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유전자를 절단하지 않아도 염기 교정이 가능한 초소형 고효율 유전자가위 기술 개발
Bio통신원(한국생명공학연구원)
- 유전자가위의 크기를 대폭 줄여 단일 아데노연관바이러스로 전달 가능한 초소형 염기교정 기술 개발…유효성과 안전성 동시에 갖춰
- DNA 절단 없이 염기 교정이 가능하여 단일 염기변이 유전질환 치료제 개발에 활용 기대
국내 연구진이 체내 다양한 장기에 보낼 수 있는 초소형 염기 교정 유전자가위를 개발했다.
한국생명공학연구원 유전자교정연구센터 김용삼 박사팀과 연구원 창업기업인 ㈜진코어(대표 김용삼)는 교정효율을 대폭 높인 초소형 유전자가위 기술 개발에 성공하였다고 밝혔다.
유전자가위 기술은 유전 정보가 들어있는 유전체에서 특정 염기 서열을 인식한 후 해당 부위의 DNA를 제거 또는 삽입하거나 대체하는 기술로, 2020년 노벨화학상을 받은 크리스퍼(CRISPR) 기술이 가장 대표적이다.
크리스퍼 기반의 유전자가위는 크게 절단해야 할 부위를 알려주는 가이드 RNA와 실제 DNA를 절단하는 효소로 구성되며, 이를 전달체에 실어 필요한 곳까지 운반하여 유전자를 편집하게 된다.
전달체로는 아데노연관바이러스(AAV, Adeno Associated Virus)나 지질 나노입자(LNP, Lipid Nano Particle)를 사용한다.
아데노연관바이러스 전달체는 다양한 체내 장기에 유전물질을 전달할 수 있지만, 현재까지 개발된 유전자가위의 크기가 큰 탓에 크리스퍼 유전자 편집 도구를 전달하는 데 기술적 한계가 있었다.
지질 나노입자의 경우, 크기가 큰 유전자의 전달체로 이용할 수 있지만 도달할 수 있는 체내 장기가 간 정도로 매우 한정적인 단점이 있다.
유전자치료의 혁명으로 일컬어지는 유전자가위 기술은 가파른 성장세에도 불구하고, 교정 성공률과 안전성 등에서 한계가 있다고 지적되고 있다.
이러한 단점들을 극복하고 효율과 정확성을 충족한 기술을 확보하기 위해 전 세계적으로 다양한 연구가 진행되고 있는데, 그중 하나가 염기 교정 유전자가위(Base Editor) 이다.
기존 절단 기반의 유전자가위는 유전질환 원인의 50%에 해당하는 것으로 알려진 점 돌연변이(point mutation)의 교정에 적용하기가 어려웠다.
점 돌연변이는 유전자 서열 중 한 개의 염기가 바뀌어 유전질환을 유발하는 것으로 해당 유전자를 제거하기보다는 다른 유전자로 바꾸어 주는 염기 교정이 치료에 보다 효과적이다.
이에 연구팀은 아데노연관바이러스를 전달체로 이용하면서도 염기 교정이 가능하도록 유전자 교정 효율을 대폭 높인 유전자가위 기술을 개발하였다.
TnpB라는 단백질의 유전자 편집 도구로서의 적용 가능성을 발견하여 이를 DNA 절단효소로 활용하고, 기존에 개발한 가이드 RNA와 결합하여 아데노연관바이러스에 실을 수 있는 유전자가위를 개발하였다. 이를 통해 그동안 문제가 되어 왔던 제한적인 전달 크기의 문제를 극복하였으며, DNA 절단 없이도 유전자 교정이 가능하게 하였다.
또한, 두 개의 가이드 RNA를 사용할 수 있도록 하여 다중 타겟을 동시에 염기 교정할 수 있게 하였으며, 동일한 타켓인 경우 교정효율을 대폭 향상시켰다.
개발된 기술은 실제 동물모델에서 아데노연관바이러스를 통한 전달이 가능하고, 원하는 부위에서 교정이 가능함을 확인하여 기존의 유전자가위로 접근할 수 없었던 염기변이에 의한 유전질환 치료에 대한 적용 가능성을 높였다.
