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NGS (Next Generation Sequencing) Asia 2016 참석 후기
NGS (Next Generation Sequencing) Asia 2016 참석 후기 저자 이훈석 (㈜ 지노바이오)
등록일 2017.01.03
자료번호 BRIC VIEW 2017-C01
조회 3713  인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
요약문
Bio marketing 기업인 SELECTBIO의 주관으로 열리는 여러 conference 중 하나인 NGS Asia 2016 학회는 tumor sequencing, companion diagnostics, ctDNA, NIPT를 주제로 하여, 12월 1일부터 2일까지 대만 타이페이에서 열렸다. 미국, 호주, 중국, 대만에서 약 100명의 참석자를 대상으로 keynote presentation, technology spotlight presentation 및 panel discussion 등 학계와 산업계의 융합을 도모하는 자리가 마련되었다.
키워드: NGS, Companion diagnostics, ctDNA, NIPT
분야: Biotechnology
목 차

Ⅰ. 주요 발표 내용
 1. 12월 1일 주요 내용
   ㆍKeynote 1.
   ㆍKeynote 2.
   ㆍPresentation 1.
   ㆍPresentation 2.
   ㆍTechnology spotlight 1.
   ㆍKeynote 3.
 2. 12월 2일 주요 내용
   ㆍKeynote 4.
   ㆍKeynote 5.
Ⅱ. 총평


Ⅰ. 주요 발표 내용

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Conference room의 모습.
Courtyard by Marriott Taipei에 마련된 room으로 2일 동안의 발표가 이루어졌다.



1. 12월 1일 주요 내용

ㆍKeynote 1.

Lowering the clinical adoption barriers of next-generation sequencing
(John Leite, Illumina, USA)


From bench to bedside: 새로운 발견을 촉진하는 “research”로부터 innovation을 적용하는 “translational” 단계를 거쳐, patient care에 있어 핵심적인 정보를 줄 수 있는 “clinical” 단계로의 전환을 의미한다. Cancer의 classification 역시 cancer morphology만을 중요하게 여기던 것에서, molecular features의 중요성이 높아지는 것으로 진화하고 있다. 이는, 특정한 유전자 변이에 따른 targeted therapy의 폭발적인 증가를 가져왔다.

Knowledge gap crisis: NGS를 이용한 진단이 더욱 각광을 받기 위해서는 다음과 같은 4가지 질문에 대한 답을 찾아야만 한다.
1. How will NGS make my practice more efficient?
2. How will NGS increase my profitability?
3. How will NGS help me reduce episode-of-care costs?
4. How will NGS reduce the overall population risk?
특히, 제약회사의 경우는 trial recruitment 및 drug development의 efficiency를 위한 NGS의 적용을 위해 “How will NGS help me get my dug to market faster?” 라는 고민이 필요하며, 병원 역시도 환자의 빠른 진단 및 정확한 시기에 정확한 약을(right drug at right time) 사용하기 위한 “How will NGS help patients live another 10 years?”를 고려해야 한다.

Consolidation of molecular, genetic testing: NGS를 이용하여 기존 molecular and genetic test를 효과적으로 대체 가능하다. 즉, gene marker를 확인함에 있어 기존의 RT-PCR 방법은, multiplexing으로 다수 targets의 확인 및 full sequence 분석을 통한 unknown variants의 확인이 가능한 NGS로 대체 가능하며, FISH 방법을 이용한 cytogenetics의 분석 또한, culture가 필요 없이 structural variants 및 sequence variants를 동시에 평가 가능한 NGS로 대체 가능하다. 이들의 분야에서도 analytical concordance, cost savings, improved outcomes라는 장점으로 NGS를 이용한 분석은 확대되고 있다.

ㆍKeynote 2.

Identifying non-coding RNA biomarkers and therapeutic agents through expression profiling and functional screens
(Alexander Pertsemlidis, The university of Texas health science center at San Antonio, USA)


Using ncRNA to identify therapeutic vulnerabilities: ncRNA란 DNA로부터 transcription 되었지만, protein으로 translation 되지 않는 functional RNA molecule로 정의된다. 이러한 ncRNA에는 micro RNA (miRNA), long non-coding RNA (lncRNA), circular RNA (circRNA)가 있다. 최근 tumor cell viability와 drug response를 조절하는 ncRNA를 발굴하고자 하는 노력들이 있으며, high-throughput screening을 위한 방법으로서 NGS를 이용한 expression profiling을 진행한다.

