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뉴스 생명과학
미토콘드리아 DNA, 더 다양하고 정확히 교정한다
Bio통신원(기초과학연구원)
- 새로운 핵 및 미토콘드리아 DNA 염기교정 기술 개발-
- 미토콘드리아 질환 연구 및 치료에 활용 기대 -
기초과학연구원(IBS) 유전체 교정 연구단(단장 김진수) 연구팀은 새로운 핵 및 미토콘드리아 DNA 염기교정 기술인 ‘징크핑거 염기교정효소(ZFD, Zinc Finger Deaminase)’개발에 성공했다.
미토콘드리아는 에너지를 만들어내는 세포 내 소기관이다. 미토콘드리아 DNA에 변이가 일어나면 시력·청력 뿐 아니라 중추신경계·근육·심장 등에 치명적인 결함을 야기한다. 미토콘드리아 질환은 5,000명 중 한 명 꼴로 발생하는 비교적 흔한 유전질환이다. 그러나 현재 유전체 교정 기술로 널리 활용되는 크리스퍼 유전자가위(CRISPR-Cas9)로는 미토콘드리아 DNA 교정이 불가했다. 2020년 세균 유래 DddA 탈아미노 효소와 탈이펙터 단백질을 이용한 새로운 염기교정효소 DdCBE가 개발되었다. 이는 유일한 미토콘드리아 DNA 염기교정 기술이었다.
연구진은 기존의 DddA 탈아미노 효소와 징크핑거 단백질(Zinc finger protein)을 융합하여 새로운 핵 및 미토콘드리아 DNA 염기교정 기술인 ‘징크핑거 염기교정효소’를 개발했다. 징크핑거 단백질은 기존에 사용된 탈이펙터 단백질보다 크기가 절반 이상 작아 다양한 구조로 디자인할 수 있고 활용이 용이하다. 세포투과 능력이 있어 핵산 없이도(nucleic acid-free) 유전체 교정이 가능한 장점도 있다.
연구진은 우선 24개의 ZFD 구조 쌍을 제작하여 최적의 구조를 찾아냈다. 이어 ZFD를 이용해 핵 및 미토콘드리아 DNA의 시토신/구아닌(C/G) 염기쌍을 티민/아데닌(T/A)으로 치환하는 데 성공했다. 개발한 ZFD나 ZFD-DdCBE 하이브리드(ZFD-DdCBE hybrid)를 사용하면, 기존의 DdCBE만으로는 만들 수 없었던 변이를 다양하게 유도할 수 있다. 나아가 징크핑거 단백질을 개량하거나 전달 형태에 변화를 줌으로써 비표적 효과(off-target)를 개선하여 정확성을 획기적으로 높였다.
김진수 단장은 “앞으로 미토콘드리아 질환을 비롯한 난치병 연구 및 치료 뿐 아니라 식물의 엽록체 DNA 등 다른 소기관의 DNA 교정에도 다양하게 활용될 것”이라며 “ZFD는 작은 크기 덕분에 세포 전달에 많은 이점이 있는 만큼 여러 기술들과 접목하여 활용도가 클 것으로 기대된다”고 전했다.
이번 연구결과는 네이처 커뮤니케이션즈 (Nature communications, IF 14.919) 1월 18일자 온라인 판에 게재되었다.
논문명/저널명
Nuclear and mitochondrial DNA editing in human cells with zinc finger deaminases / Nature communications
저자정보
Kayeong Lim*,Sung-Ik Cho* and Jin-Soo Kim#
*공동 제1저자, #교신저자
연구내용 보충설명
미토콘드리아는 세포에 필요한 에너지를 생산하는 세포 소기관이다. 미토콘드리아의 DNA에 생긴 돌연변이는 다양한 미토콘드리아 질환을 일으킨다고 알려져 있다.
크리스퍼-카스 CRISPR-Cas9)를 기반으로 하는 다양한 염기 편집(Base Editing) 기술들은 핵 DNA를 효율적으로 염기 교정할 수 있어서 널리 활용되어 왔다. 그러나 필수 구성 요소 중 하나인 가이드 RNA가 미토콘드리아 내부로 전달이 어려워 미토콘드리아 DNA 염기 편집에는 활용될 수 없었다.
최근 DNA 이중나선에 있는 시토신에 작동하는 시토신 탈아미노효소(DddA)가 발견되어 이를 DNA 결합 단백질과 연결시킨 새로운 염기 편집 도구 DdCBE(DddA-derived Cytosine Base Editor)가 개발되었다. DdCBE는 RNA를 구성요소로 사용하지 않아 미토콘드리아 DNA 염기 교정이 가능했다.
