국내외 바이오 관련 동향 뉴스를 신속하게 제공합니다.
뉴스 생명과학
유전자 가위의 적용 한계 극복 실마리 찾아
Bio통신원(GIST)
국내 연구진이 단일분자 형광 이미징 기술을 이용해 차세대 유전자 교정 및 초고감도 유전자 검출 기술에 획기적으로 활용할 수 있는 새로운 유전자 가위 개발의 실마리를 찾아냈다.
지스트(광주과학기술원) 고등광기술연구소(APRI) 이상화 책임연구원 연구팀은 Cas12a 크리스퍼 유전자 가위가 단일 촉매 활성 부위만으로 이중 가닥의 DNA를 완전하게 절단하는 분자 기전을 규명했다고 밝혔다.
Cas12a 유전자 가위는 상대적으로 낮은 표적이탈효과(off-target effect), 무차별 단일 가닥 DNA 절단 활성 등과 같은 차별된 특성으로 인해 대표적 유전자 가위인 Cas9을 대신할 수 있는 매력적인 유전자 가위로 각광 받고 있다. 특히, Cas12a 유전자 가위의 무차별 단일 가닥 DNA 절단 활성은 최근 극미량의 특정 염기서열의 핵산을 검출하는 기술에도 활용되어 미국 FDA에 승인된 코로나바이러스감염증(COVID-19) 진단 키트 개발로도 이어져왔다.
하지만 이러한 장점에도 불구하고 Cas12a 유전자 가위는 Cas9과 달리 DNA 절단 활성을 정교하게 제어하는 기술이 부족해 최첨단 유전자 교정 기술인 염기교정 및 프라임교정에는 제대로 활용되지 못하고 있다.
본 연구팀은 3년 전 네이처 커뮤니케이션즈(Nature Communications)에 발표한 이전 연구에서 2개의 촉매 활성 부위로 이중가닥의 DNA를 독립적으로 각각 절단하는 Cas9 유전자 가위와 달리 Cas12a 유전자 가위는 단일 촉매 활성 부위를 통해 표적 DNA의 이중가닥을 순차적으로 절단한다는 사실을 밝혀낸 바 있다.
때문에 2개의 촉매 활성 부위 각각의 변이를 통해 DNA 절단 활성을 상대적으로 쉽게 제어할 수 있는 Cas9과 달리, 단일 촉매 활성 부위가 표적 DNA의 이중가닥을 순차적으로 절단하는 Cas12a 유전자 가위의 경우 같은 방식으로 DNA 절단 활성을 정교하게 제어하기 어렵다.
이러한 점에서 Cas12a 유전자 가위의 범용성을 높이기 위한 DNA 절단 활성을 정교하게 제어하는 기술을 확보하려면 Cas12a 유전자 가위의 단일 촉매 활성 부위에 의한 완전한 이중가닥 DNA 절단 반응의 핵심 과정과 조절 기전을 밝혀야 했다.
이에 연구팀은 Cas12a 유전자 가위가 단일 촉매 활성 부위로 첫 번째 DNA 가닥을 절단한 후 이중나선 DNA를 완전하게 절단하는 과정에서 일어나는 Cas12a 유전자 가위-DNA 복합체의 구조 변화를 실시간으로 관찰하기 위해서 단일분자 형광 이미징 기술(단일분자 형광 프렛)을 이용하였다.
이를 통해 단일 촉매 활성 부위로 이중나선 DNA 절단을 완성하기 위해서 Cas12a 유전자 가위-DNA 복합체가 두 번의 연속적인 구조 재배열을 한다는 것을 최초로 관찰하였다. 특히, 그 중 표적 DNA 절단에 필수적인 단계가 절단 부위의 국소 풀림이며 이 때 마그네슘 이온이 이 구조를 안정화시키는 결정적 역할을 하는 것을 밝혔다.
이러한 결과는 마그네슘 이온이 촉매 부위의 절단 활성에 기여한다는 기존 이해를 확장하여 마그네슘 이온이 크리스퍼 작동에 필수적인 구조 변화에도 영향을 미친다는 점을 처음으로 제시한 결과이다.
