G2 체크포인트 (checkpoint)는 DNA가 손상됐을 때 세포가 mitosis (유사분열)로 들어가지 못하게 하고, 유전체 보존 (genome integrity)을 보호하는 데 도움을 줍니다. 종양 세포는 유전체 불안정성을 유도하는 G2 체크포인트를 비활성화할 수 있는 돌연변이를 포함하고 있습니다.
DNA를 염색하는 DNA 결합 염료는 DNA의 양에 비례하여 결합합니다. 예를 들어, S phase에 있는 세포는 G1에 있는 세포보다 더 많은 DNA를 가질 것이기 때문에 S phase에 있는 세포는 더 많은 염료랑 결합을 해서 DNA 함량이 두 배가 될 때까지 더 밝게 빛날 것입니다. G2의 세포는 G1의 세포보다 약 두 배 더 밝을 것입니다. Propidium iodine (nucleic acid 염색)는 4N DNA 함량을 가진 세포 일부를 결정할 수 있지만, 4N 세포 중 몇 퍼센트가 이제 막 DNA 합성을 완료했는지, 그리고 실제로 몇 퍼센트가 유사분열인지 알 수는 없습니다. Histone H3은 뉴클레오솜 (nucleosomes)에서 DNA를 채우는 4개의 핵심 히스톤 단백질 (H2A, H2B, H3, H4) 중 하나입니다. Ser10에서 Histone H3의 인산화 (phosphorylation)는 유사분열 동안 염색체 응축과 밀접한 관련이 있습니다. 따라서, Histone H3 pSer10 신호는 응축된 DNA를 가진 유사분열 세포를 나타냅니다. 이번 연재에서는 Anti-Histone H3 pSer10 항체 [노트 1], propidium iodine, 그리고 flow cytometry를 이용한 유사분열 세포 정량화와 DNA 함량 분석을 소개하겠습니다.
그림 1. 셀 사이클 (cell cycle) 단계 (출처 1).
실험 준비
셀을 2 개의 6 cm 플레이트 (plate)에 다음 날 confluence 가 90% 정도 되게 깝니다 (Day 1). 다음 날 confluence가 90% 정도 된 6 cm 플레이트에서 1:5로 희석해서 6 개의 6 cm 플레이트에 셀을 깝니다 (Day 2, 노트 2). 다음 날 준비된, 3개의 6 cm 플레이트는 그대로 두고, 나머지 3 개의 6 cm 플레이트는 DNA 손상 처리를 합니다 (Day 3).
Fixation
DNA 손상 처리 후 3 시간 [노트 3] 뒤 6 개의 6 cm 플레이트 배지 (3 ml)를 15 ml 튜브 (tube)에 각각 모읍니다. 1 ml 1x PBS로 플레이트를 워싱하고, 워싱한 PBS도 앞에서 사용했던 15 ml 튜브에 모읍니다. 그리고서 0.5 ml trypsin을 6 cm 플레이트에 넣고 37°C에서 5 분 동안 처리합니다. 5 분 뒤에 플레이트에 1 ml 배지를 넣고 기존의 15 ml 튜브에 셀을 모읍니다. Centrifugation (1,200 rpm 2분 30초)을 한 다음, 조심스럽게 배지를 제거하고, 펠릿만 남깁니다. 펠릿에 1 ml PBS를 넣은 다음, 추가로 -21°C에 보관했던 9 ml methanol을 15 ml 튜브에 넣습니다 (전체 볼륨이 10 ml). 15 ml 튜브를 실험하기 전까지 -20°C에 보관합니다.
샘플 준비
Fixation 한 샘플을 실온에서 10분 정도 놔둔 다음, centrifugation (1,600 rpm, 2분) 한 다음, 펠렛만 남기고 methanol을 제거합니다. 1 ml PBS로 펠렛을 1.5 ml 튜브로 옮겨서 centrifugation (5,600 rpm, 1분 30초)로 돌린 다음 펠렛만 남기고 PBS를 제거합니다. Anti-Histone H3 pSer 10 antibody를 1:500으로 Ab 희석 버퍼 [노트 4]에 희석한 다음 200 µl를 각 튜브에 넣고 튜브를 회전하면서 37°C에서 한 시간 처리합니다 [노트 5]. 조심스럽게 안티바디를 제거하고 1 ml PBS를 넣어서 워싱을 합니다. 5,600 rpm으로 1분 30초 돌린 다음 펠렛만 남기고 PBS를 제거합니다. 2차 안티바디 (Alexa Fluor 488)를 1:200로 Ab 희석 버퍼로 희석을 한 다음 200 µl를 넣고 37°C에서 30분 보관합니다. 1차 때와 같은 방법으로 안티바디를 제거하고 PBS로 워싱을 한 다음 펠렛만 남기고 PBS를 제거합니다. 400 µl DNA labeling solution [노트 6]을 넣고 37°C에서 10분 처리합니다. 마지막으로 처리한 400 µl를 filter 튜브 [노트 7]로 옮기면 Flow cytometer 분석할 준비가 끝납니다.
그림 2. Flow cytometry를 이용한 유사분열 세포 정량화와 DNA 함량 분석 과정.
노트
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Anti-히스톤H3 pSer10 항체: rabbit monoclonal directly conjugated to the fluorescent dye Alexa Fluor 488.
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다음 날 셀의 confluence가 40% 정도가 되도록 합니다.
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DNA 손상을 처리 농도와 처리 시간은 실험을 통해 결정합니다.
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Ab 희석 버퍼: 3% BSA, 0.05% Tween 20, 0.04% sodium azide in PBS, 4°C에 보관
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Anti-Histone H3 pSer 10 antibody 희석 농도는 실험을 통해 결정합니다.
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DNA labeling solution (RNase, propidium iodine, 1X PBS): Propidium iodine은 DNA 뿐만 아니라 RNA에 결합하기 때문에 RNase를 넣어서 RNA를 제거해서 배경을 감소시킵니다.
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Filter 튜브: 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap.
출처
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https://en.wikipedia.org/wiki/Cell_cycle_checkpoint
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세오 
