[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 sale 회원가입   로그인
BRIC홈 동향
검색광고안내
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 뉴스 Bio통신원 Bio통계 BRIC이만난사람들 웹진(BioWave)
BRIC View
최신자료 동향리포트 학회참관기 리뷰논문요약 BRIC리포트 외부보고서
‘액체 생검’의 시대: 순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)의 활용을 위하여
‘액체 생검’의 시대: 순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)의 활용을 위하여 저자 박가희 (서울대학교 의과학과)
등록일 2017.06.13
자료번호 BRIC VIEW 2017-R14
조회 11489  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
유전체 및 분자 분석 방법과 기술의 향상으로 종양학에서는 ‘액체 생검’을 통한 분자 프로파일링, 모니터링, 예후 혹은 예측의 가능성이 입증되고 있다. 액체 생검에서 특히 이목을 끌고 있는 순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) 분석은 여러 원리 입증 연구들을 통해 임상적 연구 가치가 높이 평가되고 있으며, 실용성이 논의되고 있는 기점이다. 성공적인 종양학 연구를 위하여 불충분한 생물학적 지식의 충족과 접근법 그리고 맞춤 종양학 연구를 도모한 평가 및 적절한 연구 사례들을 비교하며 논할 적기이다.
키워드: Liquid biopsy, cfDNA, ctDNA, 액체 생검, 순환종양 DNA, 세포유리 DNA
분야: Cancer Biology/Oncology
본 자료는 Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nat Rev Cancer. 2017 Apr;17(4):223-238.의 논문을 한글로 번역, 요약한 자료입니다.

목차

1. 서론
2. 세포유리 DNA (cell-free DNA, cfDNA)와 순환종양 DNA (circulating tumor DNA,ctDNA) 의 생물학과 특성
3. 생리학 및 병리학적 고려
4. ctDNA 분석 접근법
5. 암 병기결정과 ctDNA 검출
 5.1 병기와 예후의 관련성
 5.2 초기 진단
 5.3 종양 국소화
6. 비침습적 분자 프로파일링
 6.1 이질성 분석
 6.2 핫스팟 돌연변이와 유전자 패널
 6.3 구조 변이
7. 추적 연구
 7.1 추적 반응
 7.2 미세잔존질환 및 재발양상 감시
8. 클론진화와 내성
9. 향후 연구 방향


1. 서론

인간의 혈류에서 무세포 DNA 혹은 세포 유리 DNA (cell-free DNA, cfDNA)의 존재는 1948년 Mandel and Metais에 의해 밝혀졌다. 순환 중인 cfDNA는 건강한 사람들에게서는 낮은 범위의 농도(1-10ng/mL)로 유지되며 급성 외상, 뇌경색, 운동, 이식, 감염 및 암 환자와 같이 생리적 현상 혹은 여러 임상적 조건에서 농도는 증가된다. 이러한 특성으로 cfDNA 분석은 비침습성 산전 검사(noninvasive prenatal testing, NIPT)에서 활용되고 있으며 멘델리안 장애 혹은 다운 증후군(trisomy 21)과 같은 검사가 현재 시연되고 있다. cfDNA의 돌연변이 서열은 ‘순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)’라 불리며 정확한 생물학적 메커니즘은 밝혀지지 않았지만, 암세포 사멸로 인하여 cfDNA가 혈장으로 침습될 것이라 생각되고 있다. 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing, NGS) 기반 기술 혹은 정밀화된 디지털 PCR (digital PCR, dPCR)의 기술 발전으로 ctDNA 분석이 가속화 되었고 여러 임상적 연구들을 통하여(그림 1) 예후, 예측 마커, 모니터링의 가능성이 입증되었다. 전통적인 바늘 생검(fine needle aspiration, FNA)과 같은 침습적 생검은 6건 중 1건의 높은 확률로 합병증을 유발하며 유전체 프로파일링을 위한 충분한 양과 물질을 확보하기 어렵다. 또한 유전적 이질성(genetic heterogeneity)의 장벽과 미세잔존질환(minimal residual disease, MRD) 탐지 불가능성으로 인해 이를 보완하는 새로운 진단 및 분자 도구로써 ctDNA 분석이 주목 받고 있다. ctDNA 분석은 종양의 크기와 정량화 그리고 유전체 분석을 비침습적 샘플링 방법으로 가능하며 반복적 채취와 실시간으로 질병 진화를 감시할 수 있는 장점이 있다. 이 리뷰를 통하여 현재까지 진행되어 온 연구들의 사례들과 앞으로 연구 및 발전되어야 하는 점들을 논의해 보고자 한다.