연구팀은 향후 본 연구에서 규명된 기전을 바탕으로 정교하게 DNA 절단 활성이 조절된 다양한 유전자 가위 발굴을 추진할 계획이다.
과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 바이오·의료기술개발사업 및 중견연구지원사업과 지스트 연구원(GRI) 등의 지원으로 수행된 이번 연구의 결과는 세계적인 학술지인 미국 국립과학원회보(PNAS)에 12월 1일 온라인 게재되었다.
논문의 주요 내용
1. 논문명, 저자정보
- 저널명 : Proceedings of the National Academy of Sciences, IF: 11.205
- 논문명 : Mg2+-dependent conformational rearrangements of CRISPR-Cas12a R-loop complex are mandatory for complete double-stranded DNA cleavage
- 저자 정보 : 이상화 책임연구원(지스트, 교신저자), 손혜진 박사후연구원(지스트, 공동 제1저자), 박재일 연구원(지스트, 공동 제1저자)
[그림] CRISPR/Cas12a 유전자 가위가 표적 DNA를 자르는 핵심 과정과 기대효과
Cas12a 유전자 가위의 표적 DNA 절단 핵심과정 설명: 1. Cas12a 유전자 가위가 이중 가닥인 표적 DNA를 인식하고 그 중 첫 번째 DNA 가닥을 절단한다. → 2. 이중 가닥으로 되어있는 DNA에서 두 번째 가닥의 절단 부위가 단일 가닥 형태로 국소적으로 풀린다. → 3. 두 번째 가닥의 절단 부위가 촉매 활성 부위에 결합한다. → 4. 절단된 표적 DNA가 분리된다.
기대효과: 유전자 교정 정확도 향상과 교정 범위 확장에 필요한 크리스퍼 유전자 가위 개량을 통하여 질병 진단 및 치료, 품종 개발, 약제 개발 및 선별 등 정교함을 요하는 다양한 유전자 교정 기술 적용 분야에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
주요내용 설명
<작성 : 지스트 고등광기술연구소 이상화 책임연구원 >
1. 연구의 필요성
○ 크리스퍼 Cas12a 유전자 가위는 상대적으로 낮은 표적이탈효과(off-target effect), 대체 PAM 부위 제공, 가이드 RNA를 직접 만들 수 있는 능력, 무차별 단일가닥 DNA 절단 활성 등과 같은 차별화된 특성 및 장점으로 인해 대표적 크리스퍼 유전자 가위인 Cas9을 대신할 수 있는 매력적인 유전자 가위로 각광 받아오고 있다.
※크리스퍼 유전자 가위: 박테리아의 면역시스템에서 유래한 시스템으로 게놈상의 특정 위치를 표적하게 도와주는 가이드 RNA와 표적 DNA를 절단하는 효소인 단백질로 이루어져있다. DNA를 절단하는 단백질에는 대표적으로 Cas9과 Cas12a가 있다.
※PAM (Protospacer Adjacent Motif): 대부분의 크리스퍼 유전자가위는 DNA 절단을 시작하기 위해서는 DNA의 한쪽 말단에 접근해야하며, 이 때 활용되는 짧은 특정 유전자 염기서열을 PAM이라고 한다.
○ 그 중에서도 Cas12a 유전자 가위만이 가지고 있는 가이드 RNA 자체 프로세싱 활성은 다중 유전자 교정 기술을 위한 최적의 플랫폼으로 이 유전자 가위가 활용될 수 있게 한다.
○ 또한, 이 유전자 가위의 무차별 단일 가닥 DNA 절단 활성은 최근 크게 발전한 크리스퍼 기반 바이오 센싱 기법(DETECTR)의 핵심 기술로 활용되고 있으며, 이 기술을 바탕으로 최근에는 미국 FDA에 승인된 코로나바이러스감염증(COVID-19) 진단키트도 개발되었다.
