간혹 실험에 사용할 플라스미드 (plasmid)의 Multiple Cloning Site (MCS)에 실험자가 원하는 제한효소가 없는 경우도 있습니다. 이번 연재에서는 플라스미드에 MCS를 바꾸고 싶거나 짧은 태그 (FLAG 혹은 HA)를 넣을 때 사용할 수 있는 올리고 오버랩 클로닝 (Oligo overlap cloning)에 대해 소개하겠습니다.
 

그림 1. 클로닝 실험 발표 (출처 1).
 

올리고 디자인

플라스미드의 EcoRI과 SalI 사이에 NdeI, PacI, AscI, MfeI 사이트를 넣기 위해서 가장 먼저 오버랩 올리고를 디자인합니다 (그림 2). 다음으로, 이 부분이 중요합니다. 플라스미드의 EcoRI과 SalI 사이트를 추가로 넣어줘야 합니다 (그림 2B, 노트 1). EcoRI과 SalI이 cut 되는 부분을 잘 확인을 합니다. 올리고를 주문하기 전에 한 번 더 확인합니다 (노트 2). Bottom 올리고는 Top 올리고와 결합할 수 있게 reverse complement로 디자인합니다. 비슷한 방법으로 짧은 태그 (FLAG 혹은 HA)도 넣을 수 있습니다.

그림 2. A, B. 오버랩핑 올리고를 이용하여 플라스미드에 추가적인 제한효소 넣기 (출처 2). C. 호환할 수 있는 제한효소 (SalI, XhoI) (노트 3).

추가로 제한효소를 넣을 때 호환이 가능한 제한효소를 알아두면 실험을 디자인할 때 도움이 됩니다 (그림 2C, 노트 3). 예전에 이 부분을 주의 깊게 고려하지 않아서 클로닝에 애를 먹은 적이 있습니다. 5’ 쪽에 XhoI (C/TCGAG)을 추가했고, 3’ 쪽에 Sall (G/TCGAC)를 추가했습니다. Ligation을 하고, 콜로니 (colony) PCR을 통해 positive 한 샘플을 찾았습니다. 하지만 미니프랩 (miniprep) 후 엔자임 컷이 제대로 되지를 않아서, 혹시나 하는 마음에 샘플 몇 개를 시퀀싱 (sequencing)을 맡겼습니다. 5’ 쪽 XhoI이 3’ 쪽 Sall과 결합해서, 타깃으로 하는 인서트 (insert) DNA가 정방향이 아니고 역방향으로 들어가 있었습니다 (그림 2C). 유사한 이야기를 ‘[대학원 생활 적응기] 클로닝만 6개월째’에 소개를 한 적이 있습니다 (그림 2C, 출처 3). 

실험방법

올리고를 주문했으면, 플라스미드에 EcoRI과 SalI를 처리합니다 (노트 4). 아가로즈 젤 (agarose gel)에 러닝을 한 다음 사이즈에 맞는 밴드를 잘라서 젤로부터 DNA를 뽑아냅니다 (Gel Extraction Kit). 올리고는 annealing 버퍼 (10 mM Tris, pH7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 넣고. 같은 농도의 Top과 Bottom 올리고를 1.5 ml 튜브 (tube)에 넣습니다 (최종 볼륨 100 µl). Heat block에서 비커의 물을 90-95도 정도로 끓인 다음, 1.5 ml 튜브를 90-95도에서 5분 둔 다음 Heat block에서 물이 담긴 비커를 벤치로 옮겨서 실온에서 천천히 식힙니다. EcoRI과 SalI를 처리한 플라스미드와 anneal 한 올리고를 넣고 ligation을 한 후 transformation을 합니다. 이어서 콜로니 PCR, 미니프랩 (miniprep kit), 엔자임 컷을 한 다음 positive 한 샘플만 골라서 시퀀싱을 해서 확인합니다. Positive 한 샘플만 골라서 시퀀싱 하는 방법에 대해서는 ‘연재 3 누구보다 빠르게...’에서 좀 더 자세히 소개하고 있습니다 (출처 4).  
 

실험 절차

노트

1. Top과 Bottom에서 3’ G를 넣지 않으면 EcoRI과 SalI 사이트가 최종 플라스미드에서는 없어집니다 (그림 2B).
2. 플라스미드에 제한효소를 처리한 후 phosphatase 처리를 하지 않은 경우에는 올리고를 그냥 주문하고, 만약, phosphatase 처리를 한 경우라면 올리고를 주문할 때 5’-phosphorylated 올리고를 주문합니다.
3. 호환이 가능한 제한효소를 찾아보는 사이트: https://www.neb.com/tools-and-resources/selection-charts/compatible-cohesive-ends-and-generation-of-new-restriction-sites
4. 두 개의 엔자임을 동시에 사용할 때 버퍼를 결정할 때 사용할 수 있는 사이트 (Double Digest FInder): https://nebcloner.neb.com/#!/redigest

출처

1. https://www.promegaconnections.com/cloning-tips-for-restriction-enzyme-digested-vectors-and-inserts/
2. https://www.addgene.org/protocols/annealed-oligo-cloning/
3. https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=315334&BackLink=L215Ym9hcmQvbGlzdC5waHA/Qm9hcmQ9bmV3cyZQQVJBMz01OQ==
4. https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=332851&Page=1