Validation of candidate ncRNA targets: NGS를 이용하여 얻어진 candidate targets는 qRT-PCR, protein quantification, luciferase reporter assay 등을 통해 validation된다. 특히, cancer cell 에서의 candidate ncRNA levels는 cell cycle phase distribution을 flow cytometric analysis나 colony formation assays 및 caspase activation assays를 통해 평가 가능하며, mouse xenograft models을 이용하여 validation을 할 수 있다.

ncRNA as biomarkers and therapeutic agents: 연구를 통해 의미 있는 ncRNA를 발굴했다. miR-92a의 inhibition은 vitamin D signaling을 de-repressesion함으로써 selectively toxic effect를 나타내며, miR-93은 Dab2를 통한 cancer cell의 proliferation을 촉진시킨다. 또한 miR-10a는 PI3K를 통해 apoptosis를 증가시킴으로써 cancer cell growth를 조절한다. 이와 같이, miRNAs를 통한 연구는 conventional pharmacological approaches 대비 multiple pathways를 targeting할 수 있다는 측면에서 가치가 있다.

핵심 point: Critical role in cancer + unique mechanism of action = new class of diagnostic, prognostic, and therapeutic tools.

ㆍPresentation 1.

Biomarker development and clinical practice in precision medicine
(Sung-Liang Yu, National Taiwan university college of medicine, Taiwan)


Precision medicine in Taiwan: 미국 Obama 대통령이 언급한 이후로, precision medicine은 modern therapy의 trend가 되었다. 이후, cancer patients는 molecular target therapy의 development와 companion diagnosis를 통해 전보다 많은 혜택을 누리고 있으며, inappropriate treatment, adverse effects, poor life quality를 피하고 있다. 대만에서도 2010년 personalized cancer therapy를 위해 national reference lab이 만들어졌다. Actionable genes, cancer panel, NGS 및 liquid biopsy samples (CTC, ctDNA)를 다루고 있으며, nation-wide service를 통해 약 11,000 case 이상의 검사가 진행되었다. 2016년 6월에는 6개 medical center가 참여하여 cfDNA를 통한 EGFR T790M proficiency test를 아시아 최초로 완료하였다.

Lung cancer prognostic marker for chemotherapy: 5개의 gene markers와 5개의 micro RNA marker를 통해 non-small cell lung cancer (NSCLC) patient의 survival을 예측하였으며, 6개의 copy number variation marker를 이용하여 EGFR-TKI 치료 여부를 확인한 patients의 overall 및 disease-free survival 예측하였다. 또한, DNA mass spectrometry를 통한 gene mutation을 정량적으로 확인할 수 있는 방법을 개발하였고, 약 1% gene mutation을 확인할 수 있다. 특히 이 모든 assays는 ISO15189 accredited medical lab에서 수행되어 더욱 의미가 있다.

Non-invasive diagnosis: cfDNA는 mass spectrometry와 digital PCR 기법을 사용하여 EGFR test를 진행하고 있으며, CTC는 single cell level로 mutation 분석 연구를 진행하는데, whole exon sequencing 및 whole transcriptomic sequencing을 수행한다. 이 중에서 cfDNA를 이용한 non-invasive companion diagnosis는 lung cancer나 relapse patients의 혈액에서 cfDNA를 얻고, digital PCR 및 DNA mass spectrometry를 통한 target mutation detection을 한 후, computing 및 statistical analysis를 통해 cutoff value를 setting함으로써 가능하다.

ㆍPresentation 2.

Translatome analysis by NGS: Filling the gap between transcriptome and proteome results in biomarker discovery
(Joseph T. Tseng, National Cheng-Kung university, Taiwan)


What is meaning of the translatome data: Translational regulation의 중요성은 yeast 및 mammalian cell에서의 steady-state level의 mRNA와, 이로부터 encoding되는 proteins (proteasomes) 사이의 correlation이 부족할 때 문제가 일어난다는 연구들로 잘 드러났다. Translational initiation은 tumor formation에서도 중요한 control point로써, mRNA translation을 inhibition하는 drug가 preclinical 및 early clinical development에서 시도되고 있다.

Meaning of ribosome profiling: Ribosome profiling은 ribosomal sequencing (ribo-seq) 이라고도 하며, in vivo 상태에서의 protein synthesis의 genome-wide information을 제공하는 new technique이다(Nature reviews, 2014). 이를 이용하면 transcriptome과 proteome 사이의 존재하는 technological gap을 채울 수 있다. 즉, ribosome의 translational start site, distribution, speed를 identification할 수 있고, translation에 있어 micro RNA의 영향을 연구할 수 있다.

Ribosome profiling data: Translatome data는 physiological condition에 대한 보다 자세한 information을 줄 수 있다. 특히, ribosome profiling technology는 translatome data뿐만 아니라 translational regulation과 관련된 information을 줄 수 있다는 더욱 의미가 있다. 따라서, 앞으로는 ribosome profiling data를 분석할 수 있는 새로운 bioinformatics 기술이 요구된다.

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Panel discussion의 모습.
학계, 산업계, 법조계 분야의 전문가와 함께 참석자들과 열띤 토론을 벌였다.



