목차
Ⅰ. 주요 발표 내용
A. 3월 12일 주요 내용
• Structure and Mechanisms of Protein Translocases
• Structural Insights into Protein Translocation Mechanisms Using Cryo-Electron Microscopy
B. 3월 13일 주요 내용
• Pore-Forming Activity of the
Pseudomonas aeruginosa Type III Secretion System
Translocon Alters the Host Epigenome
• Structural Studies of the Mitochondrial Sorting and Assembly Machinery Complex
C. 3월 14일 주요 내용
• Tat translocase’s triggering assembly mechanism
• Mechanisms of Tail-Anchored Protein Triage
• Glycosome Biogenesis in an Ancient Eukaryote
• Protein Transport in the Curli or Bacterial Amyloid Assembly Pathway
D. 3월 15일 주요 내용
• Type Three Secretion
• beta-barrel assembly assay
Ⅱ. 총평
매년 이 학회가 열리는 갤버스턴 섬의 호텔. 아름다운 만큼 역사도 깊은 건물이라고 한다.
Ⅰ. 주요 발표 내용
A. 3월 12일 주요내용
Secretion system이나 ER, mitochondria 혹은 chloroplast 등에서 단백질이 막을 통과해 translocate 될 수 있도록 하는 channel protein, 혹은 sorting protein이나 anchor 등에 대해 구조적 연구를 하는 연구자들의 talk이 모인 session이 진행되었다. Size가 크고 막단백질이 대부분이라는 특성상 많은 연구자들이 cryo-EM을 이용해 구조생물학적 연구를 진행하고 있었으며, computational calculation/modelling 연구를 이용해 구조 데이터를 얻기 힘든 dynamics 예측 등을 함께 진행하고 있는 실험실이 많은 것이 눈에 띄었다.
또한, chloroplast/mitochondrial protein transport system이 단백질의 translocation을 성공적으로 수행하기 위해 사용하는 binding partner들이나 그들과의 결합 방식, 혹은 translocation regulation을 위해 사용하는 기작들에 대한 session이 진행되었다. 특히 translocation에 관여하는 다른 binding partner를 찾기 위해 knockout mutant를 만들고 genetic screening을 수행해 suppressor들을 찾거나, 이미 알고 있는 단백질의 paralog를 찾아내 target으로 삼고 이용하는 등 전통적인 biochemical study를 위한 target을 찾아내는 데 screening이나 bioinformatics를 이용하는 모습들이 많이 보였다.
• Structure of the Core of the Type Three Secretion System Export Apparatus
Type 3 secretion system은 살모넬라와 같은 pathogenic bacteria들이 host cell에 pathogenic protein을 secretion하기 위해 사용하는 시스템이다. 이 시스템은 inner membrane, outer membrane을 관통하는 ring 부분과 ring 바깥쪽의 needle 부분이 export apparatus를 이루고 있다. Oxford의 Susan lea 그룹에서는 최근 이 T3SS export apparatus의 구조를 cryo-EM을 통하여 규명해냈다.
T3SS Export apparatus의 ring 부분은 6 copy로 이루어져 있으며, 해당 apparatus는 다른 organism에서 발현시켜 정제하는 데에 어려움이 있었다. 이에 각 component들을 overexpression시켜 정제해내는 일반적인 방법 대신 해당 apparatus가 포함된 native operon 전체를 발현시키고, 이를 정제해서 실험에 이용하였다.
이렇게 발현된 단백질 complex의 경우 정제된 complex에 포함된 component 들이나 stoichiometry를 확실하게 알 수 없기 때문에 native MS를 이용하여 정제된 complex들의 composition을 확인하고 homogeneous한 상태의 complex만 정제해내 실험에 이용하였다. 그 결과 Cryo-EM으로 ~4.2 Å resolution의 구조를 얻어내었다.
해당 구조에서 특이한 점은, needle의 아래쪽에 위치하는 부분이 마치 proteasome처럼 opening/closing이 가능한 게이트로 기능할 수 있을 것 같다는 사실이다. 이 부분의 개폐에 따라 effector secretion이 조절될 수 있을 것으로 보이나, 이 게이트를 작동시키는 driven force가 무엇인지에 대해서는 아직 알고 있는 바가 없다.