upload image

그림 1. cfDNA의 가설 및 분석 기술 발전의 연대표



2. 세포유리 DNA (cell-free DNA, cfDNA)와 순환종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) 의 생물학과 특성

cfDNA는 세포로 인한 사멸, 자멸 혹은 활발한 분비로 인해 혈류 혹은 체액에서 순환된다 (www.nature.com/nrc/journal/v17/n4/fig_tab/nrc.2017.7_F2.html). 유전자 분자 혹은 물질의 변형은 근원 세포의 후생(epigenome)과 유전체(genome)에 반영되며 메틸화 분석(methylation analysis)을 통하여 건강한 사람들에서는 조혈 세포(haematopoietic cell)로부터 cfDNA가 방출된다고 밝혀졌다. cfDNA의 반감기는 16분에서 2.5시간 사이로 간주되며 실시간 질병 관찰의 가능성이 입증되었다. 특히 cfDNA의 분해는 간 및 비장의 대식세포 혹은 뉴클레아제 작용과 신장 배설을 통해 소변으로 제거되며, 이는 세포막(cell membrane)과 세포외 소포(extracellular vesicles) 또는 단백질(protein)과의 관련에 따라 안정도가 정해진다. cfDNA의 길이는 다양하며 길이의 영향은 DNA 추출 혹은 NGS 기술에서 발견되는 오류와 결합하여 나타나는 듯하지만, 대부분의 cfDNA 길이는 대략 166 염기쌍(base pair, bp)으로 뉴클레오좀(nucleosome, ~147bp)과 DNA 링커(DNA linker)를 합친 길이와 비슷하며 10 bp 간격의 사다리 패턴을 갖고 있다(그림 2).

upload image

그림 2. 평균적인 cfDNA의 길이는 166 bp이며 이는 뉴클레오좀을 감고 있는 DNA 길이와 Linker DNA 길이를 합친 길이로 추정된다.



3. 생리학 및 병리학적 고려

cfDNA와 ctDNA의 생물학적 지식은 불충분하며 응용 연구를 통하여 지식의 충족이 필요하다. 현재까지 연구된 바로는 cfDNA는 면역 신호 조절 및 DNA의 수평이동을 중재하는 역할의 가능성이 제시되었고, cfDNA가 Toll-like receptor 9 (TLR9) 리간드로 제안되어 왔다. 생쥐 실험을 통하여 비만 관련 지방 세포 변성에 의해 cfDNA가 방출되는 것이 포착되었고, TLR9 활성을 통해 대식세포에 추적이 되면서 조직 염증 및 인슐린 저항성이 유도되는 것으로 나타났다. 또한 TLR9 의존성 신호 전달을 통하여 pro-apoptotic caspases를 억제할 수 있는 것으로 제시되었다. 수평 이동 가능성은 결장 직장암 환자의 혈장 시료와 NIH-3T3 마우스 세포를 분리하였음에도 불구하고 시험 관내 형질전환된 것으로 보아 예측할 수 있었다. 또한 ctDNA가 수혜자 세포의 핵 DNA에 통합된 것을 보여줌으로써 비상동말단열결(Non-homologous end joining, NHEJ)을 통해 발생할 수 있을 것이라 보았으며 미토콘드리아 DNA에서 또한 유사한 현상이 관찰되었다.

4. ctDNA 분석 접근법

ctDNA의 분석을 위한 범위는 단일 변이부터 총유전체 분석까지 다양하다(그림 3). 특정 변이를 지정하여 분석이 필요하거나 적은 범위의 핫스팟 돌연변이(hotspot mutation)들을 검출해낼 시, 알맞은 분석 설계를 통해 높은 민감도으로 검출해 낼 수 있다. 대표적인 단일 변이 시험(assay)으로는 특이 중합효소 연쇄 반응법(allele-specific PCR)과 디지털 PCR (digital PCR, dPCR)이 대표적이다. 하지만 반복적인 실험이 필요할 경우, 샘플을 나누어서 실험해야 하는 단점으로 샘플링 오류(sampling error)와 낮은 수준의 유전자 복사 개수 변경(copy number alteration) 검출에 제한적이다. 많은 수의 유전자들을 한꺼번에 분석 조사할 시, 표적 서열 분석(targeted sequencing)이 제격이며 종류는 앰플리콘(amplicon) 혹은 하이브리드 캡쳐(hybrid capture based) 방식이 있다. 개별 엑손(exon) 단위부터 전체 엑솜(exome)까지 다양한 영역을 분석할 수 있는 장점이 있으며, 현재는 1%이상(allele fraction)으로 존재하는 대립 유전자를 가진 돌연변이를 검출해 낼 수 있다. 1%이하의 유전자 분율을 갖은 돌연변이는 서열 분석의 백그라운드 오류율(background error)를 감소시키는 방법, 바코딩(barcoding) 혹은 여러 번 시퀀싱 수행으로 0.1% 미만의 유전자 분율 돌연변이 또한 검출 해낼 수 있다. Amplicon이나 hybrid capture 방식은 수십에서 수백 킬로 베이스(kilobase)로 유전체 영역을 증가시킬 수 있으며, 제한된 시료로도 맞춤 패널을 이용하여 민감도 높게 ctDNA를 도출해 낼 수 있다. 유전자 증폭과 결실(amplification and deletion)은 낮은 심도의 전체 유전자 시퀀싱(shallow WGS)으로 상대적 수를 비교하며 식별해 낼 수 있다. 이는 태아 이수 배수 체를 검출 하는데 사용되어 왔으며 특이적인 종양 변이수 변화 검출에 사용될 수 있다. 하지만 sWGS의 한계는 높은 돌연변이 대립 유전자 분획(5-10%) 검출에 능하여 초기 단계의 질병 검출에 제한적이다. 적은 수의 재발성 변이 분석을 원한다면, targeted sequencing을 통하여 0.5% 정도의 copy number alteration을 검출해 낼 수 있다(www.nature.com/nrc/journal/v17/n4/fig_tab/nrc.2017.7_F3.htmlwww.nature.com/nrc/journal/v17/n4/full/nrc.2017.7.html#t1).

