목차Ⅰ. 주요 발표 내용
1. Standardisation of antimicrobial susceptibility testing of M.tuberculosis
2. Rapid AST with disk diffusion on direct inoculation from blood culture bottles
3. Susceptibility testing of anaerobic bacteria
4. Direct detection of pathogenic bacteria in blood: comparison between magnetic resonance
technology, blood culture and multiplex PCR
5. Keynote Session, Global coordinated action against antibiotic resistance - are we achieving
enough?
6. Microscopic imaging AST: where are we and where do we go?
7. Shotgun metagenomics and typing of bacterial DNA in 5mL whole blood from patients with
suspected bloodstream infection
Ⅱ. 총평
Ⅰ. 주요 발표 내용1. Standardisation of antimicrobial susceptibility testing of M.tuberculosis - Presenter: Emmanuelle Cambau (Universite Paris Diderot, France)결핵균은 일반 박테리아들과 달리 상대적으로 병원성이 강하며, 느린 성장 속도를 나타내며, 전염성이 강하다. 체외 환경에서 배양 시에는 다양한 성분의 영양분이 추가로 필요하다. 구조적으로는 결핵균의 세포벽은 지방질 함유량이 매우 높다 앞서 소개한 차이점들로 인해 결핵 환자에게는 다른 약제를 처방을 해야 한다. 결핵 환자를 진단하는 방법에는 여러 가지 방법들이 있으나, 크게 기반 기술의 유형에 따라 분류하면, 유전자형 (genotype)과 표현형(phenotype)으로 나눌 수 있다. 유전자형 기반 결핵 진단 기술들은 표현형 기반 진단 기술들에 비해 결핵균을 관측할 수 있는 민감도가 떨어지기 때문에 기술적 우수함이 있음에도 불구하고 표현형 기반의 기존 결핵 진단 기술들을 대체하지 못하고 있다고 보고하였다.
연사는 결핵 환자의 예후 향상에는 최소 3개 이상의 항결핵제 감수성 결과가 빠른 시간에 나와야 도움이 되며, 항결핵제 감수성을 확인하기 위해 사용하는 배지에 따라서 같은 균에서도 최소 억제 농도(MIC)가 다를 수 있기 때문에 이러한 요소 또한 유의해야 한다고 하였다. Bedaquiline 약제의 경우에는 항결핵제 감수성 검사 키트에 사용되는 플라스틱이 어떠한 종류인지에 따라서도 결과가 변화할 수 있기 때문에 이러한 점을 주의하면서 항결핵제 감수성 검사를 진행하고 결과를 리포트 해야 한다고 밝혔다.
2. Rapid AST with disk diffusion on direct inoculation from blood culture bottles- Presenter: Gunnar Kahlmeter (Karolinska Institutet, Sweden)현재 대부분의 의료기관에서 균혈증에 감염된 환자로부터 유래된 박테리아의 항균제에 대한 반응을 확인하기 위하여 항균제 감수성 검사(Antimicrobial susceptibility testing, AST)를 진행하고 있다. 그러나 환자에서 유래된 박테리아의 수 혹은 농도가 항균제에 대한 감수성을 판단하기에는 상대적으로 낮기 때문에 감수성 검사 이전에 박테리아의 농도를 증가시키는 과정인 혈액 또는 유래물 배양을 실시하고 있다. 연사는 기술적 발전의 산물인 초고속 항균제 감수성 검사법의 개발로, 항균제 감수성 검사에 소요되는 시간은 이전에 비하여 비약적으로 감소하였으나, 이전 단계인 배양 과정의 시간 단축은 여전히 한계에 부딪혀 정체된 상태라고 밝혔다. 균 동정 과정 또한 질량분석기의 개발로 대표되는 기술적 발전 덕분에 배양 과정 후 2시간 정도에 완료되며, 프로토콜의 최적화에 따라서 더 빨라질 수 있는 가능성이 있다고 언급하였다.