특히, 해당 연구팀과 진코어는 2021년 DNA를 절단할 수 있는 초소형 유전자가위 기술인 CRISPR-Cas12f GE 시스템을 개발하여 세계적 저널인 ‘네이처 바이오테크놀로지(Nature Biotechnology, IF 54.908)에 게재한 바 있으며,
이번 DNA 절단을 일으키지 않으면서도 교정을 할 수 있는 염기 교정 유전자가위 기술을 개발함으로써 고효율 크리스퍼 유전자가위 기술을 확보할 수 있게 되었다.
연구책임자인 김용삼 박사는 “유전자치료제 개발에 사용할 수 있는 가장 적합한 기술인 초소형 유전자가위 기술들을 개발했고, 특히 이번에 개발한 초소형 염기 교정 유전자가위는 유전질환의 원인 중 50% 이상을 차지하는 단일 염기변이를 교정할 수 있는 기술”이라며,
“유전자치료를 위한 다양한 유전자가위 기술 중의 하나로 치료제 개발에 기여할 수 있는 중요한 기술이 되기를 기대한다”라고 밝혔다.
한편, 이번 연구는 바이오 분야의 세계적인 저널인 Nature Chemical Biology(IF 16.174) 2022년 8월 2일자 온라인 판에 게재되었으며,
(논문명 : Hypercompact adenine base editors based on transposase B guided by engineered RNA / 교신저자 : 한국생명공학연구원 김용삼 박사 / 제1저자 : ㈜진코어 김도연․정유희 박사)
산업부 알키미스트프로젝트, 과기부 연구성과사업화지원사업과 우수신진연구, 농진청 차세대 농작물 신육종기술 개발사업과 생명연 주요사업의 지원으로 수행되었다.
연 구 결 과 개 요
연구배경
○ 박테리아의 후천적 면역시스템을 통해 발견된 CRISPR 시스템은 유전자 교정 기술에 큰 발전을 야기하였다. CRISPR 시스템을 이용한 유전자 교정 기술은 그 편리성과 효율성을 바탕으로 기존의 유전자 교정 기술보다 세포 및 다양한 동물모델에서의 유전자 교정에 필요한 시간 및 비용의 단축, 외래 유전물질의 도입 없는 작물의 형질전환 등을 가능케 하였다. 또한 전 세계적으로 전임상 및 임상실험을 통해 새로운 질병 치료제로서의 가능성을 보여주고 있다.
○ 특히, CRISPR 시스템을 통한 효율적인 질병 치료제를 개발하기 위해서는 유전자가위 유전자를 원하는 체내에 전달하는 것이 필수적이다. 체내에 유전자를 전달하는 방법 중 AAV(Adeno-associated virus)를 이용하는 방법은 높은 전달 효율과 안정성 및 낮은 면역원성/독성의 장점을 지닌다. 하지만 AAV에 삽입될 수 있는 유전자의 크기가 4.7kb로 제한이 있어 대표적인 크리스퍼 유전자가위인 CRISPR-Cas9 기술은 유전자치료제로 개발되기 어려움이 있다.
○ 최근 유전자치료제 개발이 본격화되면서, AAV로 전달이 가능한 작은 유전자가위의 필요가 대두되었고, 다양한 연구팀에서 초소형 유전자가위 기술 개발에 매진하고 있다.
○ 2021년 본 연구팀은 Cas9의 1/3 크기를 가진 초소형 유전자가위 기술 Cas12f1 시스템을 개발하여 세계적 저널에 논문을 투고하였다. 연구팀은 초소형 CRISPR-Cas12f1 시스템의 핵심 구성물질인 가이드 RNA를 엔지니어링 함으로써 교정효율이 없던 Cas12f1 시스템을 Cas9 이상의 효율을 갖도록 개발하였다.
연구내용
○ TnpB 단백질은 유전자가위에 대한 역할에 대해서 보고된 적이 없는 단백질임. Cas12계열의 조상 단백질로 구조적으로 Cas12f1과 유사한 서열을 가지고 있는 TnpB를 발견하여 기존에 개발한 엔지니어링된 가이드 RNA(augment RNA)를 적용이 가능함을 확인하였다.