개인의 질병 상태와 종양 돌연변이가 특성화 되어 있는지 여부에 따라 분석 검출 한계가 달라진다. 혈장 안에서의 ctDNA는 환자의 종양 샘플에서 확인된 돌연변이(또는 다른 변이)를 비교 및 정량화되어 왔다. ctDNA의 검출은 여러 가설검정으로 허위양성(false-positive)를 골라내어야 하는데, 이는 패널 크기에 따라 가설검정 단계가 늘어나며 특이성을 높여야 한다. 하지만 이는 희귀 변이(rare variants)들을 쉽게 놓칠 수 있으며 민감도가 낮은 편이다. 특히 새로운 변이(de novo mutation)는 background error rate 감소뿐만 아니라 대사 및 생리학적 변화에 의한 cfDNA 회전율 변화를 적용하여 돌연변이의 농도 변화와 영향 또한 감수해야만 한다. 추가적으로 혈액 세포에서 유래된 생식계열(germline) DNA 의 시그널(signal)들을 사전에 제거하여 분석에 방해되는 요소들을 최소화해야 한다. ctDNA는 돌연변이 대립 유전자 농도(1밀리리터 당 복제) 또는 다양한 측정법을 사용하여 정량화할 수 있으며 단편화된 분석이 아닌 cfDNA와 ctDNA의 특성을 응용 조합하여 분석 되어야만 한다.

upload image
그림 3. 현재 cfDNA 및 ctDNA 분석 흐름



5. 암 병기결정과 ctDNA 검출

5.1 병기와 예후의 관련성

종양의 크기와 병기 그리고 ctDNA의 농도는 상관 관계가 있다. 다양한 유형과 병기를 갖은 640 명의 환자를 대상으로 조사한 결과 1기의 환자에 비해 4기의 환자들은 ctDNA 농도 중앙값이 100배나 증가되었다. 1병기의 환자는 ctDNA가 혈장 5mL당 10 카피(copies)이하였지만 진행성 전립선암, 난소암 또는 대장암 환자들에서는 5mL당 100-1,000 copies의 중앙값을 갖고 있었다.

ctDNA 농도의 다양성은 동일한 유형 및 병기의 환자들 사이 조차에서도 크게 다르며, 부분 전이 확산의 정도 또는 종양 크기의 차이에 의해 다르게 설명 될 수 있다. 최근 보고된 재발성 고등 장액 난소 암(high-grade serous ovarian cancer) 환자에서 ctDNA 수치와 종양 부피를 비교한 결과 ctDNA 수치와 종양 부피가 상관 관계가 있다고 밝혀졌다. 혈장의 돌연변이 대립 유전자는 1mL 당 약 0.08%의 분율 증가와 6개의 돌연변이의 복제가 질병의 1cm3당 증가 되었다. 이러한 상관 관계에도 불구하고 실질적인 ctDNA 농도 변화는 개체간의 차이로 인해 발생 할 수 있으며 종양의 혈관 형성의 상태에 따라 저산소 상태와 세포 사멸을 일으킴으로써 ctDNA 방출을 방해할 수도 혹은 촉진 할 수도 있다. 조직학적으로는 세포 사멸 속도와 세포의 유형이 ctDNA 농도 변화에 영향을 미칠 수 있다. 원발성 뇌종양(primary brain tumor) 환자는 매우 낮은 수준의 혈장 ctDNA를 가지고 있으며 혈장 5mL당 돌연변이의 대한 중간 농도가 10 copies 미만인 반면 뇌척수액(cerebrospinal fluid)에서 종양 DNA (tumor DNA)의 비율은 이보다는 유의하게 높은 것으로 나타났다. 직접적으로 증명된 것은 아니지만 혈뇌 장벽(blood-brain barrier)은 혈액 순환계로 이동하는 cfDNA 단편을 방해하는 것으로 제안되고 있다.

ctDNA 분석의 예후 유용성은 ctDNA의 농도 수준과 암 병기 사이의 관계성을 나타내 주었다. 환자 중 ctDNA가 있는 환자는 ctDNA가 없는 환자보다 생존율이 낮았다. 초기 사례로 2년간 대장 암 환자들을 대상으로 ctDNA를 갖은 환자의 전체 생존율은 48%이었으며, ctDNA가 없는 환자의 경우 생존율은 100%였다.

ctDNA 존재성은 현재 사용되고 있는 종양 마커(tumor biomarker)보다 예후 예측인자로 더욱 적합한 것으로 밝혀졌다. 전이된 유방암 환자 대상으로 ctDNA 농도와 전체 생존율을 비교 분석한 결과 ctDNA의 mm당 2,000 카피 이상인 환자 모두 악화된 예후를 보였으며 증가된 ctDNA의 농도를 갖은 환자들의 경우 임상증상 및 방사선 소견 모두에서 예후가 좋지 않았다. 이러한 수치 외에 상응하는 돌연변이 패턴 분석을 통해 환자들의 예후와 관련되는 분자 아형(molecular sub-type)으로 분류할 수 있었다.