ㆍTechnology spotlight 1.

Real world data of ctDNA assay with cSMART technology for NSCLC in China
(Kevin Wang, Berry Genomics Corp., China)


Berry genomics: 2010년 5월에 중국 Beijing에서 창업된 회사로, 1,100명 이상의 규모이다. 2015년 3월 T21, T18, T13을 targeting하는 NIPT instrument에 대해 Chinese FDA (CFDA)에 허가를 받았다.

cSMART: Liquid biopsy는 pathogenesis 이후 symptom이 나타났을 때, diagnosis와 treatment selection에 이용되고, treatment selection이 된 이후에도 treatment monitoring에 이용되며, 그 과정 중, resistance가 발생하는지에 대한 resistance monitoring 및 recurrence monitoring에도 이용된다. cSMART는 Circulating Single-Molecular Amplification Resequencing Technology의 약자로, ctDNA를 이용한 liquid biopsy 분석에 효과적인 기술이다. 92명의 advanced lung adenocarcinoma patients를 대상으로 L858R mutation을 확인한 결과, 95.7%의 positive sample concordance를 나타냈다. cSMART NSCLC diagnosis kit는 2016년 CFDA에 허가를 받았다.

Lung cancer panel: Single gene target이 아닌, panel을 만들어 lung cancer에 대한 multi analysis가 가능하도록 했으며, drug decision에 보다 많은 information을 제공하도록 도와준다 (EGFR의 exon 18, 19, 20, 21, KRAS의 exon 2, 3, 4, BRAF의 exon 15, ALK의 fusion (intron 19, exon 20), exon 22, 23, 25, HER2의 exon 20, PIK3CA의 exon 1, 9, 20, RET의 fusion (intron 7, exon 8, intron 10, exon 12), c-MET의 exon 14 deletion).

ㆍKeynote 3.

“SuperSelective” primers for multiplex real-time PCR assays that assess the abundance of rare mutations associated with cancer
(Fred Kramer, New Jersey medical school Rutgers university, USA)


Multiplex real-time PCR assays: 본 방법은 liquid biopsy에서 mutant DNA fragment가 얼마나 존재하는지 분석하는 most rapid, most sensitive, least expensive한 방법이다. Multiplex real-time PCR assay가 same codon에 위치한 rare mutation을 분석하기 위해서는 1. Amplicon-specific fluorescent probes가 있어야 하고, 2. Each amplicon에 대한 오직 correct primer copies가 발생해야 하며, 3. Amplicon의 heteroduplex formation에 대한 suppression을 해야 하고, 4. Amplicon의 Ct values에 대한 fine-tuning이 이루어져야 하며, 5. Inter-comparability를 위한 reference gene이 amplification 되어야 한다.

“SuperSelective” PCR primer: 기존의 linear primers와는 달리, anchor sequence와 foot sequence 사이에 bridge sequence를 추가하여, 이 부분이 matching 되지 않으면서, single-stranded bubble을 형성하고, 이로 인해 미묘하게 변하는 Ct value를 통하여 mutation을 분석할 수 있다. 이러한 unique design은 굉장히 target specific하여, 1,000,000 wild-type DNA fragments 중 ten mutation DNA fragments (0.1% mutation, a single-nucleotide polymorphism)에서의 amplicon 합성이 selective하게 일어났음을 확인하였다.

2. 12월 2일 주요 내용

ㆍKeynote 4.

Expanding the scope of next generation sequencing on prenatal testing
(Hui Jiang, BGI-Research, China)


Prenatal testing: Conventional invasive method를 이용한 prenatal testing은 pregnant woman에게 큰 위험을 감당하게 했다. 최근 non-invasive prenatal test (NIPT)를 이용한 연구가 활발하며, 특히 NGS의 발전은 non-invasive method를 이용해 fetal trisomy의 분석을 가능하게 했다. BGI-Research에서는 NGS-based NIPT technology를 바탕으로, 2011년 NIPT clinical service를 시작했고, 2014년 CFDA 승인을 받았으며, 2015년 CE mark를 획득한 상태로 2017년 FDA 승인을 목표로 하고 있다. 508개 병원에서 약 160만 건의 clinical test를 완료했고, T21, T18, T13에 대해 sensitivity는 각각 99.17%, 98.24%, 100% 및 specificity는 각각 99.95%, 99.95%, 99.96% 획득했다 (Ultrasound Obstet Gynecol, 2016).