그러나 항균제 감수성 검사에 사용되고 있는 breakpoint table은 흡광도 기반 혹은 이전에 개발된 기술 기준으로 구성되어 때문에 새로이 개발된 초고속 항균제 감수성 검사법인 direct AST로의 적용이 어려운 상황이다. 따라서 The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)에서는 direct AST에 알맞은 균-항균제 조합에 따른 breakpoint table을 마련하는 작업에 있다고 연사는 발표하였다. 이어 direct AST를 임상 현장에서 적용하기 이전에 모든 초고속 항균제 감수성 검사법 사용자는 direct AST에서는 기존 방법과 다른 많은 변수들이 상존한다는 사실을 반드시 인지해야 한다는 메시지를 전달하였다. 현재 EUCAST에서 작업 중에 가장 어려움을 겪고 있는 약제는 PTZ (Piperacillin-Tazobactam)이며, 이에 대한 추가적인 실험을 통해서 올 하반기부터 disk diffusion method에 대응하는 direct AST breakpoint table을 배포할 예정이라고 밝혔다.
3. Susceptibility testing of anaerobic bacteria- Presenter: Ulrik Stenz Justesen (Syddansk Universitet, Denmark)연사는 현재 anaerobic(혐기성) 박테리아의 약제 감수성을 확인 위한 표준 검사법으로 agar dilution 방법을 사용하고 있다고 밝히며, 다른 박테리아의 약제 감수성을 검사하는데 많이 사용하는 Broth microdilution 방법은 시판되는 제품이 있으나, 소수의 제한된 박테리아에 대해서만 사용 가능하며, Gradient strips의 경우에는 특정 약제를 테스트할 시에는 오류가 발생하고, 테스트당 단가가 비싸다는 단점이 있다고 언급하였다. 다른 검사법인 Disk diffusion 방법을 사용할 시에는 EUCAST 기준,
C. difficile 균주를 제외한 나머지 균주에 대해서는 breakpoint 값이 없는 상태라고 밝혔다.
현재 혐기성 박테리아의 약제 감수성 검사 시에 100개 이상의 테스트를 진행할 시에는 agar dilution 방법의 가격 경쟁력이 있으나, 그 보다 적은 수의 테스트를 할 시에는 비용 측면에서는 강점이 없다는 의견을 덧붙이며, 연사는 아직 혐기성 박테리아의 약제 감수성 방법에서는 아래와 같은 기술적, 정량적 요소에 있어서 더 많은 수의 테스트가 필요하며 프로토콜 최적화 과정이 필요하다고 밝혔다.
1) Agar depth
2) From fridge or room temperature (for how long)
3) With plastic or without plastic
4) Homemade or ready to use agar plates
5) FAA powder from different manufacturers
6) Atmosphere
7) Temperature: 35℃ or 37℃
8) Incubation time: 16-20 hours or 24 hours
9) Disk potencies
4. Direct detection of pathogenic bacteria in blood: comparison between magnetic resonance technology, blood culture and multiplex PCR- Presenter: P. M. Rath (University of Duisburg-Essen, Germany)연사는 이전에 발표된 연구결과(K. Reinhart et al, Clin. Microbiol. Rev., 2012, 25, 4, 609)에 따르면 박테리아의 혈액 배양 병에서의 양성 비율과 PCR을 통한 증폭 비율을 비교하였을 시에 그 상관관계가 80% 이상이 나옴을 확인할 수 있었다고 하였다. 현재 많은 기업체에서 혈액 내 존재하는 병원성 박테리아를 조기 발견 후 분리하기 위해서 많은 기술들을 발표하고 있다. 연사는 대표적인 박테리아 검출 키트의 성능 비교를 위해 T2 Biosystems (Lexington, MA, USA)사와 Roche Diagnostics (Basel, Switzerland)사의 제품을 사용 후 성능 비교한 결과를 발표하였다. 우선 Roche사의 LightCycler Septifast의 경우에는 패혈증을 유발하는 대표적인 균을 검출할 수 있으며, methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA)를 유발하는 mecA 유전자형 또한 발견 가능하다. LightCycler Septifast 검출되는 균을 고온에서 용해시킬 때 발생하는 DNA melting curve를 분석해서 6시간 이내에 균의 항균제 감수성 및 존재를 보고할 수 있으며, 장비의 성능 평가 결과가 많이 축적되었다는 장점이 존재한다고 밝혔다. T2 Biosystems사의 T2Dx는 패혈증을 일으키는 주요 균종인 ESKAPE pathogens (
E. coli, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa, E. faecium)을 검사할 수 있으나, 앞서 언급한 Roche사의 LightCycler와는 달리 약제 감수성을 확인할 수 없다는 큰 단점이 있다. T2Dx는 자성 공명 기술 기반으로 박테리아의 존재를 검출하며 이전에 발표된 문헌 및 자료에 따르면, Candida 종에서만 키트 사용이 가능하였으나, 최근에 발표된 문헌을 통해서 다른 종류의 박테리아의 존재까지도 민감도 83.3%, 표적도 97.6%의 수준으로 확인할 수 있다고 밝혔다. (Angelis GD et al, J. Antimicrob. Chemother., 2018, 73, Suppl 4, iv20-26) 연사는 Septifast, T2Dx, 그리고 혈액 배양 양성 비율을 상호 비교하는 실험을 진행하였으며 결과를 아래와 같이 발표하였다.