5.2 초기 진단

암 발병의 조기 진단은 치료 가능성과 생존율을 향상시킬 수 있다. 많은 선행 연구에서 비침습적 조기 진단의 가능성을 입증하여 주었는데, 대표적인 예로 NIPT를 받은 임산부에게서 우발적인 암이 발견되었을 경우 이는 태아와 종양 기원의 복제 변이 변경 비교를 통하여 타액과 혈장에서 돌연변이를 검출할 수 있다. 하지만 이를 토대로 무증상 혹은 건강한 사람을 선별하여 검사하는 것은 과잉 진단 및 허위양성(false-positive)을 초래할 수 있으므로 단계적인 탐구가 필요하다.

가장 먼저 장기적인 검사와 증상이 나타나는 환자 혹은 질병으로부터 시작되어야 하며 cfDNA의 추출과 사전 분석 요소의 최적화를 통해 판별하고자 하는 돌연변이의 ctDNA 검출 가능성을 판별해야 한다. 선행 연구사례 예시: 1) 여러 암 종군 대상으로 혈장 5mL 당 1 copy의 돌연변이를 탐지할 수 있는 방법을 통해 조사한 결과 ctDNA는 4기의 환자에서 82% 비율로 검출되었고, 표적 유전자 시퀀싱(4개 돌연변이/환자, 중앙값)을 통해 1기의 비소 세포 폐암 환자에서 50% 정도의 ctDNA가 검출되었다. 2) 조기 유방암의 알려진 변이들을 대상으로 dPCR을 적용하였을 때는 93.3%의 감도로 검출할 수 있었다. 3) 난소암을 대상으로 sWGS 방법을 대입하였을때는 16 예시 중 6 예만 검출할 수 있는 것으로 나타났고, 더 적은 copy number alteration가 있는 다른 유형의 암에서는 민감도가 더욱더 떨어질 확률이 높았다. 이러한 다양한 민감도의 이유는 샘플링 노이즈(sampling noise)의 이유가 크게 자리잡으며 밀리미터(mL)의 혈장에서 수천 사본만이 포함되어 있다고 생각하면 노이즈와 쉽게 구별할 수 없기 때문이다. 이를 보완하기 위해서는 더 많은 양의 혈장 및 cfDNA 수집이 필요하다. 예를 들어 혈장분리교환법(plasmapheresis) 또는 혈액 순환 암 세포(circulating tumor cell, CTC)에서 많이 이용되는 결합 물질 장치 이식을 이용하는 것 또한 많은 양의 cfDNA를 수집할 수 있다. 혈장뿐만이 아니라 대장 암의 소변, 자궁 경부암의 자궁세척 혹은 세포 표본, 식도암의 브러싱 등으로 많은 돌연변이 DNA 검출 또한 비침습적 방법으로 가능하다. 비인두암종이나 자궁경부암 같은 바이러스 병인을 갖은 암의 경우, 암 관련 바이러스(viral DNA)가 종양 DNA (tumor DNA)보다 많은 양으로 체액에 존재하며 이는 초기 병기 검출 혹은 악성이 되기 전 단계의 병변 및 높은 위험도의 암을 구별해 낼 수 있다.

기술 및 생물학적 발전은 돌연변이 검출을 보다 용이하게 만들었다. 기술면에서는 ctDNA가 cfDNA보다 길이가 짧아 실험 혹은 in silico에서 사이즈 선택이 가능하며 혈장 혹은 DNA 시료가 제한적인 경우 광범위한 유전자 패널 혹은 맞춤 멀티 패널을 사용하여 여러 돌연변이를 한번에 분석하는 것이 단일 분석보다 민감도를 높일 수 있다. 현재는 제한적이지만, 향후 전체 유전체 시퀀싱을 통하여 소량의 혈장(또는 다른 체액)에서도 종양을 민감도 높게 탐지할 수 있을 것이라 본다. 하지만 기술적 보완이 되더라도 결국 생물학적 및 유전적 요인이 여전히 극복해야할 과제로 남아있다. 예를 들면 비종양형성 클론(non-tumorigenic clones)이 충분한 크기로 증가하고 이로 인해 변이된 cfDNA를 방출한다면 생물학적 소음(biological noise)를 유발할 수 있다. 믿을 만한 de novo 돌연변이 검출을 하려면 그만큼의 높은 암의 양성 예측치(positive predictive value, PPV)를 가져야 하지만, 흔히 알려진 암 관련 돌연변이들은 낮은 수치로 관찰되는 문제가 있다(예: TP53, KRAS 및 노치 패이 웨이(Notch patheway) 유전자의 변이). 또한 건강한 사람의 혈장에서 암과 관련성이 알려진 유전체 변이가 발견되기도 하며, 혈액 암으로의 전환이 1%의 낮은 위험이긴 하지만, 65세 이상 개인의 10%에서 백혈병 관련 돌연변이를 가진 클론 성의 조혈(clonal hematopoiesis)이 관찰되었다. 이와 같이 건강한 사람에서 발견되는 돌연변이들에 대한 명백한 생물학적 및 임상적 이해가 선행되어야 정확한 진단을 내랄 수 있다.

