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미니 마이크로스코프를 이용한 실시간 뇌 세포의 활성관찰
미니 마이크로스코프를 이용한 실시간 뇌 세포의 활성관찰 저자 박성모 (The Hospital for Sick Children, Toronto, Canada)
등록일 2019.01.08
자료번호 BRIC VIEW 2019-T01
조회 1398  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
신경과학분야에서 현재 가장 큰 화두 중에 하나는 neuronal activity의 관찰과 분석이다. 이를 위해, microscope 기술이 발전을 거듭하고 있고, 그 중 크게 3가지의 방법(Two-photon microscopy, Single-photon miniature microscope, Fiber photometry)을 장단점으로 나누어 다룬다. 특히, 많은 연구자들이 손쉽게 접근하는 방법인 Single-photon miniature microscope의 현주소를 다루고, 발전방향을 예측한다. 또한 Calcium indicator의 발전 경향을 다루고, 어떠한 특징이 조명 받고 있는지를 본다.
키워드: Miniature microscope, Two-photon microscopy, Fiber photometry, Calcium indicator, In vivo imaging, neuronal activity
분야: Biotechnology
목차

1. 서론
2. 본론
  2.1 Calcium Indicators
     2.1.1 Calcium Indicators의 한계점
     2.1.2 Calcium Indicators의 두 종류
  2.2 Two-photon In Vivo Calcium Imaging
     2.2.1 Two-photon In vivo Calcium Imaging의 간단 원리
     2.2.2 Two-photon In Vivo Calcium Imaging의 한계점과 보완 방향
  2.3 Single-photon In Vivo Calcium Imaging Using Miniature Microscopes
     2.3.1 Single-photon In Vivo Calcium Imaging의 간단 원리
     2.3.2 Single-photon In Vivo Calcium imaging의 장단점
  2.4 Fiber Photometry
     2.4.1 Fiber Photometry의 간단 원리
     2.4.2 Fiber Photometry의 특징
     2.4.3 Fiber photometry의 한계점
3. 결론
4. 참고문헌


1. 서론

1.1 과거 neuronal activity에 대한 연구방향

신경과학에는 다양한 많은 세부 분야가 있다. 분자세포 수준에서의 변화 또는 조절, 신경망의 변화 또는 조절, 행동실험체의 변화 또는 조절 등을 예로 들 수 있다. 뇌 세포 속의 분자물질 변화는 항상 관심의 대상이 되어 왔으며, 변화를 관찰하는 방법들 또한 과학기술의 발달로 꾸준히 변화되어오고 있다. 1900년대 초반에는 염색법을 이용하여 신경세포의 모양을 관찰하였고 [1], 시간이 지나면서 염색약의 발달로 세포의 종류별(흥분성 신경세포, 억제성신경세포, 신경교세포등)로 구분을 하는 것이 가능해졌다 [2-4]. 신경세포의 종류를 구별하는 기술은 유전자 특이적 분류와 전기생리학적인 특성을 이용하여 발전되어왔다 [5-8].

하지만, 앞서 언급된 방법들은 모두 실험체의 사후에 뇌를 척출하여 관찰해야한다는 한계가 있다. 따라서, 신경과학자들의 가장 큰 열망 중에 하나는 in vivo observation 이다. 이러한 요구들을 충족시켜주기 위한 기술들이 점점 발달되기 시작되었다. In vivo electrophysiology는 실험체의 뇌 반응을 실시간으로 관찰하는 길을 였었다 [9-11]. 그에 따라 관련 연구의 논문들이 급격히 출간되어 왔다 (그림 1). In vivo electrophysiology 크게 Local field potential [13,14]과 single unit activity [15,16]를 측정하는 방법으로 크게 분류가 되는데, 이러한 기술들은 신경과학 연구자들에게 신경활성에 대한 직접적인 증거를 제시해주어 왔다.

Optogenetics의 등장은 기존의 신경세포의 활성을 단순히 관찰하는 수준에서 활성 조작의 단계로 끌어올려주었다. 물론, optogenetics를 이용하기 위해서는 Channelrhodopsin 등의 light-sensitive membrane proteins을 목표로 하는 뇌 부위에 발현을 시켜야 하지만, 이를 이용하여 단순 신경세포의 활성이 아닌 조작을 통한 행동 변화 수준으로 차원을 이동시켜주었다 [17]. 신경세포의 활성 관찰과 조작은 신경과학분야에서, 특히, 인지, 기억, 행동 등의 관련 연구에서 활발히 적용되어 왔다.

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그림 1. In vivo electrophysiology를 이용한 연구논문들의 출간 수.
빨간색 선 (1986년)은 급격한 논문 출간 수의 증가를 보여주는 시점이다[12].