Expanded area: 1. Subchromosomal abnormalities: 5 Mb 이상의 deletion이나 mutation 분석을 통해 확인한다. 2. Monogenetic diseases: Target-enrichment capture deep sequencing을 통해 분석하며, newborns에 만연한 12가지의 single gene disorder를 분석한다. 3. NIPT and IVF (in vitro fertilization): ART twin pregnancies인 565 pregnant woman을 대상으로 시험을 진행했으며, positive NIPT results는 karyotyping을 통해 확인했고, negative results는 interview를 진행했다. 결과적으로 false negative는 발견되지 않았다. 4. NIPT and tumor: NIPT를 진행한 4,000 case 중 3 cases에서 multiple abnormalities가 발견되었고, MRI image, tissue slice 및 genetic testing으로 확인한 결과 tumor tissue의 CNV가 NIPT 결과와 일치함을 확인했다.

Fetal cells in maternal circulation and NIPT: Pregnant woman의 혈액에는 cell free fetal DNA, cell free fetal RNA, fetal cells (fetal lymphocytes, trophoblasts, fetal nucleated red cells)가 존재한다. 이중, fetal cell의 확보는 fetal whole genome을 분석할 수 있고, 이를 통해 fetal aneuploidy detection 및 single gene disorder detection 등에 활용할 수 있다.

ㆍKeynote 5.

Electric field induced release and measurement (EFIRM) liquid biopsy
(David Wong, University of California-Los Angeles, USA)


Liquid biopsy: 고속으로 성장하고 있는 분야로, cell-free circulation tumor DNA (ctDNA) 기반으로 한, diagnostics에 있어 unmet clinical needs를 해결하려는 움직임이 활발하다. Liquid biopsy로써 ctDNA의 사용은 molecular target therapy가 긴급히 요구되는 tumor genomics에 효과적으로 도움을 줄 수 있다. Liquid biopsy를 위한 대다수의 targeted approach는 PCR이나 NGS를 기반으로 하고 있지만, biopsy-based genotyping과의 70~80%의 concordance를 보이는데 그치고 있다.

EFIRM-liquid biopsy (eLB): 본 기술은 detection에 대한 accuracy를 획기적으로 높였으며, 특히, NSCLC의 clinical treatment decision에 있어 큰 도움을 줄 수 있다. Electric field를 형성하는 cyclic-square wave가 sample에 있는 EGFR mutation을 인지하고, EGFR sequence는 conducting polymer에 있는 pre-coated capture probe와 함께 electrochemical sensor에 의해 measurement 되며, TMB substrate에 HRP-labeled reporter probe가 반응하여 나오는 signal을 detection하는 원리이다. eLB는 ctDNA를 single copy level에서 detection 가능하며, 단지 40 µL의 sample volume으로, sample processing 없이 15분 내에 결과를 보여줄 수 있다. 특히, plasma뿐만 아니라 saliva sample도 분석할 수 있기 때문에 point-of-care-testing으로의 적용도 가능하다(기존 어떤 liquid biopsy 방법 보다도 적은 sample volume을 사용하고, 분석 시간이 빠르며, saliva sample type도 사용 가능하다는 장점이 있음).

Clinical study using eLB: NSCLC patients에서 EGFR mutations를 확인했을 시, biopsy-based genotyping과 90%이상의 concordance를 보였다. 또한 ddPCR platform과 비교했을 시, ctDNA fragment size가 30 bp만 되어도, L858R mutation의 검출이 가능하였다(ddPCR의 경우 약 100 bp가 되어야 안정적으로 분석이 가능하였음).

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대만 국립고궁박물관.
약 70만여개의 소장품이 있는 세계 4대 박물관중의 하나이다. 한국어 가이드 북이 지원된다.



Ⅱ. 총평

SELECTBIO는 여러 기업과 co-organization을 하여, 규모는 작지만 의미 있는 conference를 한 해에도 10여개를 개최한다. 이번 NGS Asia 2016은 최근 trend인 precision medicine과 NGS의 융합으로 얻어진 학계, 산업계의 연구가 주된 발표 내용이었다. 특히, 학계에서 산업계로 넘어갈 때 중요한 point인 특허 issue에 대해, IP lawyer가 panel discussion에 참여함으로써, bench to bed로의 현실적인 활력을 불어 넣었다. 내년에는 NGS 및 liquid biopsy 관련 conference가 미국 San Diego에서 개최될 예정이다.

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대만 야시장 중 단수이라오제 야시장.
먹거리, 볼거리, 쇼핑 아이템이 많다. 가격은 한국보다 많이 저렴하다.



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본 게시물의 무단 복제 및 배포를 금하며, 일부 내용 인용시 출처를 밝혀야 합니다.
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이훈석(2017). NGS (Next Generation Sequencing) Asia 2016 참석 후기. BRIC View 2017-C01. Available from https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=report&id=2660 (Jan 03, 2017)
* 자료열람안내 본 내용은 BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝힙니다. 내용 중 잘못된 사실 전달 또는 오역 등이 있을 시 BRIC으로 연락(member@ibric.org) 바랍니다.
 
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