• Structural Insights into Protein Translocation Mechanisms Using Cryo-Electron Microscopy
Ludwig Maximilian University of Munich의 Roland Beckmann group에서 발표된 내용으로, cryo-EM을 이용해 얻은 구조로 membrane protein translation and translocation mechanism에 대한 단서를 얻으려 한 연구였다.
단백질 translation에는 Ribosome과 다른 여러 component들이 함께 관여한다. 특히 membrane protein의 경우 translate된 nascent polypeptide가 바로 membrane에 insertion될 수 있도록 SecYEG, signal anchor domain을 포함하는 FtsQ와 같은 단백질들이 ribosome과 interaction해 protein translocation을 돕는다.
따라서 이 component들을 E.coli에서 발현시킨 후 함께 정제하여 complex를 만들고, cryo-EM 데이터로 ~4 Å 정도까지의 구조를 얻어내었다. 특히 이번 데이터에서는 보다 향상된 데이터 퀄리티 덕분에 지금까지 보이지 않았던 추가 electron density를 확인할 수 있었고, 이 electron density가 무엇을 의미하는지 밝히기 위해 추가 실험을 진행할 예정이다.
* GRC Power Hour
여성 연구자들을 독려하기 위해 GRC에서 특별히 마련하는 informal 세션으로, 연구자로서 여성이 겪는 어려움이나 극복해야 할 한계 등에 대해 이야기를 나누고 함께 멘토링하는 시간을 가졌다. 학회 참가자들이 다같이 모여 성별이나 위치에 관계없이 본인들의 이야기를 나누고, 서로 미처 인지하지 못했던 어려움이나 잘못된 관행 등에 대해 편견 없이 자유롭게 이야기를 나누는 자리였다. 어린 세대의 여성 연구자들에게 보다 자신감을 가지고 PR을 더 많이 해야 한다, 남성 연구자들보다 전반적으로 무언가를 요구하는 경향이 낮기 때문에 본인 기준으로 도가 지나치다고 생각될 정도로 적극적으로 행동하고 원하는 것을 요구해도 괜찮다, 그럼에도 불구하고 연구자는 시간을 자유롭게 쓸 수 있기 때문에 일과 삶을 병행하기에 나쁘지 않은 직업이다 등의 조언이 PI들에게서 나왔다.
B. 3월 13일 주요 내용
Membrane protein들이 membrane에 insertion 되는 과정을 구조적, 혹은 molecular dynamics를 계산한 연구들이 주로 발표된 session이었다. BAM, SAM과 같은 mitochondrial protein들이 주를 이루었으며, pathogenic secretion system의 translocon에 대한 연구도 발표되었다. 또한, 이 transport machinery들의 밝혀진 구조들이나 sequence 등의 align을 통해 다른 species들의 machinery들을 비교분석하고 이들 사이의 origin이나 분기점을 보여주거나, 이 machinery들과 함께 일하는 binding partner들을 밝혀내거나 서로 다른 OMP를 membrane으로 insert하기 위해 어떤 차이점들이 존재하는지/어떤 다른 binding partner들이 함께 일하는지에 대한 연구들이 발표되었다.
• Pore-Forming Activity of the Pseudomonas aeruginosa Type III Secretion System Translocon Alters the Host Epigenome
P. aeruginosa의 ExoU, ExoT, ExoX와 같은 effector (secretion system에서 host로 secretion되는 protein)들은 PopB-PopD 단백질로 이루어진 translocon을 통해 분비된다. Imperial College London의 Alain Filloux group에서는 이때 PopB-PopD translocon이 host cell의 H3 Ser10에 dephosphorylation을 일으킬 수 있다는 것을 확인하였고, host cell membrane에 pore를 형성하는 것이 이 dephosphorylation에 필수적임을 확인하였다. 이 pore-forming은 부분적으로는 이 translocon을 통해 나갈 수 있는, 콜레스테롤에 dependent한 effector들 때문에 만들어지는데, 이렇게 만들어진 pore가 K+ 유출을 유도하여 host cell이 이온 농도의 변화를 감지하게 하고, 결과적으로 Ser10 dephosphorylation이라는 후생유전학적 변화를 일으키게 한다. 이 K+ 이온 농도가 dephosphorylation에 필수적이라는 사실은 host cell에 K+ 이온을 공급해서 농도 변화를 막았을 때에는 dephosphorylation이 일어나지 않았다는 것으로 증명할 수 있었다.
