목차
1. 서론
2. 융합단백질 합성 기술
2.1 유전자 설계
2.1.1 융합단백질의 방향성(AB or BA)
2.1.2 Linker engineering (AB, A-B, or A-----B)
2.1.3 두 단백질의 연결비율(AB, ABB, or ABB∙∙∙B)
2.2 유전자 클로닝
2.3 융합단백질 발현
2.3.1 Bacillus brevis 발현계
2.3.2 효모 발현계
2.3.3 누에 발현계
2.3.4 포유류 배양 세포 발현계
2.4 정제
3. 융합단백질을 이용한 연구 동향
3.1 GST 융합단백질
3.2 SUMO 융합단백질
3.3 MBP 융합단백질
4. 결론
5. 참고문헌
1. 서론
융합단백질은 A 단백질의 유전자와 B 단백질(또는 동일 A 단백질)의 유전자를 클로닝을 통해 연결한 후, 대장균 등을 이용하여 발현시키는 재조합 단백질을 칭한다.
융합단백질을 만들어서 얻을 수 있는 가장 큰 이점은 A 단백질에 B 단백질을 연결함으로써 그 기능에 시너지 효과를 기대할 수 있다는 점이다. 예를 들어, 1) A 단백질을 인식하는 항체가 존재하지 않지만 B 단백질을 인식하는 항체가 존재할 경우, B 단백질을 인식하는 항체를 사용한 western blot 등으로 A 단백질의 발현 정도를 확인할 수 있다. 2) B 단백질의 성질을 이용하여 단백질 정제를 용이하게 할 수 있다. B 단백질이 결합하는 비드가 충진된 컬럼을 이용한 정제가 대표적인 예이다. 3) A 단백질이 세포에 결합하고 B 단백질이 형광을 띄는 경우, 융합단백질 AB를 이용한 flow cytometry 실험이 가능하다.
Linker engineering for generating a fusion protein
또한
in vivo 관점에서의 구체적인 예로, 암세포를 인식하는 항체(A 단백질)에 약물(B 단백질)를 연결한 융합단백질을 암세포에 투여함으로써 약물을 암세포 근처로 운반할 수 있어, 약물자체만을 투여했을 때 보다 암세포 타겟 확율을 높임으로써 궁극적으로 치료효과를 높일 수 있다. 단, 이와 같은 경우에 주의를 기울여야 할 점은, 고도로 밀집되어 있는 암세포 사이로 융합단백질이 침투되기 쉽게 하기 위해서는 융합단백질의 크기가 매우 커서도 안되며, 반대로 너무 작으면 너무 쉽게 투과되기 때문에 크기의 balancing을 고려하여 융합단백질을 디자인하는 기술이 필요하다. 본 리포트에서는 융합단백질을 합성하기 위하여 이용되고 있는 기술 및 연구를 소개한다.
2. 융합단백질 합성 기술
2.1 유전자 설계
2.1.1 융합단백질의 방향성(AB or BA)
A 단백질의 N-말단에 B 단백질을 연결할 것인가, A 단백질의 C-말단에 B 단백질을 연결할 것인가. 단백질의 범주에 포함되는 항체를 예로 들어보자. Y자 모양을 하고 있는 자연항체의 구조를 쉽게 표현하자면 Y자의 양쪽 팔에 해당하는 부분이 Fab라 불리는 영역인데, 항원은 이 Fab의 끝부분(Y자의 가장 윗끝부분, 양쪽 손에 해당하는 부분), 즉 전체항체의 N-말단에 결합한다. 그리고 몸통부분(지면으로부터 90도로 세워져 있는 부분)이 Fc라 불리는 영역이다. 즉 Fc는 전체 항체의 C-말단에 위치하는 부분이다.
최근 면역반응과 관련이 있는 약 15 kDa 크기의 사이토카인을 항체에 연결시켜 작성한 항체-사이토카인 융합단백질을 면역치료제로 사용하는 연구가 이루어지고 있다. 이 경우 사이토카인을 항체의 N-말단에 결합시키면 항원결합부위 근처에 사이토카인이 존재하게 되므로 항체의 항원결합력이 저하되지만 selectivity는 증가하며, 반대로 사이토카인을 항체의 C-말단에 결합시키면 항체의 half-life에 관련 있는 Fc 근처에 사이토카인이 존재하게 되고 항체의 half-life가 증가된다는 연구결과가 보고되었다.