○ 하지만 이러한 여러 가지 장점에도 불구하고 2개의 촉매 활성 부위로 이중가닥의 DNA를 독립적으로 각각 절단하기 때문에 각각의 활성 부위의 변이를 통해 상대적으로 쉽게 DNA 절단 활성을 제어할 수 있는 Cas9과 달리, Cas12a 유전자 가위는 단일 촉매 활성 부위가 표적 DNA의 이중가닥을 순차적으로 절단하기 때문에 DNA 절단 활성을 정교하고 다양하게 제어하는 기술이 부족하다는 한계를 가지고 있다.
○ 이러한 이유로 Cas12a 유전자 가위는 최근 각광받고 있는 최첨단 유전자 교정 기술인 염기교정 및 프라임교정에는 제대로 활용되지 못하고 있다.
※염기 교정 및 프라임 교정(BASE EDITOR & PRIME EDITOR): 기존 유전자가위와 달리 DNA 이중나선을 절단하지 않고 특정 염기를 치환 및 삽입할 수 있는 유전자 가위이다.
○ 때문에 Cas12a 유전자 가위의 범용성을 높이기 위해서는 다양한 DNA 절단 활성 제어 기술들을 확보할 필요가 있으며, 이를 위해서는 Cas12a 유전자 가위의 단일 촉매 활성 부위에 의한 완전한 이중가닥 DNA 절단 반응의 핵심 과정과 조절 기전을 밝혀야 한다.
2. 연구내용
○ 본 연구에서는 Cas12a 유전자 가위가 단일 촉매 활성 부위로 첫 번째 DNA 가닥을 절단한 후 이중나선 DNA를 완전하게 절단하는 과정에서 일어나는 Cas12a 유전자 가위-DNA 복합체의 구조 변화를 실시간으로 관찰하기 위해서 단일분자 형광 이미징 기술(단일분자 형광 프렛)을 이용하였다.
※단일분자 형광 프렛 (Single-Molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer): 두 개의 형광분자 사이에 에너지가 전달되는 현상을 이용한 방법으로 살제 분자 하나의 움직임 및 구조 변화를 나노미터 수준에서 관찰할 수 있는 형광 이미징 기법이다.
○ 이를 통해 연구팀은 단일 촉매 활성 부위에 의해 첫 번째 DNA가닥이 잘린 이후에 동일한 촉매 활성 부위로 두 번째 DNA가닥 절단을 위해서 Cas12a 유전자 가위-DNA 복합체가 두 번의 연속적인 구조 재배열을 한다는 것을 최초로 관찰하였다.
○ 또한 연구팀은 이 유전자 가위가 이중나선 DNA 절단을 완성하는 2개의 연속적인 핵심 과정이 1) 두 번째 DNA 가닥 절단 추정 위치를 포함하고 있는 이중나선 DNA 영역의 국소적 풀림 단계와 그 이후 발생되는 두 번째 DNA 가닥의 촉매 활성 부위와의 결합 단계임을 최초로 규명해냈다.
○ 이어 본 연구팀은 이 2가지 핵심과정 중 두 번째 DNA가닥의 절단 추정 위치를 포함하고 있는 이중나선 DNA 영역의 국소적 풀림 구조가 이미 유전자 가위에 의한 DNA 절단에 핵심인자로 알려진 마그네슘 이온의 특정 부위 결합에 의해 안정된다는 사실을 최초로 밝혀냈다.
3. 연구성과/기대효과
○ 본 연구에서는 대표적인 크리스퍼 유전자 가위 단백질인 Cas9과 Cas12a 사이의 촉매 활성 부위 차이에서 기인한 두 유전자 가위의 기능 차이를 설명할 수 있는 Cas12a 유전자 가위의 DNA 절단 반응 조절 기전을 규명하였다.
○ 이렇게 규명된 Cas12a 유전자 가위의 DNA 이중나선 절단 반응의 조절 기전은 Cas12a의 DNA 절단 활성을 정교하게 제어할 수 있는 가이드 RNA 설계, Cas12a 단백질 개량 전략을 제시할 것이며, 이를 통해 유전자 교정 분야의 연구자들이 DNA 절단 활성이 조절된 다양한 유전자 가위를 발굴하는데 기여할 것으로 기대된다.
