‘스테이블 셀라인 만들기’ 편 [출처 1]에서 endogenous 유전자 단백질과 과발현 타깃 유전자 단백질과 구별하기 위해서, 타깃 유전자 단백질에 FLAG와 HA 태그를 넣었습니다. 이번 편에서는 과발현 한 타깃 유전자 단백질과 결합하는 단백질을 찾는 방법에 대해 알아보겠습니다 [노트 1, 그림 1].

샘플 준비

준비해 놓은 라이시스 버퍼 (lysis buffer)에 실험 당일 PMSF, Protease inhibitase, DTT, NaF, Beta-glycerophosphate, Na3VO4를 넣습니다 [노트 2]. 셀 펠릿 (cell pellets)을 모으기 위해 15 cm 플레이트에서 배지를 없애고, 1X PBS로 플레이트를 두 번 워싱을 합니다. 셀 스크레퍼로 (cell scraper) 긁어서 셀을 1.5 ml 튜브에 모은 다음, 1,200 rpm으로 2분 동안 돌려서 셀 펠릿만 모읍니다. 1.5 ml 튜브에 셀 펠릿을 모았을 때 셀 펠릿이 대략 100 μl 정도의 눈금이 되면, 미리 준비한 라이시스 버퍼를 셀 펠릿의 7-8배 정도 넣어줍니다 [노트 3]. 셀 종류에 따라 100 μl 정도의 눈금보다 적게 모이기도 합니다. 라이시스 버퍼를 넣은 셀 펠릿을 얼음에 30분 보관합니다. 그런 다음 튜브를 4°C에서 13,000 rpm으로 10분 돌립니다. 셀 펠릿으로 추출한 단백질 중 70 μl 정도를 뽑아서 추출한 단백질을 정량하고, 나머지는 input으로 사용합니다. Immunoprecipitation (IP) 실험을 바로 하지 않으면 추출한 단백질을 -80°C에 보관합니다.

그림 1. Co-IP assay 요약. Couple Antibody = anti-FLAG beads, Antigen = 과발현 타깃 단백질 (FLAG와 HA 태그), Protein interacting with Antigen = 과발현 타깃 단백질과 결합하는 단백질 [출처 2].

Immunoprecipitation (IP)

다음 날, preclearing을 하기 위해 추출한 단백질을 울트라 스핀을 이용해서 4°C에서 100,000 g으로 15분 동안 돌립니다 [노트 4]. 그리고, 추출한 단백질 2 mg을 protein A beads와 콜드룸에서 한 시간 정도 돌립니다. 이때 추출한 단백질과 protein A beads가 들어 있는 튜브의 뚜껑을 제대로 닫아야 합니다. 그렇지 않으면 단백질이 샐 수 있습니다. 한  시간 후 튜브를 6,000 rpm으로 4°C에서 1분 돌립니다. Protein A beads를 남기고 추출한 단백질을 새로운 튜브로 옮겨서 anti-FLAG beads를 넣고 콜드룸에서 3시간 (혹은 오버나잇)으로 돌립니다 [노트 5]. 3시간 후, 튜브를 6,000 rpm으로 4°C에서 1.5분 돌립니다. Anti-FLAG beads를 단계적으로 워싱합니다. 예를 들어, 420 mM NETN lysis buffer로 두 번 워싱을 하고, 150 mM NETN lysis buffer를 이용하여 한 번 원싱을 하고, 마지막으로 1X PBS로 두 번 워싱합니다. 워싱 후, 1.5 ml 튜브에 anti-FLAG beads와 1X PBS 20 μl 정도만 남기고(anti-FLAG beads의 손실을 줄임), loading buffer를 넣고 100°C에서 5분 끓인 다음 7,000 rpm으로 30초 돌린 다음 anti-FLAG beads를 제외하고 용액만 따서 젤에 로딩합니다.

그림 2. 엑스레이 필름 이용한 Co-IP 결과 [출처: 본인]

결과 확인

젤을 러닝한 후 젤을 멤브레인에 트랜스퍼하고, 5% blocking 버퍼로 실온에서 1시간 인큐베이션합니다. 멤브레인을 타깃 사이즈로 양쪽 단백질 마커를 이용하여 자릅니다. 1% blocking 버퍼에 1차 안티바디 (예를 들어, anti-HA 그리고 과발현 타깃 단백질과 결합하는 단백질 안티바디)를 넣고 4°C에서 오버나잇으로 보관합니다 [그림 1]. 다음 날, 워싱 버퍼로 5분간 3번 워싱을 하고, 1% blocking 버퍼에 2차 안티바디를 넣고 실온에서 1시간 처리합니다. 1시간 후, 멤브레인을 워싱 버퍼로 5분간 3번 워싱합니다. 적합한 시약 (예를 들어, ECL)을 가지고 멤브레인을 5분 처리합니다. 웨스턴 블랏 시그널이 약한 경우는 강도가 좋은 시약으로 다시 처리합니다. 웨스턴 블랏 시그널을 확인할 때 ChemiDoc 혹은 암실에서 엑스레이 필름을 사용합니다 [노트 6, 그림 2].

노트

1. 면역 침강 (Immunoprecipitation, IP) 실험을 하기 전에 논문 검색을 통해 비슷한 IP 실험을 찾아서, 프로토콜을 만드는 것이 도움이 됩니다.
2. 라이시스 버퍼에 넣는 시약과 역할

3. 라이시스 버퍼가 부족하면 셀 펠릿이 젤리처럼 되는 경우도 있습니다. 이럴 경우, 울트라 원심 분리기로 돌립니다.
4. 울트라 원심 분리기를 사용하기 전에 튜브의 무게가 같도록 밸런스를 맞춰야 합니다.
5. IP에 사용하는 단백질량과 인큐베이션 시간은 실험을 통해 결정합니다.
6. 엑스레이 필름을 사용 시 웨스턴 블랏의 시그널이 강할 때는 필름을 여러 장 겹쳐서 사용하고 노출 시간을 조절하여 원하는 강도의 밴드를 얻을 수 있습니다.

출처

1. https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=335713&Page=1
2. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/co-immunoprecipitation-co-ip.html