘 알려진 단백질의 구조인 20S proteasome의 연구를 진행시켰는데, 한 단백질 분자에 대해 이 기술을 적용했다는 것이 아주 독보적인 것 같다. 생물학적인 의미가 있는 질문을 잘 찾아내면, 분명 쉽게 풀지 못하는 숙제를 풀 수 있지 않을까 하는 생각이 들었다.

Ⅲ. 총평

아쉽게 한국에서는 AFM을 생물학에 적용하는 데의 강점이 많이 소개되지 않은 것 같다. 또한, 이렇게 필드가 커가는데, 아직 많은 메이져 대학에서도 AFM 을 전공으로 한 교수가 거의 없는 실정이다. Park Systems 가 아주 성공적인 AFM 한국기업으로 자리 잡았는데도 말이다. 그런 의미에서 린쯔 워크숍은 내가 해야 하는 역할에 대해 분명히 말해주고 있는 것 같았다. 원자에서부터 단백질까지, 그리고 단백질에서부터 세포의 각종 특성과 이미징까지, AFM은 포괄하는 범위가 정말 상당하다. 앞으로 Optical tweezer와 결합된 AFM과 형광 기법과 결합된 AFM이 아주 더 활발하게 연구가 될 것 같다. 특별히 본 연구자가 하고 있는 HS AFM 기법에 대해 표면 처리부터 tip 개발, 각종 다양한 단백질 이미징까지 배울 수 있었던 워크숍이었던 것 같다. 앞으로도 AFM은 계속 AFM 만이 할 수 있는 길로 소개되며 나아갈 것 같다. 이 워크숍을 다시 표현을 한다면 AFM을 개발하는 물리학 베이스의 연구자와 기업과 생물학 문제를 정의하고 풀려고 하는 사람의 만남과 그 다리 역할을 추구하는 워크숍이 아닌가 하는 생각이 들었다.

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류제경(2019). XXI. Annual Linz winter workshop - Advances in single-molecule Research for biology and nanoscience 참관 후기. BRIC View 2019-C04. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3195 (Mar 26, 2019)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
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