○ 이를 통해서 보다 정확하게 유전자를 검출 및 교정하여 오작동 및 부작용을 최소화한 질병 진단 및 치료 기술 개발에 기여할 것이다.
연구 이야기
<작성 : 지스트 고등광기술연구소 손혜진 박사후연구원>
□ 이번 성과, 무엇이 다른가?
향상된 기능을 가진 크리스퍼 유전자 가위 개발을 위해서 크리스퍼 유전자 가위의 작동 기전을 이해하는 것이 반드시 필요합니다.
본 연구는 크리스퍼 유전자 가위의 작동을 실시간으로 관찰할 수 있는 단일분자 형광 이미징 기술을 이용하여 기존 연구 방법으로 규명이 어려웠던 크리스퍼 유전자 가위의 이중가닥 절단 세부 과정을 관찰할 수 있었습니다.
특히 표적 DNA 절단에 필수적인 단계가 절단 부위의 국소 풀림이며 이 때 마그네슘 이온이 결정적인 역할을 하는 것을 밝혔습니다. 이는 마그네슘 이온이 촉매 부위의 절단 활성에 기여한다는 기존 이해를 확장하여 마그네슘 이온이 크리스퍼 작동에 필수적인 구조 변화에도 영향을 미친다는 점을 처음으로 규명했습니다.
□ 실용화된다면 어떻게 활용될 수 있나? 실용화를 위한 과제는?
본 연구 성과는 크리스퍼 유전자 가위 개량을 위한 실마리를 제공하여 정교함을 요하는 질병 진단 및 치료에 기여할 수 있습니다.
크리스퍼 유전자 가위에 의한 이중 가닥 절단은 목표하는 유전자 교정 외에도 원치 않는 곳의 유전 정보도 바꿀 가능성이 높습니다. 이 때문에 단일 가닥 절단만 가능한 크리스퍼 유전자 가위를 개발하여 정교한 유전자 교정 기술에 적용하는 노력이 진행 중입니다.
본 연구에서 규명한 이중 가닥 절단 과정 중 이중 가닥의 국소적 풀림 또는 촉매 부위 결합을 저해하는 유전자 가위를 발굴한다면 단일 가닥 절단이 가능한 크리스퍼 유전자 가위를 얻을 수 있습니다.
개량한 유전자 가위를 활용하여 보다 정확하게 유전자를 교정하여 오작동 및 부작용을 최소화한 질병 진단 및 치료 기술을 개발할 수 있을 것입니다.
□ 꼭 이루고 싶은 목표나 후속 연구계획은?
크리스퍼 유전자 가위를 이용한 유전자 교정은 이전 세대 유전자 교정 기술보다 비교적 간단하고 저렴합니다. 그러므로 크리스퍼 유전자 가위 유전자 교정 기술을 적용한 질병 치료법은 다양한 유전 질병에 대해 적용이 가능할 뿐만 아니라 유전 질병을 가진 보다 많은 사람들에게 치료의 기회를 열어줍니다.
이를 위해 반드시 정확하게 유전자 교정이 가능한 크리스퍼 유전자 가위 개발이 필요합니다. 본 연구실은 기전 이해를 바탕으로 하여 정확도가 높은 크리스퍼 유전자 가위 발굴을 목표로 하고 있습니다. 크리스퍼 유전자 가위의 작동 원리를 세밀하게 이해하고 각 작동 단계에서 중요한 인자들을 밝혀냄으로써 크리스퍼 유전자 가위를 정교하게 개량할 수 있을 것으로 기대합니다.
앞으로 본 연구팀이 규명한 기전을 바탕으로 Cas12a 크리스퍼 유전자 가위 개량을 진행함과 동시에 다른 크리스퍼 유전자 가위의 기전 연구를 꾸준히 수행할 계획입니다.
본 기사는 네티즌에 의해 작성되었거나 기관에서 작성된 보도자료로, BRIC의 입장이 아님을 밝힙니다. 또한 내용 중 개인에게 중요하다고 생각되는 부분은 사실확인을 꼭 하시기 바랍니다.
[기사 오류 신고하기]