방향성에 관련한 다른 하나의 예로, A 단백질의 C-말단에 기능성 태그(정제에 필요한 His-tag 등)이 존재할 경우, B 단백질을 A 단백질의 C-말단에 연결을 시키면 태그의 기능을 방해할 가능성이 있으므로 N-말단에 연결하는 편이 낫다. 하지만 A 단백질이 항체일 경우 위에서 기술한 바와 같이 항체의 N-말단에 항원결합부위가 존재하므로 C-말단의 태그의 기능성을 유지하고자 N-말단에 연결을 하면 이번에는 항원결합기능을 방해할 가능성이 생긴다. 이와 같은 경우에는 양쪽을 각각 작성하여 정제 효과와 항원결합능 유지의 두 가지 factors를 비교하는 것이 바람직하겠다. 하나의 아이디어를 덧붙이자면, A 단백질의 C-말단에 존재하는 태그를 떼어낸 후 그 자리에 B 단백질을 연결하고 B 단백질의 C-말단에 태그를 연결시킨다면 정제 효과와 항원결합능 유지의 양쪽 모두를 취할 수 있을 것이다.
2.1.2 Linker engineering (AB, A-B, or A-----B)
A 단백질의 유전자와 B 단백질의 유전자를 클로닝을 통하여 연결할 경우에, 그 두 가지 단백질을 잇는 수 염기의 유전자(링커)를 삽입할 필요가 있다. 대표적으로 사용되는 링커 배열은 유연성을 지니는 (GGGS)n이고, 경우에 따라서는 보다 단단한 구조를 갖는 (DDAKK)n가 사용되기도 한다. 상기한 n은 각 배열이 반복되는 숫자를 나타내며, 이를 최적화함으로써 두 단백질 사이의 적당한 거리를 정할 수 있다.
링커의 최적화가 반응성에 중요한 영향을 미치는 대표적인 예로 색을 띄는 단백질 사이의 FRET 반응을 들 수 있겠다. 여기서 말하는 ‘색을 띄는 단백질’은 GFP와 같은 빛을 발하는 단백질(発光)이 될 수 있고, 두 가지 단백질 각각에 형광색소를 부착하여 형광을 띄게 한 단백질(蛍光) 사이의 반응 양쪽 모두가 해당되겠다. 두 단백질 사이의 에너지 이동이 반응 정도를 결정짓기 때문에 에너지 이동의 최적화는 곧 단백질 사이의 거리를 통하여 이루어지고, 이때 링커가 너무 길 경우 링커의 엉킴이 일어날 수가 있으며, 반대로 너무 짧으면 에너지가 도달하기 어렵기 때문이다.
입체구조가 알려져 있는 단백질이라면 그 구조를 바탕으로 한 계산에 의해 링커를 디자인하는 것이 가능하지만, 그렇지 않은 경우 실험적 시행착오에 의한 링커의 최적화가 요구된다.
2.1.3 두 단백질의 연결비율(AB, ABB, or ABB∙∙∙B)
A 단백질을 기준으로 연결되는 B 단백질의 갯수에 의해 dimer, trimer, tetramer, pentamer∙∙∙로 통칭할 수 있다. 대표적으로 하나의 분자의 streptavidin (A 단백질)에 결합할 수 있는 biotin은 4개이기 때문에, B 단백질을 biotin화한 후 이를 1:4 비율로 A 단백질에 비공유결합으로 연결시킨 tetramer 융합단백질을 작성할 수 있다.
연결하는 B 단백질의 갯수를 증가시킴으로써 그에 해당하는 만큼의(반드시 비례하지는 않지만) B 단백질의 성능을 얻을 수 있는 장점이 있다. 쉽게 예를 들자면, 형광단백질을 단백질 B로 사용할 경우에 monomer보다는 tetramer을 사용할 경우 약 4배의 형광강도를 얻을 수 있다.
하지만 단백질을 융합하여 발현시킬 때 너무 많은 단백질을 연결시킬 경우 단백질이 올바른 입체구조를 형성하는데 영향을 끼칠 수 있다. 그러므로 입체구조를 고려하여 연결비율을 결정할 필요가 있다.
2.2 유전자 클로닝
다음 단계는, 상기한 디자인을 바탕으로 유전자 클로닝을 통하여 실제로 두 단백질의 유전자 배열을 연결하는 것이다. 이를 위한 기본적인 방법은 PCR이고, 여러 가지 PCR 방법 중에서 효율적인 결과를 얻을 수 있고, 가능하면 실험 과정이 간단한 PCR 방법을 선택하는 것이 필요하다.
최근 들어, Intergrated DNA Technologies (IDT)社를 포함한 유전자합성회사에서 유전자 배열을 한번에 합성하는 방법이 상용화되고 있기 때문에 이를 통하여 처음부터 연결되어 있는 두 단백질의 아미노산 배열을 손쉽게 얻을 수도 있다. 이렇게 얻어진 insert를 적절한 발현용 vector에 삽입한다.