5.3 종양 국소화

cfDNA 분석을 통하여 조직 및 세포 특이적으로 암호화된 메틸화(mehtylation) 및 뉴클레오솜 점유 패턴(nucleosome occupancy pattern)의 존재를 알 수 있었다. 이는 일차 원인이 알려지지 않은 종양의 위치 파악을 도울 수 있는 가능성을 제시하였다. 한 예로, NIPT 검사를 받은 산모 중 염색체 이상으로 조직적 메틸화 시그널(tissue-specific methylation signal)을 통해 조사한 결과 B 림프구로부터의 cfDNA의 증가가 발견되면서 소포림프종(follicular lymphoma)을 발견 및 진단할 수 있었다. 이와 같은 방법으로 전이(metastasis)가 될 때 조직 특징적으로 증가되는지의 여부는 추가적인 연구가 필요하지만 cfDNA 분석을 통한 암의 기원을 밝힐 수 있는 가능성을 제사하였다.

6. 비침습적 분자 프로파일링

6.1 이질성 분석

같은 환자에서 종양 부위별 시퀀싱(multiregional sequencing)을 한 결과 돌연변이 프로파일들이 종양의 위치마다 돌연변이의 프로파일이 다른 것을 확인되었고, 원발 및 전이 부위에서 또한 다른 표본간 돌연변이의 차이가 확인되었다. 개별적인 생검 분석은 환자의 유전체 구조를 정확하게 반영하지 않을 수 있고 맞춤 진료 선택과 효능에 편향될 수 있지만, 여러 종양 생검을 실시하여 설명하는 것은 또한 불가능하거나 바람직한 시도가 아니다. 최근 보고된 폐암 환자의 경우는 종양 EGFR T790M 대립유전자 분획(allele fraction)과 종양수축 정도가 상관 관계가 있다는 것이 밝혀져 오로지 억제제(inhibitor)에 해당하는 돌연변이 유무에 기반한 치료가 차선책이라 밝혔다.

액체 생검을 통해 발견된 ctDNA들은 여러 종양 영역에서 방출되어 있어 종양 이형성과 공간적으로 분리된 병소를 반영할 수 있는데, 이는 조직 생검(tissue biopsy)에서 누락된 돌연변이를 발견할 수 있었다.

다지역 종양 시퀀싱(multi-region tumor sequencing) 데이터는 모든 종양 영역이 공유하는 줄기변이(stem mutation)가 개인 돌연변이(private mutation)보다 혈장에서 더 높은 대립유전자 분획을 갖는다는 것을 보여주었기에 줄기변이를 통해 종양의 변화를 추적하는 것이 최적화된 방법이지만, 넓고 많은 돌연변이들을 추적하는 것이 이종 또는 사적인 돌연변이의 편향 분석되는 것을 보완할 수 있다.

6.2 핫스팟 돌연변이와 유전자 패널

국제적으로 대규모 임상 시험들이 가능하고 표준화될 수 있다는 것을 입증하기 시작하면서 ctDNA 분석의 민감도가 65-98% 사이임을 여러 후향적(retrospective) 연구들로 인해 추정되었다. 낮은 레벨의 ctDNA 도출 및 검출 시험법 개발을 위해 전이된 대장암에 대입하였는데, 블라인드 전향적 시험(blind prospective test) 결과 KRAS와 BRAF 변이에서 각각 민감도 92%와 특이성 100%을 보였다. 이 후 생검 체취가 어려운 NSCLC 환자들 대상으로 한 메타분석(meta-analysis, 2007-2015년 사이 선택된 27개의 연구 및 약 4,000명의 환자 대상)은 혈장 또는 혈청에서의 EGFR 돌연변이 검출의 민감성과 특이성이 각각 60%와 94%에 그친 것으로 발표되었다. EGFR 억제제인 제피티닙(Gefitinib)은 652명 4기 환자 대상으로 종양과 혈장 샘플 간의 돌연변이 상태 비교에서 또한 65.7%와 99.8%의 민감도와 특이도로 낮은 민감도를 보였는데, 이는 사용된 dPCR의 키트버전(1.95% 분석 민감도 ≥95 %)의 검출 한계도 때문이라 밝혔다(1.64% 및 1.26%의 EGFR 결실 및 L858R의 변이). 최근 EGFR T790M 상태의 낮은 일치율은 오시머티닙(osimertinib)의 임상 3상 시험에서도 관찰되었고 혈장 1 밀리리터 당 100 카피의 EGFRT790M가 필요한 것으로 발표되었다. EGFR T790M은 대게 gefitinib와 에를로티닙(erlotinib)의 저항돌연변이로 EGFR tyrosine kinase 억제제 초기 치료 후 빈번히 나타나지만 이는 EGFR L858R 혹은 EGFR ex19del보다 낮은 민감도로 발견되었다. 이 유전자는 재발시 저항성 돌연변이의 이종적인 존재일 것이라는 지적도 있었다. 일부 후향적 분석 연구에서 관찰된 혈장과 종양 샘플 간의 EGFR 돌연변이 상태는 일치율이 낮고 제한적임에도 불구하고 EGFR의 돌연변이에 대한 혈장 양성인 환자와 조직 양성인 환자 반응률(response rate)이 유사하여 ctDNA 분석 기반으로 치료한 환자들의 반응율을 분석하는 연구 결과가 많아지기 시작했다. 이는 조직 분석과 혈장 내(0.5% 미만) 돌연변이 반응에서도 객관적인 결과로써 보고되었다.

