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[실전 실험 프로토콜 101] #8. 유전자 발현과 microRNA 발현 측정
생명과학 세오 (2021-12-27)

PCR은 최종 산물을 이용하는 반면에, Real-time PCR (RT-PCR) 혹은 qPCR은 실시간 (real-time)으로 PCR product의 증폭을 모니터 할 수 있습니다 (노트 1). 다시 말해 qPCR은 정량 (Quantitation)이 가능합니다. PCR 1 사이클 (cycle)이 진행되면 product가 이론상 2배씩 증가합니다 (2^N). qPCR에서 정량을 모니터 하기 위해서 형광 (SYBR과 TaqMan probe)을 이용합니다 (그림 1, 노트 2). qPCR은 타깃 유전자 시퀀스가 필요해서 Microarray 혹은 RNA-Seq 후 관심 있는 유전자 발현 혹은 microRNA 발현을 확인하는 데 사용합니다.

프라이머 (Primer) 디자인

qPCR은 정량을 모니터 하는 것이 목적이기에 타깃 사이즈를 70-200 bp 정도로 합니다. 프라이머를 디자인하는 간단한 방법은 이미 알려진 프라이머 디자인 사이트 중에서 이용하면 됩니다 [PrimerBank; 출처 1]. 개인적으로는 직접 프라이머 디자인을 하는 것을 선호하는데, 직접 프라이머를 디자인할 때 아래의 내용을 주의하며 디자인을 합니다. 프라이머가 붙는 위치의 엑손 (exon)이 스킵핑 (skipping)이 일어나지 않아야 합니다. 프라이머가 붙는 위치의 엑손이 스킵핑이 일어나는 아이소폼 (isoform) 일 경우는 모니터에서 제외되기 때문에 타깃 유전자의 전체 발현량을 정확하게 측정할 수 없습니다. 또한, 5′ 프라이머와 3′ 프라이머가 붙는 위치가 같은 엑손 안에 위치하지 않게 디자인을 해야 합니다. 그렇지 않으면 지노믹 DNA (genomic DNA, gDNA)가 오염된 샘플의 경우는 gDNA도 함께 검출되어서 올바른 결과를 얻을 수 없습니다. 이를 방지하기 위해 DNase I을 처리하고, 나아가 프라이머를 디자인할 때 엑손 정크션에 위치하도록 프라이머를 디자인하면 도움이 됩니다. 예를 들어, 프라이머가 엑손이 스킵핑이 일어나지 않는 연속된 두 개의 엑손이 걸치게끔 프라이머를 디자인합니다 [출처 2].
 

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그림 1. SYBR vs. TaqMan [출처 3].


mRNA 정량

mRNA 정량을 할 때는 total RNA를 Trizol을 이용해서 추출하고, SYBR를 사용해서 qPCR를 합니다. Negative 컨트롤로 No template control (NTC: 프라이머 다이머 (dimer) 생성 컨트롤), No Reverse-Transcriptase control (NRT: gDNA 오염 컨트롤)를 사용합니다. 20 μl Reaction에 cDNA (complementary DNA) template을 1:20으로 희석한 다음 1.5 μl (1-100 ng cDNA)를 사용합니다. cDNA를 1:20으로 희석해서 사용하는 이유는 qPCR에서 cDNA를 만들 때 사용된 다른 시약들의 영향을 줄이기 위해서입니다. qPCR를 마친 뒤 샘플을 젤에 로딩해서 예상되는 사이즈에 나오는지, 프라이머 다이머가 나오는지, 다른 예상 밖의 사이즈가 나오는지 확인하는 과정을 거칩니다. Housekeeping 유전자 (예를 들어, β-actin)를 사용합니다. 

microRNA 정량

Mature microRNA (miRNA) 경우에는 miRNeasy Micro Kit (Qiage)과 TaqMan miRNA assays (Life Technologies)를 이용해서 정량합니다. Internal 컨트롤 (예를 들어, Sno202)를 사용합니다. miR-107 (AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA)과 miR-103 (AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA)은 빨간색 한 부분만 차이가 나지만, TaqMan miRNA assays를 이용해서 miRNA-107과 miRNA-103를 구별해서 정량이 가능합니다.
 

Delta-delta Ct 방법

그림 2. Delta-delta Ct 방법. GOI: Gene of Interest, Ref: reference gene. A: Treated sample, B: Untreated sample.

 

qPCR 분석

qPCR를 실행하면 Ct 값을 얻게 되는데, 이 Ct 값은 DNA 양과 반비례합니다. 다시 말해, Ct 값이 작다는 의미는 처음 DNA양이 많아서 증폭을 적게 시켜도 타깃  DNA가 검출된다는 뜻입니다. qPCR를 분석을 할 때 Delta-delta Ct 방법을 사용합니다 [그림 2, 출처 4]. 다음 연재에서는 연재 7 (웨스턴 블랏)에 이어서 "면역 침강 (Immunoprecipitation)"에 대해 소개하겠습니다.

노트

  1. RNA에서 cDNA를 만들어서 PCR을 하는 방법을 Reverse-Transcription PCR 합니다. 이를 줄여서 RT-PCR이라고 합니다. 혼동을 줄이기 위해 이글에서는 Real-time PCR를 qPCR로 표기했습니다.
  2. SYBR은 DNA에 비특이적으로 끼어 들어가 형광을 냅니다. 따라서 SYBR 경우에는 타깃 product가 아니어도 형광을 낼 수 있습니다. 이에 반해 TaqMan probe은 Quencher를 이용하여, PCR 합성이 진행되면 형광을 냅니다.

출처

  1. https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
  2. https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=330976&Page=1
  3. https://www.smobio.com/faq-real-time-pcr
  4. https://toptipbio.com/delta-delta-ct-pcr/
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세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)

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