2.3 융합단백질 발현
단백질을 발현하기 위해 사용되는 대표적인 방법으로, 무세포 전사 번역계를 사용하는 방법과 대장균을 이용하는 방법이 있다. 전자의 방법을 사용할 경우 하루 만에 단백질을 얻을 수 있다는 장점이 있으나, 현재까지 반응에 필요한 시약이 고가이기 때문에 많은 양의 단백질이 필요할 경우에는 사용이 부담된다. 후자의 대장균을 이용함으로써 무세포 전사 번역계를 이용할 때보다 다소 시간은 소요되지만(2-3일) 저가로 많은 양의 단백질을 얻을 수 있기 때문에 일반적으로 사용되고 있다.
발현 시 주의를 기울여야 할 점은 단백질이 활성을 갖고 있어야 한다는 점이다. 특히 단일단백질 각각을 발현시켰을 때 활성을 가진 가용성 단백질을 대량으로 얻을 수 있었다고 해서 반드시 융합단백질도 그러할 것이라고 생각해서는 안된다. 앞에서 기술한 바와 같이, 융합단백질의 링커가 제대로 기능하지 않는다면 두 단백질이 엉킬 수 있다는 등의 문제점을 고려해야 한다. Folding을 이루면서 가용성 성분으로 발현이 되었는가를 염두에 두어야 하고, 만약 불용성 성분으로 발현된 경우, GdnHCl을 사용하여 가용성 성분으로 구조를 되돌릴 수 있다.
그 밖의 단백질 발현계로는 유산균과 같은 원핵생물, 효모와 같은 진핵미생물, 곤충 세포 및 포유류 세포와 같은 동물배양세포, 식물유래의 배양 세포 등이 있다. 대표적인 단백질 발현계의 특징은 다음과 같다.
2.3.1 Bacillus brevis 발현계
원핵생물을 이용한 단백질 발현계로서 Bacillus brevis, Lactococcus lactis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum 등이 알려져 있다. 그 중에서도 Bacillus brevis를 이용한 분비생산계는 1980년대에 개발된 이래로 1996년에는 Epidermal growth factor (EGF)를 대량생산하는 것에 성공하여 1.5g/L이나 되는 단백질을 분비 생산하였다.
그 이후 Bacillus brevis는 Brevibacillus로 재분류되어 2006년에는 Brevibacillus choshinensis를 이용한 단백질발현계가 키트화, 제품화 되었다. 2013년에는 유전자 클로닝할 때, 단백질의 유전자 단편과 플라스미드벡터의 연결이 불필요한 Brevibacillus in vivo cloning (BIC)법을 이용한 시약키트가 제품화되어, 보다 손에 다루기 쉬워졌다. 원핵생물이기때문에 당쇄수식이 없다라는 것이 단점이지만, 분비생산에 의해 대량의 단백질을 얻을 수 있으며 대장균을 이용한 단백질발현과 동일한 설비를 이용 가능하다는 이점이 있다.
2.3.2 효모 발현계
효모의 단백질 발현계는, 진핵생물이면서 소포체와 골지체와 같은 세포소기관을 갖추고 있어 단백질발현을 위한 quality control 기관이 존재하므로 refolding이 어려운 단백질을 높은 성공률로 분비 생산 가능하다.
하지만 단백질의 발현양이 적다는 단점이 있고, 목적단백질의 N말단에 여분의 아미노산이 추가되어버리는 경우가 있어, 분비된 단백질의 분자배열이 불균일한 경우가 있다. 또한 배양을 하기 위해 pH meter와 용존산소 전극을 갖춘 배양기를 필요로 한다.
2.3.3 누에 발현계
누에를 이용한 단백질 발현계는, 고치를 만든다는 누에의 특성을 이용하여 견사선으로부터 분비된 견사와 함께 단백질을 발현하는 것에 의해 고치로부터 단백질을 추출하는 것이 가능하다. 그러나 누에의 지놈을 개량해야 한다는 점, 필요한 단백질의 양을 얻기 위해 다량의 누에가 필요로 된다는 점이 단점이다.
2.3.4 포유류 배양 세포 발현계
사람 유래의 단백질을 생산하는 계로서, 사람배양세포를 이용한 생산계가 이용된다. 일반적으로 사람배양세포를 이용한 단백질생산은 값이 비싸기 때문에 실용면에 있어서는 바이오 치료약 등의 부가가치가 높은 단백질로 한정이 된다.
2.4 정제
단백질을 정제하는 대표적인 방법으로 단백질의 말단에 태그를 붙여서 그 태그가 특이적으로 결합하는 비드로 구성된 컬럼을 사용하는 방법이 있다. 예를 들어, 아미노산 Histidine이 6개 연속으로 이루어진 His6 태그를 단백질의 말단에 연결하고, His6 태그를 인식하는 비드가 충진되어 있는 컬럼을 사용하여 단백질만을 비드에 결합시킨 후, His와 비슷한 구조를 갖는 imidazole이 고농도로 첨가된 버퍼를 사용하여 경쟁적 방법으로 단백질을 비드로부터 떨어트린 후 거둬들이는 방법이 있다.