표 1. T2Dx, Septifast, 혈액 배양 과정에서 양성으로 검출된 수치 비교 결과
표 1에 나온 결과에 따르면 T2Dx는 혈액 배양에 비해 3배 이상의 높은 수치로 박테리아를 검출했으며, Septifast와 비교하였을 때 더 높은 민감도를 보였다고 연사는 밝혔다.
표 2. Septifast와 T2Dx의 혈액 배양과 비교했을 시의 성능 결과 비교
표 2에 나타난 결과를 참고할 때 T2Dx는 혈액 배양 과정에서 검출하지 못하는 균 또한 검출할 수 있을 뿐만 아니라 Septifast와 비교했을 시에도 더 높은 균 검출 결과 수를 나타냈음을 확인할 수 있었다. 위의 결과를 토대로 연사는 T2Dx의 성능이 추후에 더 많은 임상 샘플을 통한 결과가 필요하겠으나, Hands-on time이 Septifast에 비해서 1/6 수준인 5분 밖에 소요되지 않는다는 점과 민감도가 우수하다고 밝혔으나, 좁은 범위의 박테리아 밖에 다루지 못하는 부분에서는 많은 개선이 필요하다고 밝혔다.
5. Keynote Session, Global coordinated action against antibiotic resistance - are we achieving enough?- Presenter: Otto Cars (Uppsala University, Sweden)연사는 전세계적으로 문제로 부각되는 항균제 내성 문제를 해결하기 위해서 각 국가에서 많은 정책을 내세우고 있으나, 문제를 해결하기 위한 정책들은 대부분 너무 느리고, 약하고, 좁은 범위만을 다루고 있는 실정이라고 밝혔다. 1980년대 초에 처음으로 항균제 내성 문제가 제기된 이후부터 항균제 내성을 다루는 문헌의 수는 지속적으로 증가하고 있으나, 항균제 사용에 대한 정책을 다루는 문헌의 수는 그렇지 못한 실정이라고 밝혔다. 연사는 2001년 세계보건기구(WHO)에서 다루기 시작한 이후 14년 뒤인 2015년이 되어서야 WHO에서 Global action plan을 발표하면서 전세계적으로 대응을 하기 시작하였다는 사실을 지적하며, 이러한 대응이 나오기까지 오랜 시간이 걸린 가장 큰 이유는 아래의 잘못된 순환고리로 기인한다고 밝혔다.
그림 1. Failing machinery of antibiotic uses
(70여년 동안 지속되어 온 항균제 사용에서의 실패한 순환구조)
잘못된 순환고리, 70여년 동안 실패한 순환구조란 위에 표시된 그림 1과 같다. 제약회사에서 새로운 항균제가 출시하면 제약회사는 마케팅을 통해서 새로운 항균제에 대한 홍보를 하게 되고 이에 따라서 의료 기관에서의 과소비가 이뤄지게 되며, 종국에는 새로운 항균제에 대한 내성이 발생하게 되는 상황인 것이다. 그렇다면 이러한 악순환을 끝내기 위해서는 어떠한 부분에서 개선이 이뤄져야 하는지 연사는 다음과 같은 그림과 함께 설명을 부연하였다.
그림 2. 항균제 내성 확산 방지에 필요한 3요소에 대한 도식.