하지만, 기존 in vivo electrophysiology를 통한 실시간 뇌 세포의 활성 관찰은 뇌에 심어놓은 전극을 통해 전달되는 신경세포의 세포막 전위의 활성을 대변 해주기 때문에, 직접 뇌의 신경세포 집단간의 활성 비교, 특성 신경세포들의 활성 패턴 등을 관찰, 분석하기에는 역부족이였다. 따라서, 조직이나 세포를 관찰 할 때 사용하는 현미경을 실시간 뇌 관찰에 사용하고자는 요구들이 증가하기 시작하였다. Miniature Microscope는 이러한 제한점을 해결해 줄 수 있는 방안이 된다. 현재, 전 세계의 많은 신경과학 연구자들이 Miniature Microscope를 이용하여, 다양한 행동실험과정에서 신경세포들의 활성을 관찰하고 있으며, 심지어, 관찰된 결과들을 토대로 computational modeling을 통해서 예측 가능한 신경세포들의 반응을 구현하고, 그 특징들을 이해하는데 집중하고 있다 [18-20].

따라서, 이번 최신동향 리포트에서는 현재 활발히 이용되고 있는 신경과학 접근법 중에서 Miniature Microscope를 다루고자 한다. 많이 사용되는 Fiber photometry, Two-photon in vivo calcium imaging, Single-photon in vivo calcium imaging 을 각각 소개하고, 어떤 차이점들로 구분되어지를 다루고자 한다.

2. 본론

2.1 Calcium Indicators

신경세포의 활성을 관찰하기위해서 고안된 접근법은 Calcium (Ca2+) signal을 이용한다. Ca2+은 세포질에서 2차 신호전달자의 역할을 하며, Sodium, Potassium, 또는 Chloride와 같은 1가 이온(monovalent ion)들과는 달리, 매우 안정한 복합체를 이루면서 존재한다. Ca2+ imaging은 Nuclear Ca2+ transients의 발생이 High-frequency또는 Theta-burst stimulation에 의해 발생되는 Spike의 수와 관련되어 있음을 의미한다 [21].

2.1.1 Calcium Indicator의 한계점

Ca2+ imaging의 진화는 두 가지 요인에 의해서 제한을 받아오고 있었다. 1) Ca2+ indicator의 질(Quality) 2) Deep brain imaging을 위한 기술 개발이 이에 해당된다 [22]. 대부분의 살아있는 포유류의 실시간 Ca2+ signal recording은 Genetically Encoded Ca2+ Indicator (GECI)의 발전으로 가능해져 왔다 [23]. GECI는 연구자들이 Transgenic indicator 동물들을 통해 특정 신경세포들을 특정 목적에 맞게 실험 할 수 있도록 돕는다.

2.1.2 Calcium Indicators의 두 종류

GECI는 크게 두 가지로 분류가 된다. 1) Forster Resonance Energy Transfer (FRET), 2) Single-fluorophore GECI (GCaMPs)로 나뉜다 [22](그림 2). FRET은 donor/acceptor의 비율에 의해 작동이 되며, donor와acceptor의 거리에 의해 정확한 변화가 관찰될 수 있다. 반면, GCaMps는 광범위하게 사용되는 Single-fluorophores이다. 연구자들은 Neuronal processing을 보여 줄 수 있는 형광 단백질을 사용하는데, 그 형광 단백질은 세포질 내의 Ca2+의 농도 변화에 의해 반응하여 특정 신경세포를 Tagging 할 수 있도록 돕는다 [24]. GCaMps는 지금까지 많은 개발과정을 거쳐서 다양한 버전으로 사용 되어왔다. 최근까지는 GCaMP6가 새롭게 개발된 버전이며, 폭넓게 사용 중 이다. GCaMP6는 Single Action Potential을 탐지할 수 있는 slow, medium, fast하부버전으로 나뉘어져 있다 [26]. (GCaMP6s, GCaMP6m, GCaMP6f) 따라서, 각각의 실험용도와 대상 실험체에 따라 적용시킬 수 있다. 최근에는 GCaMP6에서 좀 더 업그레이드 된 버전이 보고되었다. Dana H., et al., 2018에서 논문의 저자들은 GCaMP6를 optimization하여 새로운 버전인 jGCaMP7을 만들었다. jGCaMP7s,f는 individual spike를 탐지하는 능력이 개선되었다. jGCaMP7b는 neurites와 neutropile을 관찰하기에 용이하고, jGCaMP7s,f는 광범위한 neuronal population을 tracking하는데 적합하다. jGCaMP7c는 wide-filed imaging에 최적화되었다고 연구결과를 보고하였다. 이러한 발전의 흐름은 점점 빨라지고 있다. 그리고 개선된 GCaM 버전들은 연구의 정확성을 더 하고 있다.