이외에도 아미노산 DYKDDDDK가 연속적으로 이루어진 FLAG 태그를 단백질의 말단에 연결하고, 이 FLAG 태그를 인식하는 항체가 표면에 부착된 비드가 충진되어 있는 컬럼을 사용하여 단백질을 비드에 고정시킨 후, DYKDDDDK 펩타이드(FLAG 태그가 부착된 단백질보다 항DYKDDDDK 항체에의 결합성이 뛰어남)를 이용하여 경쟁적으로 단백질을 떨어뜨려서 거둬들이는 방법이 있다.
3. 융합단백질을 이용한 연구 동향
3.1 GST 융합단백질
Glutathion-S-transfectase (GST)는 단백질의 발현 및 정제할 때 융합단백질 태그로 사용된다. GST는 Glutathione에 특이적으로 결합하고 이 상호작용은 강도와 선택성이 강하기 때문에 Glutathion을 부착한 비드를 이용하여 GST 융합단백질을 효율적으로 정제하는 것이 가능하다.
GST를 이용한 실험에서 주의해야 할 점은, GST는 분자량이 큰 단백질(35 kDa)이기 때문에 상기한 His6 태그 및 FLAG 태그와 같이 짧은 펩타이드로 구성되어 있는 에피토프태그와는 달리 protease로 인해 분해될 가능성이 높다. 따라서 분해되지 않도록 하기 위해 저온에서 신속히 GST 융합단백질을 정제하는 것이 필요하다. 또한 GST는 변성되면 Glutathion 비드에의 결합 활성을 잃기 때문에, 정제용 버퍼에 GdnHCl이나 요소와 같은 강력한 변성제는 사용하지 말아야 한다.
3.2 SUMO 융합단백질
단백질의 용해도를 향상시키는 방법으로, 용해성이 높은 단백질을 목적단백질의 말단에 연결시키는 방법이 있다. 분자량이 적은 태그단백질로 Solubility enhancement (SET, 4.5 kDa) 및 GB1 domain(6.3 kDa)을 예로 들 수 있다. 특히 최근에 개발된 Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO, 11 kDa)은 다른 융합태그보다 목적 단백질의 용해성 및 발현량뿐만 아니라 태그의 절단효율에도 높은 성능을 나타냄이 보고되었다. 하지만, 연결하는 태그단백질의 크기는 수 kDa으로 펩타이드 태그에 비해서 크기때문에, 대부분의 경우, 정제 중에 태그를 절단하는 것이 필요하거나 태그단백질이 목적단백질과 상호작용을 하여 구조 및 기능에 영향을 끼치는 문제점이 일어날 수 있다.
3.3 MBP 융합단백질
MBP는 maltose binding protein의 약자로, MBP 융합단백질은 MBP와 maltose 사이의 친화성을 이용한 단백질 정제 방법이다.
MBP 자체의 크기는 약 42.5 kDa으로 비교적 크기가 큰 단백질이고, 가용성으로 발현하는 특징을 갖고 있다. 상기한 SUMO와 마찬가지로, 목적단백질의 말단에 MBP를 융합발현시킴으로써, 융합단백질이 발현되었을 경우에 단백질 전체가 가용성으로 발현되기 쉽다.
정제조건은 중성 pH(약 7.4pH 전후)에서 융합단백질이 선택적으로 컬럼에 결합되도록 한 후에, maltose와의 경쟁적 용출로 거두어들이는 온화한 조건에서 정제가 가능하다.
MBP의 분자량이 42.5 kDa로 비교적 크기 때문에, 단백질의 기능 및 구조 해석이 필요한 경우 또는 항체 만들 때의 항원으로 이용하는 경우에는 MBP 부분이 방해가 되기 때문에 정제한 후에 MBP를 절단하는 것이 요구된다.
4. 결론
본 리포트에서는 융합단백질을 디자인할 때 고려해야 할 점 및 실제로 융합단백질을 합성 및 발현 정제하기 위해 사용할 수 있는 방법을 기술하였다. 또한 현재 상용화되고 있는 대표적인 융합단백질을 소개하였다.
단백질의 활성을 유지하면서 더욱 효과적이고 간편하게 융합단백질을 작성할 수 있는 방법이 앞으로의 융합단백질 합성기술의 핵심 포인트가 될 것이며, 그러한 방법을 통하여 작성되는 다양한 기능을 갖춘 융합단백질이 기대된다.
5. 참고문헌
==> PDF 참조