이들은 PopB-PopD translocon의 이미징 실험도 진행해 bacteria가 host cell과 맞닿을 때 translocon이 membrane 쪽으로 recruit되고, host cell의 membrane에 안정적으로 박혀 있으면서 K+ 이온의 유출을 유도한다는 사실을 밝혀내었다.
• Structural Studies of the Mitochondrial Sorting and Assembly Machinery Complex
NIH buchannan group의 postbac Kathryn Diederichs가 발표한 내용이다. SAM50 (sorting assembly machinery 50kDa subunit)은 미토콘드리아 outer membrane에서 다른 component와 함께 assemble되고, 단백질 sorting에 중요한 역할을 한다. 이 SAM50의 crystal structure를 풀어 SAM-Omp의 intermediate 구조를 보고자 하였고, 단백질을 S. cerevisiae에서 expression해 x-ray crystal work을 진행하였다. SAM50이 b-sheet들로 이루어진 membrane b-barrel이기 때문에, 단백질 정제 시 membrane 부분을 안정화시키기 위해 detergent를 써 optimize된 상태의 단백질을 정제하였다.
학회 Info 부스. 이 곳에서 매일의 일정을 확인할 수 있고 다른 참가자들과 coffee break를 갖기도 한다.
학회 policy 상 학회장 내부나 포스터 세션장에서의 촬영 및 녹음은 엄격하게 금지되어 있다.
C. 3월 14일 주요내용
Protein transport가 일어날 때 필요한 membrane transport mechinery와 binding partner, 혹은 substrate 간의 관계에 대한 연구가 주로 발표된 session이었다. 이번 세션에서는 특히 membrane에 insertion이 되어야 하는 단백질이나, 이미 membrane protein인 단백질과 interaction해야 할 binding partner/substrate to be secreted 간의 interaction을 연구하고, 각 component들이 기능에 어떤 영향을 미치는지에 대한 주제들이 발표되었다.
또한, health and disease 관점에서 본 protein transport에 대해서도 발표가 이뤄졌는데, pathogenic protein을 직접 host cell에 secrete 해 질병을 매개하는 secretion system들보다 오히려 amyloid나 glycosome biogenesis 등 cell들이 물질 생성을 매개하기 위해 이용하는 translocation system, 혹은 host cell endocytic pathway의 조절에 영향을 미치는 membrane protein(주로 transporter)들에 대한 연구가 발표되었다.
• Tat translocase’s triggering assembly mechanism
University of Dundee의 Tracy Palmer 교수의 발표 내용으로, bioinformatics와 생화학적 실험적 기법을 함께 이용해 진행된 프로젝트이다.
식물 chloroplast의 thylakoid membrane과 bacterial cytoplasmic membrane을 통해 단백질translocation이 일어나기 위해서는 Tat translocase가 필요하다. Tat translocase는 여러 종류의 Tat 단백질들로 구성되는데, 대표적인 것들이 TatA, TatB, TatC 등이다. 이 단백질들은 단독으로는 구조가 풀려 있지만 complex로는 구조가 아직 나와있지 않다. 발표 그룹은 sequence coevolution analysis를 통해 Tat family protein들과 TatC가 어느 부분에서 interaction 하는지를 예측하고, 이 binding site를 molecular simulation과 in vivo crosslinking 등을 통해 확인하였다. 그 결과 TatA는 receptor complex에, TatB와 TatC는 substrate에 붙는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 이들의 역할을 in vivo로 확인하기 위해 TatB를 mutation 시켜 발현시킨 결과, membrane에 leakage가 생기지 않는다는 것 역시 확인할 수 있었는데, 이는 pore가 형성되지 않았기 때문이며, 따라서 단백질 translocation이 제대로 일어나지 않을 것으로 보인다.