○ TnpB 시스템에서 높은 DNA 절단 효율을 확인하여 유전자가위 기술로 활용할 수 있음을 증명하였다. 단백질 엔지니어링을 통하여 절단 활성을 없앤 Dead TnpB를 개발하였고 아데닌 탈아미노효소(Adenine deaminase)를 결합하여 아데닌 염기를 교정할 수 있는 아데닌 염기 교정 유전자가위 기술을 개발하였다.
○ 개발한 초소형 염기 교정 시스템은 작은 사이즈로 AAV바이러스 전달이 가능할 뿐 아니라 두 개의 가이드 RNA를 사용할 수 있어 다중타겟이 가능하다. 실제 2개의 가이드 RNA를 사용하여 동시에 2개의 타겟에 대해 높은 효율로 염기 교정이 가능함을 입증하였다.
○ 단백질 구조분석을 통한 TnpB 엔지니어링을 하여 PAM 제한성을 극복한 TnpB PAM variant를 개발하여 기존의 TTTR PAM이외의 다양한 PAM 서열에서도 활성을 확인하였다.
○ 또한, 동물모델에 적용하여 원하는 조직으로 전달이 가능함을 확인하였으며, 전달된 조직에서 원하는 염기 교정이 높은 효율로 일어남을 입증하여 AAV를 사용하여 개발해야 하는 유전자치료제로써 적용이 가능한 기술임을 입증하였다.
○ 기존 아데닌 염기 교정 유전자가위 기술의 우려 사항이었던 RNA 오프타겟을 동물모델에서 비교검증을 통하여 실제 오프타겟이 현저히 적은 수준으로 발생함을 증명하였으며, 25개의 유전자를 대상으로 염기 교정 효율 검증을 통해 광범위한 서열에 적용 가능한 기술임을 입증하였다.
연구성과의 의미
○ 초소형 염기교정 유전자 가위 기술을 통한 유전자치료 기술 연구 발전
- 즉, 본 연구의 성과는 TnpB기반의 초소형 염기 교정 유전자가위를 최초로 개발하여 염기 교정효율을 보임으로써 유효성과 안전성을 갖춘 초소형의 유전자 교정 기술을 개발한 데 의의가 있다. 또한 기존에 큰 크기로 전달에 어려움이 있었던 염기 교정기술을 전달할 수 있게 하여 점 돌연변이에 의한 유전질환의 치료전략을 가능하게 하였다. 실제, 동물모델에서 초소형 염기 교정 시스템의 전달 및 원하는 조직에서의 염기 교정효율을 입증하여 AAV 전달 방법을 이용한 유전자치료제 개발의 가능성을 제시하고 있다.
- 특히, 점 돌연변이에 의한 유전질환은 밝혀진 유전질환의 60%이상을 차지하는데 개발된 본 기술을 활용하여 유전질환의 50% 이상을 치료할 수 있어 기존의 접근하기 어려웠던 유전질환에 대한 치료제 개발에 큰 기여를 할 것으로 기대된다.
연 구 결 과 문 답
이번 성과 뭐가 다른가
1. 기존 염기 교정 유전자가위는 단일 AAV바이러스로 전달이 불가능해서 바이러스 전달이 필요한 유전자치료제로 개발하기 어려웠으나 본 연구팀이 단일 AAV 전달이 가능한 초소형 아데닌 염기교정 유전자가위를 개발하여 동물에서 원하는 조직 전달 및 교정효율을 증명함
2. 뿐만 아니라 두 개 이상의 가이드RNA를 사용할 수 있어서 다중 타겟이 가능한 염기 교정 유전자가위 기술임을 증명함
어디에 쓸 수 있나
1. 점 돌연변이에 의한 유전잘환의 50%이상을 치료할 수 있음
2. AAV에 전달이 가능하여 In vivo 유전자치료제 개발에 활용이 용이함
실용화까지 필요한 시간은
본 연구는 김용삼 박사가 창업한 (주)진코어와 공동연구를 통하여 개발한 기술로 8월중 생명연 지분을 기술이전 완료하여 진코어에서 유전질환 치료제로 개발하여 실용화할 계획임
실용화를 위한 과제는
1. 국내에는 유전자가위 기반의 유전자치료제가 전혀 없어 비임상/전임상 허가 기준을 새롭게 마련해야 하는 이슈가 존재
2. 치료제로서의 실용화를 위해서는 단기가 아닌 장기적인 연구 지원이 필요함