연사는 전문가들의 지식 수준 향상뿐만 아니라, 지식의 알맞은 활용이 있어야 하며, 이를 뒷받침하는 외부의 정치적인 개입 및 사회적 인식 확산 없이는 빠르게 퍼지는 항균제 내성 문제를 방지하기 어렵다는 의견을 덧붙였다. 그는 청중을 향하여 불편한 진실이라며 다음과 같이 강한 메시지를 전달하였다.
“항균제 내성은 해결 가능한 차원의 문제가 아니며, 오직 관리될 뿐입니다. 지난 수 십 년 동안 항균제 내성의 진화와 인류의 발명간의 레이스가 펼쳐졌으나, 향후 미래는 박테리아에게 더 유리한 방향으로 기우는 듯 합니다. 개발도상국에서의 효과적인 항균제의 사용에 대한 창구가 부족한 것은 복수의 시스템의 실패라고 판단해야 하며, 우리는 즉각적인 행동에 나서야 합니다. 행동에 나서지 않는 대가는 클 것입니다. 지속가능한 행동만이 이러한 문제 해결에 도움이 될 것 입니다.” 그렇다면 항생제의 연구개발에서의 새로운 모델이란 어떠한 조건을 충족시켜야 하는지에 대해서 그는 다음과 같은 조건들을 내걸었다.
1) 항생제 개발에서의 과학적 난제 해결
2) 새로운 항생제에 대한 연구개발을 촉진할 수 있는 인센티브 제공
3) 항생제의 단가 및 판매량에 따른 투자 비용 회수의 고리 차단
4) 항생제 사용에서의 보건당국의 제어 및 분배
6. Microscopic imaging AST: where are we and where do we go? - Presenter: Herald Seifert (Uniklinik Koln, Germany)연사는 혈액에서 유래된 박테리아를 진단하는 시간을 단축시키는 방안으로 다음과 같이 3가지 요소를 꼽았다.
1) 환자의 검체 이동/준비 시간 단축
2) 새로운 기술을 이용한 분석 시간 단축
3) 박테리아의 약제 감수성
이어서 항균제 감수성 검사의 시간을 단축시키기 위한 시도로 이론적으로 아래의 방법들을 시도해볼 수 있다고 밝혔다.
1) 현재 표준 접종 방법으로 권장하는 샘플 대신 혈액 배양 샘플, 소변, 기관지 폐포 새척액과 같은 환자 유래물로부터 바로 테스트를 진행
2) 박테리아 성장 가속 방법 고안
3) 더 민감도 높은 박테리아 성장 관측법 고안
4) 분자진단기술을 이용한 내성 기작 관찰
그는 이어서 PCR 기반의 항균제 감수성 검사법을 소개하며 짧은 검사 시간 (1~3시간)과 짧은 준비 시간(2~5분)의 장점과 결과를 해석하기 위한 선행적인 표현형-유전자형 상관관계의 선행 지식, 새로운 내성 기작 발생시 관측 어려움, 감수성 확인 불가, 높은 검사당 단가 등의 단점을 언급하였다. 이러한 PCR 기반의 항균제 감수성 검사법에 대척점에 있는 표현형 기반의 초고속 항균제 감수성 검사법의 대표적인 예로, In-situ DNA fragmentation assay, 아가로즈 내 박테리아 군집의 관찰(Quantamatrix dRASTTM), 단일 박테리아 세포의 관찰(Accelerate PhenoTM), 미세유체 칩 내에서의 단일 박테리아 성장 관찰(fASTest)를 들었다.
그 중에서도 많이 알려진 현미경 기반의 세포 추적 시스템 기술군이 아닌, In-situ DNA fragmentation assay는 슬라이드 내 아가로즈 젤 내부에 박테리아를 항균제와 혼합한 상태로 접종한 후에, 세포 용해 완충 용액과 DNA 형광 색소 등의 물질을 넣어서 관찰하는 방법이다. 박테리아가 항균제에 내성이 있을 경우에는 지연된 용해 반응이나 낮은 빈도의 세포 분열이 관찰되는 데 이러한 차이를 통해서 약제 감수성을 판단하며, 대부분의 결과가 2시간 내로 나온다고 알려져 있다고 밝혔다. 그는 위의 현미경을 이용한 이미지 기반의 초고속 항균제 감수성 검사가 이론적으로 환자의 예후에 어떠한 영향을 미치는 지보다 실제 환자와 함께 진행하는 outcome study를 해야 정확하게 그 효과를 확인할 수 있다고 하였다.