DdCBE는 DNA 결합 단백질로 탈이펙터 단백질을 사용했지만, IBS 연구진은 징크 핑거 단백질을 사용하여 핵산 및 미토콘드리아 DNA 염기 편집을 할 수 있는 징크핑거 염기교정효소 (ZFD, Zinc Finger Deaminase)를 새롭게 개발하였다. 추가적인 염기편집 도구가 개발됨에 따라 미토콘드리아 질환의 연구나 치료에 활용할 수 있는 범위가 넓어질 것으로 기대하고 있다.
연구 이야기
[연구 배경]
2020년 미국의 David Liu 교수와 Joseph Mougous 교수 연구팀이 개발한 DdCBE는 미토콘드리아 DNA 염기를 교정할 수 있는 최초이자 유일한 염기 편집 도구다. IBS 연구진은 미토콘드리아 질환 연구 및 치료 등에 다양하게 활용할 수 있는 새로운 형태의 염기 편집 도구 개발을 위해 연구에 착수했다.
[어려웠던 점]
최적으로 작동하는 ZFD의 구조적 형태를 찾기 위해 다양한 형태의 ZFD 쌍을 만들고, 개별 ZFD 쌍 사이의 간격을 다양화하여 이들 조합으로 수차례 세포 실험을 수행했다. 그 결과 전반적으로 높은 효율을 보이는 ZFD 형태를 찾고, 핵 및 미토콘드리아 DNA에서의 염기 편집이 가능함을 검증할 수 있었다.
[주목할 점]
ZFD는 기존의 염기편집 도구로는 도입할 수 없었던 미토콘드리아 및 세포 소기관의 DNA 염기를 편집할 수 있는 기술로, 현재까지 다룰 수 없었던 많은 질병들에 해결책을 제시할 수 있다. 또한 기존의 DdCBE와는 다른 유전자 편집 패턴을 가지고 있기 때문에 DdCBE와 더불어 질병의 정확한 유전자 편집이 가능하다.
[향후 연구계획]
미토콘드리아 DNA 염기 편집 도구는 최근에야 개발됐고, 개발된 도구의 수도 많지 않다. 앞으로 ZFD 같은 새로운 DNA 염기 편집 도구를 개발하고, 더욱 정교하게 개량하여 적용 범위를 동식물에도 넓히고자 한다.
[그림1] ZFD 구조 최적화
(왼쪽 그림) ZFD는 한쌍으로 제작하여 사용할 수 있다. 가장 효율적으로 작동하는 ZFD의 구조를 찾기 위하여, 1) 분할 시토신 탈아미노효소(split DddA)의 분할 위치, 2) 분할 시토신 탈아미노효소와 징크핑거 어레이의 간의 연결의 방향성, 3) 시토신 탈아미노효소와 징크핑거 어레이를 연결할 때 사용하는 linker의 길이를 다양하게 구성한 24개의 ZFD 구조 쌍을 제작하였다. (오른쪽 그림) 개별 ZFD 구조 쌍에 따라 도입된 염기 교정 효율을 조사하여 효율이 높은 ZFD의 구조적 조건을 결정할 수 있었다.
[그림2] 세포 내 핵 및 미토콘드리아 DNA 염기교정
세포 내 핵 및 미토콘드리아 DNA를 표적으로 하는 다양한 ZFD 쌍을 제작하였다. ZFD는 CC구조와 NC구조로 디자인 할 수 있어서 다양한 구조적 방향성으로 제작할 수 있다는 장점이 있다. ZFD는 핵 DNA에서 최대 60%, 미토콘드리아 DNA에서 최대 30%의 효율로 시토신/구아닌(C/G) 염기쌍을 티민/아데닌(T/A)으로 치환할 수 있음을 확인하였다.
[그림3] ZFD-DdCBE 하이브리드
미토콘드리아 DNA의 비슷한 부위를 표적으로 하는 ZFD(파란색)와 DdCBE(초록색)를 따로 또는 함께 사용해 유도된 염기 편집의 패턴을 살펴보았다. 기존의 DdCBE와 비교했을 때, ZFD나 ZFD-DdCBE 하이브리드(ZFD-DdCBE hybrid)는 다른 위치와 범위에서 염기치환을 일으키는 것을 관찰하였다. ZFD를 사용하면 이전에는 만들 수 없던 염기 편집 패턴을 만들 수 있다는 의미다.
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