Calcium Indicator의 발전은 세포수준의 활성을 이미지화하기위한 주된 driving force가 되어왔다. 하지만, 여전히 light scattering이라는 한계점을 해결하지는 못하였다. 그러나, Optical tool이 이러한 제한점을 해결하기 위한 방안으로 떠오르고 있다.

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그림 2. FRET과 Single-Fluorophore GECI. 
Calcium Indicator로써의 기능을 간략히 보여준다.

2.2 Two-photon In Vivo Calcium Imaging

Ca2+ imaging을 위한 방법은 크게 3가지로 나뉜다. Two-photon, Single-photon, Fiber photometry로 나뉜다. Miniature microscope는 Two-photon과 Single-photon을 사용하는 데에 이용된다 (그림 3).

2.2.1 Two-photon In vivo Calcium Imaging의 간단 원리

Two-photon microscopy는 laser beam이 confocal microscopy와 비슷하게 형광 분자를 선택적으로 excitation을 대상체에서 일으켜서 관찰을 가능하도록 한다 [26]. Two-photon microscopy는 형광신호가 excitation light intensity의 제곱값에 의존한다. 따라서, Laser beam이 target으로 하는 범위가 다른 fluorescence microspore 보다 멀리 갈 수 있다.

2.2.2 Two-photon In Vivo Calcium Imaging의 한계점과 보완 방향

Two-photon microscopy는 대물렌즈의 크기때문에, deep brain imaging을 위해 brain implant 시에 손상을 줄 수 있다. 따라서, superficial layers를 관찰하는 것에는 용이하다. 또한, 가격면에서도 단점이 있다. 다른 fluorescence microscopy에 비하여 가격이 높아 쉽게 실험에 적용하기에는 부담이 있다. 또 다른 제한점은 대물렌즈의 크기로 인해 실험대상체의 머리를 고정하고 사용해야한다. 그렇기 때문에, 자유롭게 움직이는 대상체를 imaging하기에는 단점이 발생된다. 최근에는 이러한 부분을 보완하기 위하여, 원통 모양 또는 구 모양의 treadmill을 이용하여 imaging 동안에 실험 대상체가 가상으로 움직일 수 있도록 하며, 가상현실의 환경을 만들어 주어 기존의 한계점을 뛰어넘으려는 시도를 해오고있다 [27,28].

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그림 3. Calcium signal을 측정하기 위한 3가지 in vivo techniques.

2.3 Single-photon In Vivo Calcium Imaging Using Miniature Microscopes

앞서 다룬 two-photon microscopy의 가장 큰 단점인 head-fixed behavior는 연구자들에게는 큰 제한 점이 되었다. 실제로 움직이는 개체의 실시간 뇌 활성을 관찰하는 것이 오랜 목적이였던 연구자들은 Miniature Microscope를 개발하기 시작했다. 연구에 실제로 적용되서 결과를 보고하기 시작한 것은 불과 10년도 안되는 짧은 기간이다. 그 동안 많은 연구팀들이 앞다투어 더욱 보완된 Miniature Microscope를 보고하기 시작했다.

2.3.1 Single-photon In Vivo Calcium Imaging의 간단 원리

Miniature Microscope는 Ca2+ imaging을 기반으로 하며, GRIN (Gradient-Refractive-Index) lens를 사용한다 [29]. 이 렌즈는 탈부착이 쉽기 때문에 실험 목적에 따라 neuronal activity를 관찰할 수 있다. 크기면에서도 충분히 작기 때문에, 실험체의 자유행동에 방해요인이 되지 않는다. 또한, Miniature Microscope의 무게는 대략 1.9g으로 Optogenetics와 함께 접목해서 사용하는 경우도 있다. 심지어 최근 들어 water maze에서도 사용가능하도록 water proof처리를 할 수 있도록 기술이 고안되었다. 따라서, 다양한 행동실험에 적용하는 범위가 점차 확대되고 있다 (그림 4).

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그림 4. Miniature microscope 모식도. 
CMOS sensor를 이용 실험동물체의 활동에 제약을 최소로 주는 방법. 

2.3.2 Single-photon In Vivo Calcium imaging의 장단점

자유롭게 움직이는 실험체로부터 실시간 neuronal activity를 관찰하고, activation 되는 pattern도 함께 관찰하여 분석이 가능한 Miniature Microscope은 Two-photon microscopy에 비해서 background fluorescence가 상당히 높다는 결점을 가지고 있다 [30]. 이러한 단점에도 불구하고, Single-photon miniature microscope는 deep brain region들의 neuronal activity를 관찰하는데 용이하다 [31]. Single-photon에 의해 발생되는 결점은 점차 보완되고 있는데, Two-photon miniature microscope가 그 대안이다. 기술발전의 결실로 점점 업그레이드 된 Miniature microscope 가 등장하면서, 연구자들의 응용범위가 광범위해지고 있다.