현재 EMA (European Medicines Agency)와 FDA (Food and Drug Administration)에서는 NSCLC 환자 중 EGFR 돌연변이가 있으며 생검 체취가 어려울 경우, gefitinib (EMA), erlotinib (FDA), osimertinib (EMA 및 FDA)의 선택 사용을 ctDNA 분석 기반만으로 할 수 있도록 승인하였다. 이 방법은 반복적인 생검을 피하고 개별적인 분자 프로파일링 정보를 제공하는 실용적인 해결책이며 ctDNA 분석이 음성일 경우 조직 생검을 실시하여 유전체 정보를 제공하고 양성일 경우 조직 생검을 하지 않는 것을 권장하고 있다.

ctDNA 분자 프로파일링은 한 가지 질환에 여러 가지 임상 시험 약을 사용하는 ‘우산시험: umbrella trial’ 혹은 한가지 약을 여러 질환에 사용해 보는 ‘바스켓시험: basket trial’을 통하여 환자 계층화가 가능하다. 54개의 유전자를 갖고 있는 패널을 여러 암 유형의 환자에 적용 하였을 때 58%에서 ctDNA가 검출이 되었고 이 중 71.4%는 FDA 승인 의약품에 의해 실행 가능한 돌연변이가 적어도 하나 이상 발견되었다. 2016년도 개인화 치료 회의(Molecular Analysis for Personalised Therapy meeting 2016)에서 발표된 연구에서는, 34개의 유전자를 갖은 패널은 비소 세포 폐암 환자 174명 중 79%에서 돌연변이를 확인했으며 이로 인해 28명의 환자(17%)가 ctDNA 분자 프로파일링 및 맞춤 치료법 선택할 수 있었다고 한다.

비록 환자에서 ctDNA를 사용하여 돌연변이가 성공적으로 검출되더라도, 효과적인 분자적 표적 화제가 존재하지 않을 수 있다. 그러나 위 회의에서 발표된 전향적 임상 시험 자료에 따르면 유전체 분석에 기초한 치료법(승인된 약물 이용)을 선택 시 예후 진단 결과를 향상시킬 수 있다고 보고됐다. 비록 생물학적 요인과 일부 암 유형 혹은 단계의 이질성이 민감도를 감소시킬 수 있지만, 분석 도구의 민감도를 향상 시킨다면 일치율의 증가와 다중검출이 가능해질 수 있다. 그러므로 다양한 임상 증상에서 평가되어야 한다.

6.3 구조 변이

복제수 변이(Copy number variation, CNV)는 WGS, amplicon-based 및 hybrid-capture 방법을 사용하여 cfDNA에서 검출될 수 있다. 간세포 암종 환자에 적용된 WGS 분석은 혈장에서 발견된 CNV와 조직에서 발견된 것과 일치하다는 것이 확인되었으며 유방암과 난소 암에서도 확인되었는데, 종양 특유의 카피 수의 변화로 종양마다 이질적인 CNV 변화를 나타내었다. 전립선 암 환자 80명을 대상으로 한 연구에서 아비라테론(abiraterone) 치료 전의 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR) 카피 수가 증가함에 따라 전반적인 생존율이 감소하는 것을 예측함에 따라 1차 저항 환자를 확인할 수 있었고 진행성 질환이 있는 환자의 경우, sWGS분석이 암 종류에 상관없이 비용 효율적으로 ctDNA 정보를 제공할 수 있으며 ctDNA 분석 차원에서는 스크리닝(screening) 단계의 유용성을 제시했다.

혈장 내 염색체재배열(chromosomal rearrangement)은 WGS 및 hybrid-capture 시퀀싱을 통해 확인될 수 있지만 후자가 경제적 및 안정적이게 식별하는데 더 도움이 된다. 예를 들면 sWGS 분석으로 다섯 명의 전립선 암환자들(prostate cancer)에게서 염색체 21(chromosome 21)의 결실(deletion)을 감지할 수 있었는데 이 후 hybrid-capture 시퀀싱을 통해 보다 정확한 위치를 알 수 있었다.

7. 추적 연구

7.1 추적 반응

액체 생검은 조직 생검 혹은 영상진단보다 위험 감소는 물론 치료에 대한 실시간 모니터링이 가능하다. ctDNA의 역학은 치료 반응과 관련이 있으며 임상적 진단결과 보다 조기에 반응을 도출해낼 수 있다. 유방암 환자 연구에서는 ctDNA이 농도 범위가 영상 진단 혹은 CTC 및 다른 암 항원(cancer antigen, CA)과 같은 기타 혈액 기반 암 마커(cancer biomarker)와 비교하였을 때 가장 다양했고 재발 초기 표시 마커인 CA 15-3(MUC1으로도 알려짐)와 ctDNA 수준과 감소 정도가 유의하게 연관이 있었으며 CA125(MUC16으로도 알려짐)보다 연관성이 더 유의하게 나타났다.