연구를 시작한 계기는
2021년 유전자치료제로 사용하기 가장 이상적인 초소형 유전자 가위 기술을 최초로 개발하였음. 개발한 초소형 유전자가위 기술은 DNA절단에 활용할 수 있는 기술이었는데, 염기변이 중 점 돌연변이에 의한 유전질환을 치료하기에는 절단이 없이 염기 교정이 가능한 기술이 필요했음. 초소형 유전자가위 기술 개발 노하우를 가지고 새로운 초소형 염기 교정 유전자가위 기술을 개발하고자 하는 욕구가 연구의 시작이었음
에피소드가 있다면
본 연구를 진행하던 중 자연계에 있는 Cas12f1의 조상격인 TnpB에 대하여 우리의 가이드RNA 가 높은 효율로 작동함을 확인함. TnpB 에대하여는 기존에 학계에서 한번도 유전자가위로써 증명되지 않았던 단백질이라 더욱 흥미로웠음. 논문을 투고하기 직전 Feng zhang 연구팀에서 Cas의 조상 단백질에 대한 논문을 발표하였고 TnpB를 사용하고 있는 우리 연구는 시기적으로 발표하기 적기라고 판단되었음. 세계적으로 유전자가위 기술 분야는 초소형 유전자가위 기술 방향으로 발전하고 있고 유전자치료제 개발에 주목하고 있음을 느낌
꼭 이루고 싶은 목표는
기존 연구가 많이 되어있는 Cas9 기술보다 본 연구의 초소형 유전자가위 시스템이 더 다양하고 많은 분야에 적용되기 위해 Cas12f1, TnpB 기술을 다양한 유전자가위 기술로 발전시켜 실제 유전자치료제로 개발하여 실용화 하는 것
신진연구자를 위한 한마디
본 연구성과는 다양한 초소형 유전자가위 기술을 개발하여 치료제에 활용하고자 하는 필요와 노력의 결과로 얻게 되었음. 다양한 시도를 해보고 지금은 안되는 것처럼 보여도 꾸준히 연구에 매진한다면 좋은 결실을 얻을 수 있을 것이라 생각함.
그림 1. 초소형 유전자가위 및 염기교정 기술
기존 유전자가위(CRISPR-Cas9)의 큰 사이즈로 인한 아데노연관바이러스 전달의 어려움과 이를 극복한 초소형 유전자가위 기술(TaRGET)* 및 이를 활용한 이번에 개발에 성공한 초소형 염기교정 기술(TaRGET-ABE)
* 연구팀이 작년에 개발한 CRISPR-Cas12f GE 시스템(Nature Biotechnology, 2021.9)
그림 2. 초소형 염기 교정 유전자가위 모식도
개발한 초소형 염기 교정 유전자가위의 전체 모식도와 교정이 가능한 window를 나타낸 그림.
그림 3. 초소형 염기 교정 유전자가위의 동물모델 적용
개발한 초소형 염기 교정 유전자가위의 동물모델(마우스)에 적용한 모식도
GFP를 통하여 원하는 조직에 전달을 확인하였으며, 조직 분석을 통하여 실제 염기 교정이 발생함을 확인함.
그림 4. TnpB 기술의 효율 비교
a) 본 연구팀이 개발한 augment RNA를 사용한 기술과 canonical gRNA를 사용하였을 때 효율 차이 비교
b) TnpB 종류별로 효율을 비교한 데이터, 본 연구팀이 개발한 TaRGET 기술이 월등히 효율이 높음을 증명함
그림 5. 초소형 염기교정 유전자가위 오프타겟
기존에 발표된 염기 교정 유전자가위 기술과 개발한 초소형 염기 교정 유전자가위 기술의 RNA 오프타겟을 비교한 데이터
실제 원하지 않는 RNA 에디팅(RNA 오프타겟)이 발생하지 않음을 증명함
본 기사는 네티즌에 의해 작성되었거나 기관에서 작성된 보도자료로, BRIC의 입장이 아님을 밝힙니다. 또한 내용 중 개인에게 중요하다고 생각되는 부분은 사실확인을 꼭 하시기 바랍니다.
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