일차 간세포(primary hepatocytes)는 기능적 특성에서 in vitro 간세포보다 in vivo 간세포와 더 유사합니다. 예를 들어, 일차 간세포는 간 생체 검사와 80% 가까이 유사성을 가지지만, HepG2 세포(간암 세포로 간 기능 조사에 널리 사용)는 유전자 발현 프로파일에서 유사성이 50% 이하로 떨어집니다. 그러므로 일차 간세포의 활용은 간 기능과 생리를 조사하는 데 매우 중요합니다. 하지만, 쥐에서 일차 간세포를 분리하는 데 어려움이 있습니다. 예를 들어, 쥐의 작고 얇은 간 문맥(portal vein, PV) 혹은 하정맥(inferior vena cava, IVC) 때문에 cannula 삽입이 어렵습니다. 또한, 간세포 추출 시간이 길어지면 간세포의 양과 품질이 저하됩니다. 그리고, 비효소적 기계적 분리 방법은 심각한 손상으로 인해 추출한 일차 간세포의 생존이 떨어집니다. 이번 연재에서는 쥐의 간에서 일차 간세포 분리와 배양을 위한 2 단계 collagenase 관류(perfusion) 기술을 소개합니다 [1, 그림 1]. 
 

그림 1. 일차 간세포 추출 과정. 출처: [2]. 

추출 방법 

간단히 소개하면, collagenase 관류, 칼슘 킬레이터(calcium chelator) 용액으로 간에 주입, 효소 소화(enzymatic digestion), 그리고 간 실질 조직(hepatic parenchyma)의 기계적 해리를 통해서 쥐의 간으로부터 간세포를 추출합니다. 첫 번째 단계에서, 쥐의 간은 [Ca 2+] 킬레이터 (EDTA)를 포함하는 [Ca 2+] 프리 버퍼와 함께 관류되고, 두 번째 단계에서, 세포-세포외 매트릭스 상호 작용을 가수분해하기 위해 collagenase를 포함하는 완충액과 함께 관류됩니다. 1 단계에서 사용되는 완충액과 달리, 효과적인 collagenase 활성을 위해 2단계 완충액에서 [Ca 2+] 이온의 존재가 필요하며, 그 후 소화된 간은 간 캡슐(liver capsule)과 실질 조직(parenchymatous tissue) 사이에서 더욱 부드럽게 기계적으로 분리합니다. 마지막으로, 결합 조직은 필터링으로 제거되고, 원심분리는 밀도 경사 버퍼(density gradient buffer)를 사용하여 비실적 세포(non-parenchymal cells)와 비생체 간세포(non-living hepatocyte)에서 생존할 수 있는 간세포를 분리합니다.  

간세포 추출 전에 필요한 버퍼를 준비합니다 [노트 1]. 70% 에탄올을 펌프 연결 튜브에 10분간 완전히 흘리고, 증류수로 10분간 펌프 연결 튜브에서 잔류 에탄올을 제거합니다. 쥐를 isoflurane (2 ml) 적신 거즈가 있는 플라스틱 용기에 넣어서 마취합니다 [노트 2]. 쥐를 작업대 위에 복부를 위로 향하게 놓고, 복부 부위에 에탄올 70%를 뿌린 후 날카로운 가위와 집게를 이용하여 진피와 복막을 크게 가로로 절개하여 복강을 엽니다. 그다음 가위와 집게를 이용하여 복부 모든 기관이 완전히 드러날 때까지 복부 층을 수직으로 자릅니다. PV와 IVC가 선명하게 노출될 때까지 내장을 쥐의 왼쪽을 향해 옮깁니다. 24G catheter를 오른쪽 renal vein이 있는 분기점에서 IVC에 삽입합니다 (그림 2). Catheter의 바늘을 제거하고 커넥터(connector)를 이용하여 24G catheter를 관류 관으로 연결합니다[노트 3]. 따뜻한 HBSS (-)로 관류를 시작(4 ml/min)하고, 비장정맥(splenic vein)을 가위로 잘라 내혈을 배출합니다(그림 2, 노트 4). 관류가 잘 되면 간의 색이 옅어지고, 쥐는 마취된 채로 살아있습니다.   