2.3.2.1 Fiber Photometry

Two-photon calcium imaging은 다른 방법들에 비해 superior resolution을 제공한다. 하지만, 결점은 head-fixed signal recording만 가능하다는 것이다. Single-photon miniature microscope는 freely moving 상태에서 signal recording이 가능하고, cell body를 imaging하는 데에 적합하다. 하지만, 단점은 GRIN lens (직경 0.5-1mm)를 이식해야 하는데, 이 때 필수불가결하게 뇌 조직이 손상된다는 것이다.

1) Fiber Photometry의 간단 원리

이러한 결점을 보완하여 개발된 것이 Fiber Photometry이다. Time-correlated single-photon counting (TCSPC) 방식으로 fiber optics를 이용한다. 이 방식은 axon terminal의 population에서 presynaptic calcium activity를 측정하는데 특장점을 갖는다. 다른 접근 방식들에 비해서 근접 뇌 부위의 손상을 최소로 줄일 수 있다.

2) Fiber Photometry의 특징

Fiber photometry는 몇가지 특징을 가지고 있다. 첫째, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) 기술을 적용하여, FRET을 측정할 수 있다. FILM은 imaging technique으로 image를 만들기 위하여, sample로부터 fluorescence의 decay rate에서 발생되는 차이를 이용한다. 둘째, TCSPC-based fiber optics는 single photon을 측정하기 때문에, light detection에 ultrasensitive하다. 따라서, photobleaching 현상이 감소한다. 셋째, fiber optic design은 lab에서 직접 만들기에 용이하고, 다른 접근 방식들에 비해 비용이 적게 든다. 마지막으로, 크기와 무게가 상대적으로 작고 가볍기 때문에, multiple brain region을 동시에 recording할 수 있다.

3) Fiber photometry의 한계점

이러한 특징들에도 불구하고, 한계점 역시 존재한다. Fiber photometry는 individual cell의 activity를 관찰 할 수는 없다. 대신, probe tip에 인접한 neuronal population의 fluorescence의 활성을 관찰 할 수 있다. 따라서, 다양한 neuron의 활성을 관찰하기 위해서는 용이하지 못하다. 또 다른 제한점은 Calcium signal로부터 나오는 background autofluorescence를 분리해야 하는데, 이 부분은 연구자 각자의 능력으로 구분이 되기도 한다. 이러한 결점들에도 불구하고, brain cell의 population activity를 위한 연구에는 충분히 용이함이 입증되어왔다.

3. 결론

In vivo Calcium을 측정하는 technology와 methodology는 지난 10년 사이에 빠르게 진화되어 왔다 (그림 5). 그리고 optoelectronics의 새로운 발전도 계속해서 진행되고 있다. Miniature microscope의 CMOS sensor 또한 발전을 거듭하고, image resolution이 개선되도록 하고있다. 대부분의 기술들이 크기와 무게가 큰 제약으로 고려되기때문에, 크기와 무게를 효율적으로 줄이고, 실험동물의 자유로운 행동이 유지되도록 발전하고있다.

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그림 5. Miniature microscope와 관련 된 연구논문들의 보고 현황.
2000년부터 현재 2018년까지 꾸준히 연구보고 증가하고 있다[32].

Calcium Indicator의 계속되는 발전과 Imaging 기술의 개선은 다양한 뇌 부위에서의 neuronal activity를 관찰하고, 다양한 실험 조건에서도 가능하도록 돕고있다. 최근에는 3D printer의 기술개발로 연구실 자체에서 miniature microscope를 실험 조건에 최적의 상태가 될 수 있도록 제작하기도 한다. 실례로, 저자가 소속되어있는 연구실에서도 3D printer를 이용하여, 각각의 실험에 적합한 형태로 또는 imaging quality가 개선되도록 자체제작하고 있다.

과거 연구를 위한 기술제약이 큰 걸림돌로 여겨졌고, 다양한 아이디어를 구현하는데 어려움이 많았다. 하지만, 현재 다양한 조건과 관점에서 기술발전이 빠르게 진행되고 있기 때문에, 새로운 연구 아이디어가 경제요건으로 강조되고 있다.

4. 참고문헌

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본 게시물의 무단 복제 및 배포를 금하며, 일부 내용 인용시 출처를 밝혀야 합니다.
Citation 복사
박성모(2019). 미니 마이크로스코프를 이용한 실시간 뇌 세포의 활성관찰. BRIC View 2019-T01. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=3150 (Jan 08, 2019)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
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