7. Shotgun metagenomics and typing of bacterial DNA in 5mL whole blood from patients with suspected bloodstream infection- Presenter: Paula Mölling (Örebro University Hospital, Sweden)연사는 일반적으로 균혈증은 10~40%의 범위 내에서 사망률을 일으킨다고 알려져 있으며, 많은 의료기관에서 많은 수의 혈액 배양을 진행하고 있음에도 불구하고, 오직 10%의 양성률로 균혈증을 유발하는 박테리아를 검출하는 상황임을 전달하였다. 그러나 혈액 배양 과정에서 양성으로 확인되는 수는 실제로 균혈증을 일으키는 박테리아 중에서 일부이기 때문에 민감도 측면에서 혈액 배양은 한계가 있다는 문제점을 지적하였다. 연사는 발표를 통해서 균혈증에 걸린 환자들을 대상으로 shotgun metagenomics의 의료적 효용성을 확인하는 실험 결과를 발표하였다. 박테리아가 포함된 전혈로부터 박테리아를 제외한 다른 세포들을 용해시키고 부유하는 DNA를 제거하는 과정을 통해서 bacterial DNA만 추출하였다고 하였으며, droplet을 이용해 digital PCR 증폭 과정(droplet digital PCR, ddPCR)을 거쳐서 NGS를 이용하여 시퀀싱을 통해서 전혈 내에 있는 박테리아를 분석하였다. 연사는 ddPCR을 통해서 metagenomic 결과를 분석하였을 때, 박테리아가 spiking된 전혈에서 1mL 당 약 5000개 이상의 박테리아가 존재할 시에 박테리아가 내성을 일으키는 region을 정확하게 분석할 수 있었음을 발표하였다. 다만 1mL 당 약 100개가 존재할 시에는 균의 동정은 확인할 수 있으나, 내성 여부까지는 확인할 수 없었다고 보고하였다. 결과를 종합해볼 때, metagenomics 접근법을 이용한 박테리아 분석 시의 limit of detection은 100 bacteria/mL 이며 박테리아의 내성 typing에는 최소 700 bacteria/mL이 필요하다고 밝혔다. 그리고 Staphylococcus aureus의 bacterial DNA가 가장 임상적 유의성이 높게 나왔으며, 혈액 배양 음성인 샘플에서도 이러한 결과가 나왔다고 밝혔다. 현재 많이 사용되고 있는 생물정보학 파이프라인과는 무관하게, 이러한 shotgun metagenomics 접근법은 패혈증 진단에 실질적인 효과가 있는 수준의 임상적 민감도를 달성하지 못하였다고 밝혔으며, 추후에 많은 optimization이 필요하다고 마무리하였다.
Ⅱ. 총평이번 학회는 다양한 종류의 감염증 치료를 위하여 의학자, 생물학자, 공학자들이 한 자리에 모여 기초 학문으로부터 실제 산업으로의 응용까지 넓은 범위의 주제를 다루는 열띤 토론의 장이 되었다. 실제로 이번 학회에서는 감염증 치료 분야에서 심각한 문제로 대두하고 있는 항균제 내성 문제 해결을 위한 연구가 많이 보고되었다. 학술적인 프로그램뿐만 아니라 많은 기업체에서도 전시장에서의 자체 학술 세미나 및 부스 내 홍보를 통하여 의료기관, 연구소, 학교와의 교류에 적극적으로 나섰다. 국내에서도 서울대병원, 씨젠, 퀀타매트릭스와 같은 기관 및 업체에서 전시장 내에서의 부스, 구두 발표와 포스터 발표를 통해서 학회에 활발한 참여를 하였다.
학회 내 위치한 전시장 내 다양한 감염증 진단 기업들 부스 모습.
ECCMID 2018 학회가 열렸던 마드리드 시내에 위치한 알무데나 대성당.