그림 2. 쥐의 간 문맥(portal vein, PV), 하정맥(inferior vena cava, IVC), 비장정맥(Splenic vein). 출처: 본인. 

Collagenase Type X를 포함한 따뜻한 HBSS (+)를 4 ml/min 유량으로 관류합니다 [노트 5]. 5 ml HBSS (+)를 10 cm 플레이트에 넣습니다. 펌프를 멈추기 전에 관류된 간을 잘라내어 간으로 피가 역류하지 않도록 합니다. 종이 타월로 간을 부드럽게 닦아 피를 제거하고, 준비된 플레이트로 옮긴 다음 집게를 이용하여 간을 둘러싸고 있는 얇은 결합 조직층인 간 캡슐을 제거합니다. 집게를 사용하여 parenchymal 조직을 조심스럽게 분산시킵니다. 차가운 15 ml DMEM을 넣습니다. 찢어진 간을 흔들어서 남은 parenchymal 셀을 배지에 풀어주고, 플레이트에 차가운 15 ml DMEM을 추가로 넣습니다. 그다음으로, 100 μm 셀 strainer를 통해 50 ml 튜브에 옮기고 얼음에 보관합니다.  

셀 현탁액을 4°C에서 2분 동안 원심분리(60 x g) 후 진공 흡입으로 상등액을 조심스럽게 제거하고, 10 ml DMEM으로 다시 현탁(resuspend) 합니다. 40% 밀도 gradient 버퍼의 상단에 현탁액을 얇은 층으로 추가하고, 4°C에서 브레이크 없이 10분 동안 원심 분리합니다(800 x g). 상층(DMEM)과 중층(죽은 세포 혹은 non-parenchymal 세포)을 포함한 상등액을 제거하고, 하층(primary parenchymal hepatocytes)은 남겨둡니다. William’s 배지(2-3 ml)로 primary 셀을 현탁하고, 50 ml  튜브로 옮깁니다. 7-8 ml William’s 배지 넣고, 부드럽게 섞은 후 4°C에서 1분 동안 원심 분리합니다(800 x g). 상등액을 조심스럽게 제거한 후 William’s medium을 펠릿 크기에 따라 10 ml에서 30 ml 으로 다시 펠렛을 현탁합니다. 셀 수를 센 후, William’s 배지로 셀을 플레이트에 깔고, 37°C에서 2-3시간 보관 후 10% FBS DMEM 배지로 교체합니다. 이제, 실험 목적에 맞게 일차 간세포를 사용하면 됩니다.  

노트 

1. 40% gradient 버퍼를 준비하는데 한 마리당 15 ml 필요합니다. William's 배지와 DMEM (30 ml/한 마리)를 준비하여 얼음에 보관합니다. HBSS(-) 버퍼 (40 ml/한 마리)를 준비하여 42°C로 water bath에 보관합니다. 0.3 mg/ml collagenase Type X를 포함한 HBSS(+) 버퍼 (40 ml/한 마리)를 water bath에서 42°C에서 30분간 보관합니다. 정맥 주사를 놓을 관류 펌프를 설정하고, 원심분리기를 4°C까지 냉각시킵니다. 70% 에탄올로 가위와 집게를 닦습니다. 

2. 15 mL 튜브를 사용하여 튜브 끝부분에 1 ml의 isoflurane 적신 패드를 눌러서 Nose Cone을 제작합니다. 쥐 콧구멍에 Nose Cone을 더 가까이 또는 멀리 이동하여 마취의 깊이를 조절합니다. 

3. Catheter의 바늘을 제거할 때, cannula의 위치를 조절하여 catheter가 IVC에서 벗어나지 않도록 하고, 관류를 시작하기 전에 기포가 생기지 않도록 조심합니다. 

4. 간에서 멀기 때문에 비장정맥을 절단하는 것이 안전합니다. 

5. 몇 분마다 집게를 사용하여 비장정맥을 10초 정도 잡아서 HBSS (+)가 간의 모든 부분으로 확산하도록 합니다 (그림 2). 

참고 

1. https://review.jove.com/t/58323/isolation-primary-mouse-hepatocytes-for-nascent-protein-synthesis 

2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7580103/