• Mechanisms of Tail-Anchored Protein Triage
현재 Harvard medical school에 있는 Sichen Shao 그룹에서 발표된 내용이다. Translation termination은 단순히 ribosome뿐만 아니라 단백질, RNA 등을 포함한 여러 binding partner가 함께 작용하는 과정으로, Translation이 종결되는 과정을 보다 정확하게 알기 위해서는 ribosome, tRNA, eRF, stop codon과 같은 translation termination complex 전체에 대한 연구가 필요하다. 60s ribosome의 E, P, A-site에 각각 tRNA나 protein binding partner를 occupy시키고, stop codon을 함께 붙인 termination complex를 만들어 내 cryo-EM 구조를 얻어내었다. 이때 특기할 만한 점은, 여러 component들이 함께 complex를 이루는데 EM imaging을 하였을 때 모든 component가 함께 있는 complex보다는 binding partner 일부만을 포함하는 ribosome complex의 비율이 꽤 높았으며 imaging 결과로 본 complex variation이 꽤 여러 종류가 있었다는 사실이다. 따라서 이들을 우선 포함하고 있는 component에 따라 variation 별로 나누고, 3D classification을 통해 각 variation 별 3D 이미지를 얻은 후, 이들 중 원하는 조합의 complex imaging을 refine해 최종 complex의 구조를 얻어낼 수 있었다는 사실이다. Shao 박사는 해당 결과에 대해서는 아마도 이들이 정제 이후 imaging 준비 과정에서 서로 떨어져 나가거나 하면서 여러 종류의 form이 생겨난 게 아닐까라고 informal하게 comment했다.
• Glycosome Biogenesis in an Ancient Eukaryote
Ancient eukaryote들에서 glycolysis를 보다 효율적이게 진행해 대사적 이점을 얻기 위해 cell compartment가 일어나는데, 이 과정을 잘 보여주는 organism 중 하나로 trypanosoma를 들었다. Trypanosoma가 갖고 있는 TbPex13 단백질은 glucose 농도에 따라 그 위치가 바뀌는 단백질로, glucose 농도가 높을 때에는 glycosome에 localization되나, glucose 농도가 낮을 때에는 ER에서 발견된다. 또한, 이 단백질의 일부 domain은 ER localization에 필수적인데, 이 domain이 없어질 시에는 glucose 농도가 낮더라도 ER에 localization이 되지 못하는 것을 관찰하였다.
• Protein Transport in the Curli or Bacterial Amyloid Assembly Pathway
Vrije Universiteit의 Han Remaut 그룹에서 발표된 내용으로, Gram-negative bacteria의 biofilm 형성 기작에 관한 연구였다. 박테리아가 형성하는 ECM 중 특별히 amyloid fiber assembly를 curli 라고 일컫는데, 이 curli가 toxic한 aggregation을 만들지 않고 박테리아를 보호할 수 있는 외피막 기능을 잘 수행할 수 있게 되려면 oligomerization이 심하게 일어나면 안되고 적당한 타이밍에 적절한 nucleation만 이뤄져야 한다. 이 과정을 박테리아는 type 8 secretion system을 이용해서 수행하는데,
E. coli의 경우 assembly apparatus로 기능하는 curli-specific gene (csg)들이 두 개의 오페론에 나뉘어 있다. Secretion channel로 기능하는 CsgG는 nonameric 구조로, 발표하는 랩은 아니지만 다른 랩에서 최근 크리스탈 구조가 풀렸다고 한다. 또한 CsgA가 Amyloid assemble/degradation에 영향을 많이 미치는데, CsgG channel을 통해 외부로 secretion될 것이라고 한다. 그 외 다른 Csg 단백질들의 역할과 구조적 연구를 계속 진행하고 있다.
D. 3월 15일 주요내용
주로 single molecule imaging을 이용해 molecule의 움직임이나 cell 안에서 단백질들이 어디에 localization되고 어떤 binding partner와 interaction 하는지를 관찰한 연구들이 많이 발표되었다. 또한, 기존에 있는 연구 방식이나 tool들을 개선시키거나 resolution을 현저히 증가시켜 보다 나은 질의 이미징 결과를 얻어낸 데이터들이 눈에 띄었다.
많은 수의 단백질들을 screening해 해당 단백질이 translocation되는 substrate인지 아닌지를 밝혀내고 이를 실험에 이용하거나, 대량의 데이터를 modelling/molecular dynamics calculation 등을 이용해 어떤 단백질이 가설에 부합하는지, 어떤 메커니즘이 제일 가설에 부합하는지 등을 밝혀내려는 연구 접근 방식 또한 활발히 진행되고 있었으며, 해당 랩에서 screening과 메인 실험을 둘 다 wet 방식으로 진행하며 병행하기도 하지만 dry 실험과 wet 실험을 맡을 코웍 파트너들을 찾아 여러 랩들이 함께 팀으로 움직여 프로젝트를 장기적으로 진행하는 모습도 보였다.
