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[실전 실험 프로토콜 101] #13. 화합물의 처리 시간과 농도 결정
생명과학 세오 (2022-08-29)

타깃 유전자에서 특정 화학물 (혹은 약물)의 처리 시간과 농도에 따른 타깃 유전자의 변화를 알아보려고 할 때, 약물 혹은 화합물의 처리 시간과 농도의 범위를 결정하는 것이 중요합니다 (노트 1). 재료 (연구비)와 실험 시간이 무한하다면 여러 농도와 여러 시간 포인트를 이용해서 실험하면 좋겠지만, 현실은 실험 시간과 연구비는 제한되어 있습니다. 다행히 비슷한 실험을 한 논문을 찾을 수 있다면 다행이지만, 그렇지 않은 경우는 직접 실험을 통해서 화학물의 처리 시간과 농도의 범위를 결정해야 합니다. 이를 다 무시하고, 무작위로 특정 시간과 농도를 이용해서 실험하게 되면, 그 실험을 통해서 올바른 결과를 얻을 가능성이 적습니다.  

셀 라인 (Cell line)을 이용한 실험에서 약물 혹은 화합물의 처리 시간과 농도를 결정하기 위해 24 웰-플레이트 (24 well-plate)를 이용합니다. 24 웰-플레이트에서 3 웰을 같은 농도와 시간으로 실험하면, 24 웰-플레이트에서 4개의 농도와 2개의 처리 시간을 테스트할 수 있습니다 (그림 1). 24 웰-플레이트를 4 개를 이용하면, 16 개의 농도와 8 개의 처리 시간을 조사할 수 있습니다. 하지만, 쥐를 이용한 실험에서는 셀 라인을 이용하는 실험과 같이 디자인하기에는 연구비와 시간적인 제한 때문에 어렵습니다. 이번 연재에서는 쥐를 이용한 실험에서 특정 화합물의 처리 시간과 농도를 결정하는 방법을 소개합니다.    
 

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그림 1. 24 웰-플레이트 (24 well-plate)에서 화합물의 처리 시간과 농도를 결정. 24 웰-플레이트에서 3 웰을 같은 농도와 시간으로 실험 (4개의 농도와 2개의 처리 시간을 테스트, 4 [농도] x 2 [시간] x 3 [웰] = 24) [출처: 본인] 


실험 방법 

인간의 타깃 유전자를 포함하고 있는 돌연변이 쥐에 특정 화합물을 투여했을 때, 타깃 유전자의 스플라이싱에 끼치는 영향을 알아보는 실험을 디자인합니다. 먼저 논문을 검색해서 사용하고자 하는 화합물의 농도를 먼저 조사합니다. 검색한 결과 몇 개의 논문에서 화합물이 여러 농도로 다른 종류의 쥐에게 처리한 실험을 찾았습니다. 결과들을 표 형식으로 정리하고, 그중 한 농도 (70 mg/kg)를 선택합니다. 다음으로 70 mg/kg의 농도에 타깃 유전자의 스플라이싱에 대한 영향을 알아보기 위해 12시간 간격 (0 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간)으로 시간 포인트를 설정했고, 추가로 0 시간과 12시간 사이에 8시간을 추가합니다 (그림 2A, 노트 2).  

돌연변이 쥐 조직 중 먼저 간에서의 타깃 유전자의 스플라이싱을 조사합니다. 70 mg/kg 농도에서 8 시간 처리 후 타깃 유전자의 스플라이싱에 영향을 끼쳤고, 12 시간 처리는 8 시간 처리와 비슷한 결과를 보입니다. 24 시간 처리 후, 70 mg/kg의 농도에서 타깃 유전자 스플라이싱에 강한 영향을 보입니다. 타깃 유전자 스플라이싱의 이차적인 영향을 피하고자, 24 시간 처리를 기준으로 화합물의 농도 실험을 디자인합니다. 24 시간 동안 화합물의 농도를 결정하기 위해 5 개의 농도 (0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg)로 실험을 계획합니다 (그림 2B, 노트 3). 25 mg/kg 농도에서 24 시간 처리 후, 타깃 유전자의 스플라이싱이 영향을 받습니다. 화합물의 여러 처리 시간과 여러 농도 실험을 통해, 70 mg/kg 농도를 24 시간 처리하면 간에서 타깃 유전자의 스플라이싱이 영향을 가장 잘 관찰할 수 있습니다. 이 결과를 바탕으로 돌연변이 쥐의 다른 조직 (뇌, 근육, 신장, 폐, 고환 등)에서 특정 화합물의 타깃 유전자의 스플라이싱의 영향을 알아보기 위해 특정 화합물의 처리 시간 (24 시간)과 농도 (70 mg/kg)를 결정합니다.   

 

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그림 2. 화합물의 시간과 농도 결정. A. 돌연변이 쥐의 간에서 여러 농도에서 24 시간 처리 후, 타깃 유전자 스플라이싱의 영향. B. 돌연변이 쥐의 간에서 70 mg/kg 농도에서 처리 시간에 따른 타깃 유전자 스플라이싱의 영향. [출처 1] 

 

노트 

  1. 이번 연재에서는 특정 화합물의 처리 시간과 농도에서 타깃 유전자의 RNA 스플라이싱에 관한 변화를 관찰하는 실험을 소개하고 있습니다. 특정 화합물의 처리 시간과 농도를 결정하는 것은 다른 목적을 가진 여러 실험에서 꼭 필요한 과정입니다. 

  1. 화합물을 만들 때 미리 만들어 두지 않고, 실험을 하기 바로 전에 만드는 것이 좋습니다. 미리 만들어 두면 보관하는 과정 (예, 얼리고 녹이는 과정)에서 실험에 영향을 줄 수 있습니다. 

  1. 화합물의 여러 농도를 만들 때, 화합물을 특정 농도의 스탁으로 먼저 만들고, 스탁을 농도에 맞게 희석 (예, 1:10, 1:100, 1:1,000 등)을 한 다음, 사용하는 화합물의 볼륨이 비슷하게 만듭니다. 이렇게 함으로써 아주 적은 볼륨 (예, 0.1 μl)을 넣을 때 생기는 파이펫 (pipette)으로 인한 에러를 줄일 수 있습니다.   

 

출처 

  1. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0154390 

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세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)

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