ctDNA의 분석은 면역 반응도 함께 추적할 수 있다. 최근 연구에 따르면 흑색종(melanoma) 환자에서 면역 요법 시작 후 첫 주에 초기 스파이크(early spike)를 ctDNA를 통해 예측할 수 있었는데(BRAF 돌연변이의 대립유전자 증가) 세포죽음의 반영된 일시적인 현상이라 보고 있다. 초기 시점의 샘플링은 진료만이 아닌 약물 개발에도 적용될 수 있다. 그러나, 대장암 환자나 비소세포폐암 환자 같은 경우 EGFR 억제제를 투여한 환자의 화학 요법 치료 개시 후 며칠 후는 조기 스파이크(spike)가 관찰되지 않았다. 치료 개시 직후 혈장 분석이 민감한 암세포의 파괴를 확실하게 감지할 수 있다면 초기 동역학을 검출함으로써 저항성 서브 클론(sub-clone)의 존재를 신속하게 밝혀낼 수 있는 가능성이 있지만 세포 사멸 스파이크의 존재 혹은 시기는 사용된 치료제의 약물학적 특성 및 생물학적 반응에 따라 달라질 수 있으므로 주의해야 한다.

7.2 미세잔존질환 및 재발양상 감시

ctDNA 분석은 수술이나 치료 후 질병의 다른 임상적 증거가 없는 경우에도 미세잔존질환(MRD)의 존재를 알릴 수 있으며 ctDNA의 존재 자체만으로 재발 위험이 높은 환자를 확인할 수 있다. 또한 고위험군과 저위험군 분류로 환자에게 불필요한 합병증과 부작용 위험을 줄이면서 보조 치료를 할 수 있다. 조기 대장암 환자 230명에 대한 전향적 연구에서 외과적 절제 후 최초 추적 관찰시 ctDNA 분석을 통하여 평가한 결과 3년간의 생존율은 ctDNA 양성 군에서는 0%였고 ctDNA 음성 군에서는 90%였다. 조기 유방암 환자 55명을 대상으로 한 별도의 연구에서 또한 첫 번째 추적 관찰에서 ctDNA의 검출은 악화된 예후를 나타낼 수 있음을 보여 주었으며, ctDNA 검출과 임상진단 사이에 7.9-11.0개월의 격차를 발견할 수 있었다. 알려진 돌연변이와 분자 프로파일링의 조합으로 재발 혹은 전이의 조기 검출이 가능할 것이며 미래에는 명백한 재발을 식별할 수 있거나 예방 연기할 수 있을 것으로 보인다.

8. 클론진화와 내성

액체 생검은 여러 종양 부위의 정보를 포함하고 있으며 빠른 회전율로 개별 종양 생검 분석 결과보다 편견이 적다. ctDNA 농도의 상승과 하락은 치료법에 의해 전체적인 종양의 환경변화에 따라 달라지며 종양 자 진화의 통찰력을 얻으려면 종양 변화에 따른 다수의 돌연변이를 조사해야 한다. 또한 혈장 내 다른 돌연변이 레벨 간의 비율은 이질성과 치료 반응 예측에 유익할 수 있다.

ctDNA 분석은 클론(clonal)진화의 모니터링과 저항 메케니즘들을 발각할 수 있다. 몇 가지의 예제로 1) 대장 암 환자를 통해 EGFR 억제 치료 동안 KRAS 돌연변이의 양성 선택(positive selec-tion)이 가능하였고 anti-EGFR 치료 철회 이후 클론의 감소를 볼 수 있었다. 2) NSCLC 환자들에게서 본 ctDNA 분석에서는 저항성 돌연변이가 임상 진행보다 빠르게 검출되었다. 3) Exome sequencing 혹은 sWGS 분석을 통하여 다양한 종양 유형의 환자에게서 내성 기전을 확인할 수 있었지만 비교적 수치가 높은(>5% mutant allele fraction) ctDNA를 갖은 진행암 환자에게 적용되는 것을 제한하고 있다. 이는 비용 때문인데 맞춤 패널의 설계가 효율적인 대안이 될 수 있지만 적절하게 디자인 되지 않은 이상 새로운(de novo) 돌연변이들을 놓칠 수 있다.

sWGS 분석은 역동적인 CNV의 변화를 평균 26.4주나 앞당겨 검출해 내었다. 이를 통해 연속적인 액체 생검은 실시간으로 적응 치료 또는 반응 치료에 저항성 돌연변이를 검출해 낼 수 있고 임상 연구 환경에 효과적인 치료 요법이나 약물 조합에 대한 내성 메커니즘을 확인하는 임상 시험을 촉진할 수 있을 것이라 본다. 더 나아가 암 생물학에 대한 더 많은 통찰력을 제공할 수 있는 가능성 또한 열어 주었다. 대장암 세포주와 ctDNA의 분석 병행한 실험 결과에 따르면, 기존의 마이너 클론 선택과 진행중인 돌연변이 유발 과정 모두에서 내성 변이가 발생할 수 있다는 것을 알게 되었으며, 또 다른 대장암 연구에선 판 트로포미오신 키나아제(pan-tropomyosin kinase, TRK, 혹은 NTRK라고 함) 억제제에 대한 저항성 조사로 환자 유래 이종 이식편과 액체 생검의 동시 분석이 혈장 단독 분석보다 내성을 더 포괄적으로 특징 지을 수 있음을 보여주었다.