• Type Three Secretion
NUS의 Linda Kenney 그룹에서 발표된 salmonella imaging 실험으로, single living cell에서 pH가 변화할 때 이들이 받는 osmotic stress에 따른 변화를 관찰하였다. Salmonella cytoplasm의 단백질이 osmotic stress로 인한 pH 변화 때문에 sidechain의 방향이 바뀌면서 transition이 일어나면, 이 transition을 EnvZ 단백질이 감지하게 된다. OmpR 단백질은 cytoplasmic pH acidification을 유도하며, 낮아진 pH가 다시 높아지지 않도록 다른 종류의 lysine decarboxylase들을 억제한다. 특히, 이렇게 acidification이 일어나면 translocon을 통해 특정 effector들이 secretion되거나 membrane으로 colocalization되는 것을 관잘할 수도 있었다. 이를 확인하기 위해 OmpR 단백질이 있는 strain과 없는 strain에서 각각 expression analysis, transcriptome 비교, single molecule imaging 등을 수행하였다. 이러한 종류의 osmosis에 의한 acidification은 acid stress와는 다른 변화를 야기한다고 한다.
특기할 점은, NUS에 bioimaging을 위한 센터가 있으며 다른 그룹들의 research에 이 imaging technique이 잘 활용될 수 있도록 매우 활성화되어 있다고 한다.
• beta-barrel assembly assay
미야자키 대학의 Takuya Shiota 교수가 발표한 새로운 방식의 beta-barrel assembly assay는 assay 방식 개발에 약간의 비애(?)가 숨어 있었다. 기존의 방식대로 assay를 하려면 high-speed centrifuge가 필요한데, 신임 교수로 랩에 막 부임했기에 랩에 centrifuge를 살 예산도 부족하고, centrifuge가 있다 해도 놓을 자리도 부족했던 것. 그래서 high speed centrifuge를 이용하지 않고도 beta-barrel assay를 진행하기 위해 방법을 강구했고, 그 결과 OmpC가 EMM에 insert 되도록 stimulate하는 방법을 찾아내고 이 방법을 이용해 beta barrel assembly analysis 및 BAM 관련 실험을 진행할 수 있었다.
Ⅱ. 총평
본 학회는 Gordon conference 중 protein transport across cell membrane 라는 주제의 annual meeting으로, 해당 주제를 연구하는 사람들이 모여 심도 있는 발표를 진행하고, 서로 간에 열띤 discussion과 poster session을 통해 지식의 전달과 서로간의 주제 공유 및 networking을 진행할 수 있는 자리였다. 학회 발표 내용 및 포스터는 secretion through mitochondrial membrane/chloroplast membrane/ER membrane이 주를 이루고 있었으나, pathogen protein secretion에 대해 연구하는 사람들의 참여도도 점점 늘어나고 있다고 한다. 또한, 생화학적 실험뿐만이 아니라 computational, structural tool 등 이용하는 툴의 종류가 점점 다양해지고 서로 다른 실험적 방법을 이용하는 사람들끼리의 협업이 활발하게 진행되고 있는 것이 눈에 띄었으며, 학회에 모인 사람들 역시 자신의 연구에 이용할 수 있는 다른 툴에 대해 관심을 갖고 알아보려 하는 것이 눈에 띄었다.
소규모라는 학회의 특성상 참가자들 간의 네트워킹 역시 매우 활발하게 진행되었다. 학회에 참여한 사람들은 학회 기간 동안 다양한 talk을 함께 듣고 포스터 세션이나 식사 시간, 네트워킹을 위해 학회에서 지원하는 free pub out 시간 등을 이용해 본인들의 과학적 관심사에 대해 열띤 토론을 벌였고 서로에게 조언을 주며 새로운 네트워크를 형성할 수 있었고, 저명한 PI들이 학생이나 Post-doc들과 함께 학술토론과 네트워킹에 참여하며 미래 세대들을 독려하는 모습을 볼 수 있었다.
학회장 바로 앞에 있던 바닷가. 이곳에서 참가자들과 함께 머리를 식히기도 하고 산책하며 discussion을 하기도 했다.