9. 향후 연구 방향

ctDNA 분석은 개념적 증명 연구들을 통해 임상적 유용성과 전향적 연구를 위한 훌륭한 연구 일 것이라는 것을 제공하였다. 뿐만 아닌 약물 개발, 종양 내 이질성 및 클론(clonal) 진화의 고찰 연구에 기반이 될 수 있는 유용한 연구 도구가 될 수 있을 것이라 입증 되었다. 앞으로의 ctDNA 연구는 기존 치료 방법들을 대처할 수 있도록 무작위 선별 및 ctDNA 기반 치료 의사결정 시험을 확대해 나갈 것이다. EMA는 이를 위해 우수 사례 지침과 시험 설계를 제시하였고 현재 ctDNA 분석을 개입하여 임상 치료 모니터링과 이의 유용성을 시험하기 위한 임상 시험이 진행 중이다. 두 예로 비소 세포 폐암 환자 대상으로 전향적 모니터링을 통해 erlotinib를 투여하였을 때 혈장에서 저항성 돌연변이의 유무의 따라 질병 진행 징후를 찾는 추가 검사 수행이 실시되고 있으며, 진행성 유방암 환자 대상으로 혈장에서 확인된 돌연변이를 타겟 삼아 향후 치료의 계층화를 위한 혈장 돌연변이 들의 프로파일링이 진행되고 있다. 위를 통해 ctDNA 연구 분야가 탐색적 연구에서 임상적 연구 방향으로 나아가며 치료 의사 결정을 좌지우지할 수 있을 것이라 믿는다.

액체 생검 연구를 성공적으로 발전해 나아가려면 cfDNA와 ctDNA의 기원과 생물학적 특성을 정확하게 파악해야 한다. 특히 치료 중 다른 시점에서의 세포 사멸, 괴사 및 활성 방출의 상대적인 기여도가 탐구돼야 한다. 현재 cfDNA의 방출 및 제거 메커니즘의 한정된 지식은 현재 ctDNA의 신호를 해석하고자 할 때 방해가 되며, 이를 오로지 액체 생검만으로 측정해야 할 때를 대비하여 역학 및 재현성에 대한 연구가 점차 중요해 질 것이다. 더 나아가 모든 종양 서브 클론이 전체 ctDNA 풀에 비례하는지 혹은 혈류에서 나타난 종양 혈관 신진 대사 또는 대사 활성이 다른 생물학적 요인에 의해 편향되었는지의 여부 또한 밝혀내어야 한다. 생체 내 세포 바코딩(in vivo cellular barcoding) 실험 및 부검 연구는 개별 서브 클론의 기여도를, 조직학 연구는 ctDNA 방출 조절 인자를 밝혀낼 수 있을 것이며, cfDNA와 ctDNA 단편 크기 차이는 추출 방법 및 분석에 전반적인 성능을 최적화시킬 수 있을 것이다.

전체 cfDNA 농도는 질병 상태와 예후와 관련이 있으며 cfDNA의 후성 유전 분석은 메틸화, 세포 유형 식별, 일반 체세포와 돌연변이 없는 종양의 미세 환경에 대한 정보, mRNA 및 마이크로 RNA와 같은 다른 순환 핵산 분석은 추가적인 정보를 제공할 수 있다. MRD 검출은 독립적인 방출 메커니즘(예: exosomal RNA와 cfDNA의 coisolation을 통해)을 갖는 여러 유형의 핵산을 표적으로 해야할 것이며, 치료 저항성 검출은 능동적으로 방출을 통한 서브클론 검출이 필요로 할 것이다. 또한, 치료 개시 후 죽어가는 세포로부터 발생하는 단편은 치료 반응성 서브 클론을 확인할 수 있을 것이다. cfDNA를 통해 유전자 발현 양상을 추측하는 것이 가능할 수도 있지만, exosomes, CTC 또는 혈소판을 RNA 시퀀싱하는 것이 직접적인 증거 제시에 도움이 될 것이며 소변이나 뇌척수액과 같은 다른 체액과 함께 혈장 내의 cfDNA를 분석하면 보완적인 정보를 얻을 수 있을 것이다. 이와 같이 단순히 ctDNA 분석하는 것이 아니라 다른 순환 바이오 마커들과 동시 분석하면 민감성과 특이성을 증가시키는 것뿐만이 아닌 다중 마커 접근법을 통하여 질병의 포괄적인 통찰력을 얻을 수 있을 것이다. 마지막으로 10여년 전 Gormally et al.이 제시한 것과 같이 cfDNA와 관련된 단백질들의 특성을 규명한다면 관련 질병과 cfDNA의 생물학적 지식이 넓고 풍부해 질 수 있을 것이다(조나단 완, Jonathan C. M. Wan et al. 2017).

  추천 1
  
인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
  
본 게시물의 무단 복제 및 배포를 금하며, 일부 내용 인용시 출처를 밝혀야 합니다.
Citation 복사
박가희(2017). ‘액체 생검’의 시대: 순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)의 활용을 위하여. BRIC View 2017-R14. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=2758 (Jun 13, 2017)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
  댓글 0
등록
목록
메틀러 토레도
위로가기
동향 홈  |  동향FAQ  |  동향 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아 광고